用于检测水稻抗褐飞虱Bph14基因的SNP分子标记及应用的制作方法

文档序号:13978305阅读:324来源:国知局
用于检测水稻抗褐飞虱Bph14基因的SNP分子标记及应用的制作方法
本发明涉及分子生物学
技术领域
,具体涉及水稻抗褐飞虱基因bph14的snp分子标记以及检测该分子标记的方法。
背景技术
:水稻是我国的重要粮食作物。褐飞虱是一种水稻单食性害虫,通过口针吸食韧皮部汁液为害稻株,造成水稻生长缓慢、分蘖延迟、空瘪粒增加。褐飞虱还是草状丛矮病毒和齿叶矮缩病毒等一些水稻病毒的传播媒介,严重影响水稻的生产和安全。目前,对褐飞虱的防治主要依赖于化学防治,不但增加了生产成本和害虫的耐药性,而且污染环境,因此,利用寄主抗性培育抗褐飞虱品种被认为是防治其危害的有效途径。到目前为止,已经鉴定和报道了至少34个抗褐飞虱基因位点,其中显性基因19个,隐性基因15个,已经定位的主效抗褐飞虱基因达28个,有4个抗性基因被克隆,分别是bph3(liuetal.2014)、bph14(duetal.2009)、bph9(zhaoetal.2016)和bph26(jietal.2016)。huang等从带有药用野生稻背景的基因渗入系b5中鉴定了两个新的显性抗性基因,并运用rflp技术,采用集团分离分析法将其中一个命名为bph14(原名qbp1)的基因定位于第3染色体的g1318和r1925之间,2个分子标记相距3.2cm。bph14是水稻中第一个被克隆的抗虫基因,cdna全长9576bp,包含有3个外显子,编码一个由1323个氨基酸组成的蛋白产物,产物为典型的cc-nb-lrr抗病蛋白结构。该基因同时抗生物型ⅰ、ⅱ、ⅲ,而没有携带bph14的水稻品种台中1号则对褐飞虱敏感,褐飞虱接虫后表现为茎秆枯黄,叶片萎蔫,育性降低甚至整株死亡。王慧,2016;国家水稻数据中心)。由于抗虫表型鉴定过程繁琐复杂,限制了水稻抗褐飞虱品种的育种效率,且利用常规育种手段往往难以有效地聚合不同的抗虫基因。开发与抗虫基因紧密连锁或共分离的分子标记,利用分子标记辅助选择(marker-assistedselection,mas)技术聚合一个或多个目的基因或qtl,从而选育持久抗性品种,延缓抗虫品种的退化年限和防止褐飞虱新生物型的发生。传统的水稻抗虫育种是通过抗性鉴定对植株进行表型选择,耗费时间长,且易受环境条件的限制,鉴定结果容易造成误差,选择效率较低。利用分子标记辅助选择育种简单有效,可以降低育种成本,缩短选育周期,亦可进行有目的的多基因聚合,提高育种效率,带来巨大的社会经济效益。文献报道中主要利用的标记类型为ssr和indel标记,在育种中存在多态率较低,差异较小的缺点。检测过程中使用的eb或聚炳烯酰胺易对环境造成污染、对人体产生危害。开发与抗褐飞虱基因bph14共分离的特异性分子标记及建立高效、环境友好的相关检测体系,则对促进bph14基因在商业化育种中的应用具有重要意义。基于kasp的基因分型方法是通过计算机记录并分析pcr过程中产生的荧光信号,实现对突变位点监测。检测结果与表现型一致性高;检测过程无需电泳,彻底杜绝了pcr产物的气溶胶污染和eb对环境的污染、甲醛对人体的危害。技术实现要素:本发明的目的是提供一种用于检测水稻抗褐飞虱基因bph14的snp分子标记及应用。为了实现本发明目的,本发明的技术方案如下:根据基因的信息,抗褐飞虱基因bph14基因位于水稻3号染色体35693286-35699010区间,以基因区间为中心向两侧各扩大50kb提取snp位点,并根据pic值及snp位点周边50bp是否有其他snp位点等进行挑选。同时,根据已经克隆的bph14基因序列与日本晴序列进行比对,挑选出的snp位点,利用batchprimer3对其进行引物设计。针对这些snp标记,对含有bph14基因供体材料b5、华2211和其它不含bph14的多个水稻品种进行kasp反应验证,挑选出能特异性区分抗性供体材料及扩增效果好的snp标记k_030513。通过95份自然群体材料对所挑选的抗性基因连锁snp标记k_030513进行自然群体验证,表明抗性碱基为稀有碱基。利用79株的ril群体进行了遗传位置验证和表型验证。本发明提供了一种检测水稻抗褐飞虱基因bph14的snp分子标记k_030513,检测碱基位于水稻第3号染色第35692898位(msu7.0基因组版本),该位点位于bph14基因区间上游388bp处,该snp分子标记多态性为c/g。