一种结合α亚基的F1F0-ATP合成酶RNA抑制剂及应用的制作方法

本发明涉及一种抗f1f0-atp合成酶活性药物，具体是通过结合f1f0-atp合成酶α亚基从而抑制atp合成酶活性的rna抑制剂。

背景技术：

f1f0-atp合成酶是一个含多亚基的跨膜蛋白复合物。f1位于细胞质中，包含3α、3β、ε、γ和δ亚基。f1f0-atp合成酶能合成及水解atp(三磷酸腺苷)，调节生物体能量供给。atp的异常表达是多种疾病发生的基础，如atp的异常表达与眼底血管异常增生、心肌缺血、肿瘤的恶性程度、侵袭性和不良预后密切相关；肿瘤细胞的转移及增生需要更多的atp，因此，通过抑制细胞内atp水平可以选择性杀死肿瘤细胞及抑制肿瘤血管的生成。f1f0-atp合成酶是线粒体中合成atp的关键酶，抑制该合成酶能够抑制atp的过量异常表达。心肌细胞中，f1f0-atp合成酶对atp的过量消耗导致严重心肌缺血的发生，降低f1f0-atp合成酶活性能调节心肌缺血的发生。

f1f0-atp合成酶抑制剂可用于肿瘤的治疗。研究发现，药物耐受性肿瘤细胞在atp耗尽的情况下化疗敏感性升高，而药物敏感性肿瘤细胞在外源atp补给的情况下化疗耐药性升高。因此破坏肿瘤细胞的atp代谢对于肿瘤治疗具有非常重要的作用。

肿瘤分子靶向治疗将比目前的化疗更为有效、副作用更小，是非常有希望的一种肿瘤治疗方法。如表皮生长因子受体酪氨酸激酶(egfr－tk)抑制剂吉非替尼主要治疗肺癌，利妥昔单抗主要用于治疗非霍奇金淋巴瘤，曲妥珠单抗是信号转导抑制剂，用于治疗乳腺癌。治疗慢性粒细胞性白血病和胃肠道基质细胞瘤的是甲磺酸伊马替尼。但是随着靶向治疗的临床应用，越来越多的患者也出现了耐药，靶向治疗药物的临床效果并不令人满意。因此放化疗以及靶向治疗的患者，如果联合应用atp抑制剂，能够产生最有效治疗效果，如glut-1(葡萄糖转运蛋白1)抑制剂，包括不可逆抑制剂wzb117和phloretin根皮素、diclofenac(双氯芬酸)、apigegnin、fasentin、stf-31、以及临床获批药物ritonavir(利托那韦)。wzb117和phloretin是glut1的不可逆性抑制剂，可以显著降低葡萄糖的摄入量和细胞内的atp水平，从而抑制糖酵解和细胞生长。补给外源性atp可以缓解肿瘤细胞的wzb117诱导性细胞毒性，这表明wzb117等glut抑制剂通过降低细胞内atp水平抑制肿瘤细胞生长。

f1f0-atp合成酶抑制剂还可用于结核、自身免疫缺陷、心肌缺血等多种疾病，而且在农药中也有所应用。如抗结核类atp合酶抑制剂二芳基喹啉类抗结合药物tmc207，该化合物作用与atp合酶c亚基，能快速有效地杀死结核杆菌；抗自身免疫性疾病atp合成酶抑制剂bz-423，用于治疗i型红斑狼疮免疫性疾病；抗肿瘤合成酶抑制剂，如多烯α-吡喃酮类；还有一种atp抑制剂以抑制glut1为主，不同细胞具有多种glut异构体，行使相同或不同功能，比如单糖运输、己糖运输、双向运输等；且每种细胞上分布着多种类型的glut，这就使得即使glut1的功能被抑制后，其他glut将代偿其功能。以glut3为例，它主要分布在神经元和胎盘组织，当脑瘤患者神经元上的glut1被抑制后，仍然可以依赖glut3摄取葡萄糖，因此癌细胞还能继续生长。同时，glut1还容易被诱导，即葡萄糖水平低，它就高表达，葡萄糖水平高，它就低表达，这就使得glut1抑制剂的活性很难抑制或易诱发耐(抗)药性。glut1抑制剂长期应用，使脑组织长期缺乏能量供给，脑发育出现障碍。以上这些atp合成酶抑制剂均为化学合成物，具有细胞毒性大及特异性不高等缺点。

技术实现要素：

本发明的目的是克服上述背景技术的不足，提供一种结合α亚基的f1f0-atp合成酶rna抑制剂，该抑制剂通过结合f1f0-atp合成酶α亚基，使α亚基从线粒体膜释放入胞浆，导致f1f0-atp合成酶解聚，从而降低atp合成酶活性，抑制细胞内atp合成，具有抑制效率高、合成方便、成本低等特点。

