本发明涉及一种酶活和稳定性提高的2,3-丁二醇脱氢酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。
技术背景
乙偶姻在食品调香、生化及药理方面有着广泛的应用价值，目前国内外对其合成和生产都有着比较深入的研究。自然界中的某些细菌具有生产乙偶姻的能力，主要包括克雷伯氏菌属(klebisella)、肠杆菌属(enterobacter)、芽孢杆菌属(bacillus)、沙雷氏菌属(serratia)以及乳球菌属(lactococcus)等。但是在大多数菌株代谢过程中，乙偶姻是作为2，3-丁二醇和丁二酮代谢的副产物而存在的，积累浓度较低，从而直接导致了难以利用这些微生物菌种工业化发酵生产乙偶姻。
本实验室保藏有一株以葡萄糖为底物高产乙偶姻的枯草芽孢杆菌b.subtilisjna(保藏号cctccm209309)，在研究中发现枯草芽孢杆菌发酵过程中乙偶姻和2,3-丁二醇相互转化的现象，这一相互转化过程受到乙偶姻还原酶的代谢调节。乙偶姻还原酶，又称2,3-丁二醇脱氢酶(简称bdh，e.c.1.1.1.4)。隶属于氧化还原酶，能够在nadh存在的情况下催化乙偶姻生成2,3-丁二醇，同时在nad+存在的情况下催化2,3-丁二醇可逆形成乙偶姻。在这种情况下，提高bdh的活力，同时对辅因子进行控制对于进一步提高目的产物产量来说非常关键。通过辅因子再生技术生物转化合成产物，不仅可以降低合成的费用，驱动反应完成的同时也可简化产品的分离，具有重要意义。
技术实现要素：
未解决上述问题，本发明提供了一种酶活力提高的bdh突变体及其构建方法。
本发明的第一个目的是提供一种酶活力提高的bdh突变体，其氨基酸序列是seqidno.1所示的序列。
所述突变体的氨基酸序列是在氨基酸序列如seqidno.2所示的氨基酸的基础上，将52位氨基酸由脯氨酸突变成赖氨酸得到的。
本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，编码所述突变体的核苷酸序列是seqidno.3所示的序列。
在本发明的一种实施方式中，所述核苷酸序列是在seqidno.4所示核苷酸序列的基础上，将编码第52位的脯氨酸的密码子突变成编码赖氨酸的密码子而得到的。
本发明的第三个目的是提供含有编码所述突变体的核苷酸序列的重组表达载体。
本发明的第四个目的是提供一种表达所述bdh突变体的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是将seqidno.3所示的核苷酸序列连接到表达载体得到重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主菌，即得到基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌为重组枯草芽孢杆菌基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体是pma5。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主菌为b.subtilis168。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的制备方法，是在seqidno.4所示核苷酸序列的基础上，将编码第52位的脯氨酸的密码子突变成了编码赖氨酸的密码子，得到重组基因，将重组基因连接到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到b.subtilis168宿主菌中即得到重组基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述的制备方法，具体是：
(1)以seqidno.4所示核苷酸序列为模板，flprimer(序列如seqidno.5所示)，rlprimer(序列如seqidno.6所示)为引物，进行pcr即得到seqidno.3所示的重组基因bdha2。
(2)将上一步得到的重组基因序列，连接到pma5表达载体中，得到重组质粒pma5-bdha2，重组质粒化转化b.subtilis168，获得重组工程菌株，命名为b.subtilis168/pma5-bdha2。
本发明的第五个目的是提供所述突变体、编码所述突变体的核苷酸序列、含有编码所述突变体的核苷酸序列的载体、表达所述突变体的基因工程菌的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用，包括bdh突变体与相应的nadh氧化酶组合构建辅酶nadh循环体系，用于转化2,3-丁二醇生产乙偶姻。
在本发明的一种实施方式中，所述应用，bdh突变体可用于构建辅酶nadh循环体系。
本发明的有益效果：
(1)本发明在天然bdh基础上，通过定点突变改造bdh分子结构，本发明的突变体酶比活力提高了68％。本发明表明bdh第52位氨基酸残基突变成赖氨酸可以提高该酶的催化效率。
(2)本发明所得的bdh突变体酶可以与相应的nadh氧化酶组合构建nadh辅酶循环体系应用于乙偶姻的生产，bdh突变体酶也可以应用于辅酶nadh再生体系的构建。
具体实施方式
lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母浸出物5g/l，nacl10g/l。
bdh酶活力定义：酶活力单位(iu)定义为在25℃条件下，每分钟还原1μmol的nad+所需的酶量为一个酶活单位u。酶比活力定义为单位蛋白的酶活u/mg。
bdh活力测定方法：酶反应体系为1ml，含有0.1m2，3-丁二醇，50mm磷酸钠缓冲液ph8.0，5mmnad+；酶促反应在加入一定量的酶液后立即开始，根据反应液在340nm吸光值变化，计算出nadh的浓度，并计算出酶活力。
实施例1含bdh突变体的枯草芽孢杆菌表达载体的构建
(1)bdh突变体的获得：以seqidno.3所示核苷酸序列为模板，fprimer(序列如seqidno.5所示)和rprimer(序列如seqidno.6所示)为引物，进行pcr即得到seqidno.3所示的重组基因。
(2)将重组基因与枯草芽孢杆菌表达载体pma5分别用bamhi、mlui双酶切，纯化后用t4dna连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化b.subtilis168感受态细胞。转化液涂布含卡那霉素(50mg/l)lb平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为pma5-bdha2。测序工作由上海生工完成。
实施例2产bdh突变体重组枯草芽孢杆菌工程菌构建
将实施例1得到的含正确重组质粒pma5-bdha2的菌株即为本发明的重组基因工程菌b.subtilis168/pma5-bdha2。
实施例3重组菌b.subtilis168/pma5-bdha2表达bdh及酶活测定
将实施例2构建的重组菌b.subtilis168/pma5-bdha2与表达未突变的野生bdh(氨基酸序列如seqidno:2所示)的对照菌株b.subtilis168/pma5-bdha分别接种于l0ml含卡那霉素的lb培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按4％的接种量转接于发酵培养基中，37℃培养24小时。离心收集细胞并破碎，细胞破碎上清液(粗酶液)用于酶活力的测定。将得到的粗酶液经纯化后得到bdh突变体，其比酶活较突变前提高了68％。
实施例4重组bdh突变体转化2,3-丁二醇生产乙偶姻应用
将实施例3获得的重组菌b.subtilis168/pma5-bdha2细胞破碎液应用于转化2,3-丁二醇生产乙偶姻，在添加nad+循环再生酶或充足nad+的情况下，2h内可转化40g/l的2,3-丁二醇生成37.8g/l乙偶姻；通过补料流加2,3-丁二醇，30h内可将120g/l的2,3-丁二醇转化约为98.5g/l乙偶姻
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110>江南大学
<120>一种酶活提高的2,3-丁二醇脱氢酶突变体及其构建方法
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