本发明的上述snp分子标记为以下特异性引物组合,(1)两条特异性引物:primerx:5’-attgcagcgttatcgggag-3’;primery:5’-attgcagcgttatcgggac-3’;(2)一条通用引物:primerc:5’-tgcagaggatacttgtgattg-3’。本发明提供了用于检测上述snp分子标记的特异性引物组合,包括:(1)两条特异性引物:primerx:5’-attgcagcgttatcgggag-3’;primery:5’-attgcagcgttatcgggac-3’;(2)一条通用引物:primerc:5’-tgcagaggatacttgtgattg-3’。含有上述特异性引物组合的试剂或试剂盒属于本发明的保护范围。本发明提供了上述特异性引物组合在检测水稻抗褐飞虱基因bph14中的应用。所述的应用,进一步包括以下步骤:(1)提取待测水稻基因组dna;(2)以水稻基因组dna为模板,利用上述特异性引物组合进行kasp反应检测(3)若只检测到引物primery对应的碱基c,则判定待测水稻不含bph14基因;若只检测到引物primerx所对应的碱基g,则判定待测水稻含有纯合的bph14基因;若同时检测到碱基c和g,则判断待测水稻含有杂合的bph14基因。步骤(2)中kasp检测中pcr条件为:94℃15min;94℃20sec,65-57℃1min,每个循环退火温度降低0.8℃,共10个循环;94℃20sec,57℃1min,共26个循环。本发明提供了检测水稻抗褐飞虱bph14基因型的方法。本发明提供了检测snp分子标记k_030513的方法。本发明提供了snp分子标记k_030513在辅助鉴定水稻bph14基因中的应用。本发明提供了snp分子标记k_030513或上述特异性引物组合或含有该特异性引物组合的试剂盒在水稻种质资源改良中的应用。本发明提供了snp分子标记k_030513或上述特异性引物组合或含有该特异性引物组合的试剂盒在培育具有抗褐飞虱能力水稻中的应用。本发明利用基于kasp反应原理及抗感材料的单碱基差异设计的标记能高通量的对水稻材料进行bph14抗性基因检测,每个标记由三条引物组成,实施例中两条特异性引物分别连接kasp反应试剂对应的荧光接头序列,一条通用引物。若只检测到引物primery对应的碱基c,则判定待测水稻不含bph14基因;若只检测到引物primerx所对应的碱基g,则判定待测水稻含有纯合的bph14基因;若同时检测到碱基c和g,则判断待测水稻含有杂合的bph14基因。通过两种不同荧光信号检测,实现对每个检测样品的snp位点的基因型判定,能够克服现有的形态学鉴定方法检测周期长、需要丰富经验和pcr、rapd、pcr-rflp、southern杂交等检测方法操作复杂或检测灵敏度不高、或特异性不强、或重复性不好等缺点,彻底杜绝了pcr产物的气溶胶污染和eb对环境的污染、甲醛对人体的危害,具有简便、可靠、快速、特异性强、灵敏度高、环境友好的显著优点。本发明提供的snp分子标记的应用方法准确可靠,操作简便,适用于bph14基因的鉴定及辅助选择育种。附图说明图1为本申请snp分子标记k_030513的开发流程图。图2为本申请snp分子标记k_030513在自然群体分型结果。图3为本申请snp分子标记k_030513的遗传位置验证。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的,并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下,可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。实施例1水稻bph14基因的snp分子标记的开发根据基因的定位信息,抗褐飞虱基因bph14基因区间位于水稻3号染色体35693286-35699010区间(msu7.0)。以基因区间为中心向两侧各扩大50kb提取snp位点,并根据pic值及snp位点周边50bp是否有其他snp位点等进行挑选。同时,根据已经克隆的bph14基因序列与日本晴序列进行比对,挑选出的snp位点,利用batchprimer3对其进行引物设计。针对这些snp标记,对含有bph14基因供体材料rh、ir56和其它不含bph14的18个水稻品种进行kasp反应验证,挑选出与抗性供体材料共分离及扩增效果好的snp标记k_030513。上述snp标记开发流程图见图1。