本发明提供的技术方案是：一种f1f0-atp合成酶rna抑制剂(命名为dsrna-184-u)，其特征在于该抑制剂的序列如下：

5’-uggauggagaacugauaagggu-3’。

该抑制剂的互补序列为：5’-acccuuaucaguucuccaucca-3’。

制备方法如下：

1)合成单链：

通过abi394rna自动合成仪，获得f1f0-atp合成酶rna抑制剂序列如下：5’-uggauggagaacugauaagggu-3’，以及互补序列

5’-acccuuaucaguucuccaucca-3’，并分别进行纯化分离；

2)合成双链：

在每个相同摩尔数的单链rna样品中加入相同量的depc水，然后1比1比例加入退火缓冲液中，90℃变性1分钟后，自然降温至室温，得到的产物即为所需双链rna。

所述步骤1)合成单链包括：

a、脱保护基；

b、活化；

c、亲核反应；

d、除去保护基团；

e、纯化分离；

f、离心干燥、冻存。

所述的f1f0-atp合成酶rna抑制剂，应用于atp异常高表达的疾病，如血管增生性疾病及肿瘤治疗。

本发明的有益效果是：

本发明合成的小片段rna序列(命名为dsrna-184-u)，能结合细胞内f1f0-atp合成酶α亚基(atp5a)，使f1f0-atp合成酶的α亚基从胞膜释放到胞浆，导致f1f0-atp合成酶解聚，从而抑制细胞内atp合成，具有专一性强，抑制效率高的特点；可用于治疗多种疾病，如眼底血管增生、结核、自身免疫缺陷、肿瘤、心肌缺血等多种疾病，而且在农药中也可以应用；并且该rna序列片段小，只有22个核苷酸序列，制作工艺简单。由于rna作为一种存在于生物细胞中的遗传信息载体，是细胞本来就具有的一种生物大分子，因此本发明合成的rna作为药物具有副作用小，合成方便，成本低等特点。

附图说明

图1是rna双链的2.0％page胶跑电泳图。

图2是dsrna-184-u处理组，线粒体膜中f1f0-atp合成酶的α亚基向胞浆释放的示意图，lip处理组为转染试剂对照组。

图3是dsrna-184-u处理组与lip处理组细胞中f1f0-atp合成酶含量对比图。

具体实施方式

以下结合附图所示的实施例进一步说明。

一种f1f0-atp合成酶α亚基的rna抑制剂，该抑制剂的序列为：

5‘-uggauggagaacugauaagggu-3‘；

互补序列为：5’-acccuuaucaguucuccaucca-3’。

该抑制剂的制备方法如下：

4、合成单链：

应用abi394rna自动合成仪合成rna序列，固相合成单链rna：首先将要合成的rna序列5’-uggauggagaacugauaagggu-3’输入合成仪，rna化学合成时由3’端向5’进行。按以下步骤合成：

1)脱保护基；用三氯乙酸脱去预先连接在cpg上的核苷酸的保护基团dmt(二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5’-羟基端；

2)活化；将质子化的核苷3’-亚磷酰胺单体与四氮唑活化剂混合进入合成柱，形成亚磷酸酰胺四唑活性中间体(其5’端仍受dmt保护，3’端被活化)；

3)将步骤2)中活化得到的亚磷酸酰胺四唑活性中间体与步骤1)中脱保护基后的核苷酸混合，使亚磷酸酰胺四唑活性中间体与核苷酸的5’-羟基发生亲核反应，缩合并且脱去四唑，此时合成的寡糖核苷酸链向前延长一个碱基；

氧化缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酸酯键与连接在cpg上的寡糖核苷连接，而亚磷酸酯键不稳定、易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酸酰胺转化为磷酸三脂，得到稳定的寡糖核苷酸。

经过上述几个步骤后，一个rna核苷酸就被连接到cpg的核苷酸上；以上步骤均在rna合成仪的合成模块中自动完成，一次加一个碱基到载体结合核苷酸上。

4)反复上述步骤，即可得到5’-uggauggagaacugauaagggu-3’片段样品。此时，将rna合成柱切换到切除模块，将氢氧化铵溶液加入到柱内，从载体上切除寡核苷酸，将氢氧化铵溶液中的rna转移到脱保护模块，然后将含核苷酸的溶液在65℃加热1小时，去掉保护基团。

rna纯化分离利用hplc(高压液相色谱)方法对得到的粗品进行纯化分离，收集所需的rna溶液分子并进行浓度测定。

同样方法合成互补序列：5’-acccuuaucaguucuccaucca-3’，经hplc纯化。

合成rna样品保存方式：将液体rna样品在减压离心机上37℃，12000rpm离心干燥，制成干粉-20℃冻存6个月。

2、合成双链：

在每1od单链rna样品中加入250μldepc水，配置成20μm储存溶液。各取200μm合成的序列，加入20μl退火缓冲液(100mm醋酸钾,30mmhepes-koh,2mm乙酸镁)中，depc水补到100μl，90℃变性1分钟后，自然降温至室温，得到的产物即为所需双链rna。

将合成的rna双链加样到2.0％的page胶跑电泳鉴定纯度，跑胶的电泳图如图1所示。

本发明对f1f0-atp合成酶α亚基rna抑制剂的相关研究结果如下：

一、对晶状体上皮细胞atp下降表达的影响

1、实验细胞：以晶状体上皮细胞为细胞模型，国外atcc公司购买。

2、实验药品：由rna化学合成仪合成的包括如下rna互补序列的药品：

5’-uggauggagaacugauaagggu-3’

与5’-acccuuaucaguucuccaucca-3’。

3、实验方法：

1)rna-184-u复合物对atp表达的抑制作用

正常培养晶状体上皮细胞接种于96孔板，接种密度2×10⁴个细胞每100μl培养基，0.108μl20μmdsrna-184-u剂与0.144μlrnaimax用20μl细胞培养基中混合后，加入培养的晶状体上皮细胞中，dsrna-184-u终浓度为30nm。同时0.144μlrnaimax直接用20μl细胞培养基混合，加入晶状体上皮细胞中，作为对照组。继续培养0，12，24，48，72小时后，进行atp合成量的检测。实验同时进行三组，计算平均值。

2)、统计学处理：实验数据用均值±标准差表示，全部实验数据采用spss12.0软件进行处理。

3)rnapull-down(rna下拉)及蛋白质质谱技术检测dsrna-184-u与atp5a的结合作用

rna3端desthiobiotinylation标记及磁珠rna蛋白结合试剂盒购自pierce公司。50pmolrna混合1nmol生物素标记胞苷二磷酸，40ut4rna连接酶、40urnase抑制剂和15％聚乙二醇在rna连接酶反应缓冲液，16℃过夜。未标记的rna和rna连接酶通过乙醇沉淀除去。3-desthiobiotinylated单链rna与非标记的互补单链退火。之后，50pmol的单链或双链rna双链复合物与链亲和素磁珠50μl温和搅拌30分钟。rna-磁珠的复合物生成后，与细胞裂解液4℃混合60分钟，然后放入磁珠收集管收集的结合的磁珠最后，用50微升洗脱液洗脱rna蛋白结合物，洗脱的蛋白复合物送苏州prottech公司进行蛋白质质谱，测得蛋白序列。

4)westernblot(免疫印迹试验)技术验证atp5a在线粒体膜及胞浆的表达

rna(dsrna-184-u)药物(终浓度30nm)及rnaimax(mock对照组)处理细胞，48小时后，分别提取细胞膜及胞浆蛋白，利用atp5a抗体进行westernblot试验。

5)atp合成酶活性检测

正常培养晶状体上皮细胞接种于6孔板，转染dsrna-184-u入晶体细胞，终浓度为30nm。同时rnaimax直接与细胞培养基混合，加入晶状体上皮细胞中，作为对照组。继续培养24及48小时后，进行atp合成酶活性检测。实验同时进行三组，计算平均值。

4、实验结果：

1)atp下降表达实验结果见下表。

dsrna-184-u处理细胞不同时间点atp值

表1

^**与对照组相比，p<0.01；

由表1可见，与对照组相比，dsrna-184-u在72小时能非常显著地降低细胞atp表达(p<0.01)；

2)通过rna-pulldown及蛋白质谱技术发现dsrna-184-u下拉的蛋白抽提物中含有atp5a蛋白肽段；这些atp5a蛋白肽段的序列如下表所示：

表2

3)rna药物促使线粒体膜中f1f0-atp合成酶的α亚基向胞浆释放

wb(westernblot)结果显示(参见图2)：rna药物处理组胞浆有atp5a表达，而对照的lip处理组胞浆没有atp5a表达；由此可见，rna药物处理会促使f1f0-atp合成酶的α亚基向胞浆释放。

4)dsrna-184-u药物降低细胞f1f0-atp酶活性

f1f0-atp合成酶活性检测实验发现，dsrna-184-u处理的细胞降低f1f0-atp合成酶活性(p<0.05)，见图3。

　序列表

<110>浙江大学

<120>一种f1f0-atp合成酶α亚基的rna抑制剂及应用

<160>2

<210>1

<211>22

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<222>（1）…（22）

<400>1

　　uggauggagaacugauaagggu22

<110>浙江大学

<120>一种f1f0-atp合成酶α亚基的rna抑制剂及应用

<160>2

<210>2

<211>22

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<222>（1）…（22）

<400>2

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