本发明涉及的用于检测上述snp分子标记的引物组合为:(1)两条特异性引物:primerx:5’-attgcagcgttatcgggag-3’;primery:5’-attgcagcgttatcgggac-3’;(2)一条通用引物:primerc:5’-tgcagaggatacttgtgattg-3’。两条特异性引物5’端分别连接lgc公司kasp反应试剂特定的fam和hex荧光接头序列。引物委托invitrogen公司合成。表1标记k_030513引物信息idmsu7.0位置等位碱基型x等位碱基型y有利碱基型k_030513chr03.35692898gcg对待测水稻材料基因组dna进行kasp反应。kasp反应测试在lgcsnpline基因分型平台上进行。在微孔反应板中加入20ngdna样品,烘干后加入kasp反应混合液,反应体系见表2。pcr扩增在水浴热循环仪中完成,touchdownpcr反应条件为:94℃预变性15分钟;第一步扩增反应,94℃变性20秒,65℃~57℃退火并延伸60秒,10个循环,每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃;第二步扩增反应,94℃变性20秒,57℃退火并延伸60秒,26个循环。反应完成后利用扫描仪pherastar对kasp反应产物进行荧光数据读取,荧光扫描的结果会自动转化成图形。本发明中使用的lgcsnpline基因分型平台与其配套试剂耗材均购于英国lgc公司。表2kasp检测的反应体系终浓度体积(ul)100umprimerc0.42um0.0125100umprimerx0.17um0.0050100umprimery0.17um0.00502×kaspmastermix1×1.4792超纯水1.4983总体积3用标记k_030513对含有bph14基因的水稻品种b5、华2211、华恢1337和其它不含bph14的32个水稻品种进行kasp反应验证,结果如表3。含bph14基因的水稻品种在k_030513测试位点检测到碱基g,除了一份材料无扩增,其他31份不含bph14水稻品种无论是其他抗褐飞虱基因供体还是感病材料均在测试位点均检测出碱基c。表3标记k_030513初筛分型数据实施例2水稻bph14基因的snp分子标记的应用针对本发明所述的分子标记设计利用kasp反应可高通量的对水稻材料进行抗褐飞虱bph14基因检测,采用实施例1设计的引物组合。利用95份材料对snp标记k_030513进行自然群体验证。95份材料中包括感虫对照材料、常见杂交稻和核心水稻育种材料。标记在自然群体分型结果如图2所示,除了协优716检测出杂合bph14基因型外,其他感虫对照材料、常见杂交稻和核心水稻育种材料均检测为无褐飞虱抗性纯合bph14基因型。可见,snp标记k_030513检测bph14基因位点为高特异性的抗性位点,可便捷高效的用于鉴定水稻品种中是否含有bph14基因。实施例3snp标记的遗传位置及分离群体表型验证1、标记遗传位置验证利用79株bph14的ril群体和11个在父母本中具有多态性的snp标记以及本发明中实施例1开发得到的bph14特异性标记k_030513进行遗传位置验证,本发明的标记k_030513被定位到水稻第3号染色体79.2cm位置(见图3)。2、标记表型验证利用b5和mh63的ril群体对本发明中与基因bph14连锁标记k_030513进行遗传表型验证。表型鉴定委托武汉禾泰青生物科技有限公司,含bph14的12个株系中83.3%表型为中抗以上抗虫水平,不含bph14的12个株系中83.3%表型为感虫表型(表4),表型数据与基因型对应较好,再次验证了本发明的可行性和准确性。可用于bph14基因的鉴定及辅助选择育种。表4序列表<110>华智水稻生物技术有限公司<120>用于检测水稻抗褐飞虱bph14基因的snp分子标记及应用<130>khp171115428.0<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1attgcagcgttatcgggag19<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2attgcagcgttatcgggac19<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tgcagaggatacttgtgattg21当前第1页12
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