本发明涉及属于分子生物学领域，涉及植物的品种分子鉴别方法，特别是白芍品种鉴定的引物、试剂盒、鉴定方法。
背景技术：
白芍，别名芍药，《中国药典》2015版载其原植物为毛茛科芍药属植物芍药(paeonialactiflorapall.)经去皮水煮加工后的干燥根。其性味苦、酸，微寒。归肝、脾经。具有养血敛阴，柔肝止痛，平抑肝阳的功效。临床上多用于头痛眩晕，胁痛，腹痛，四肢挛痛，血虚萎黄，月经不调，自汗，盗汗等症。白芍主产于中国安徽、四川、浙江、山东等地。目前白芍的繁殖主要采用分根无性繁殖，大部分人工栽培的白芍仅仅经过短期的引种和驯化，可能存在着一些经过多年选择但未完全纯化的地方优良品种。如浙江磐安、安徽亳州、四川中江和山东菏泽作为白芍的传统产区，在长期的引种和交流中，种质资源较为混杂，更是出现了一些同种异地，或者同产地不同种的现象，白芍种质资源的遗传结构有较大程度的差异，品种退化严重，栽培种质混杂。
道地性白芍和非道地性白芍外观形态，质地纹理都十分相似，而传统形态学上的特征研究并不能较好的体现出其中的差异，无法准确的区分白芍的道地性。分子生物学的快速发展，为道地性白芍和非道地性白芍的区分提供了有效可靠的鉴定手段，为白芍的引种和培育工作提供了技术支持。
白芍是中国传统常用大宗中药材，种植面积大，品种繁多，严重影响了白芍规范化生产的发展。因此有必要从源头即白芍种质资源、种植规范方面严格要求，搞清白芍药材的地道性，建立品种质量标准，从而指导gap中药材生产质量管理规范标准化生产。
技术实现要素：
基于上述要求本发明主要提供一种白芍品种鉴定的引物、试剂盒、鉴定方法。
本发明的技术方案是通过如下技术方案实现的：
用于白芍品种鉴定的pcr引物，选自seqidno.1至seqidno.12中的至少两条。
在其中一些实施例中，所述pcr引物选自seqidno.1至seqidno.12中的十二条。
在其中一些实施例中，所述pcr引物的使用浓度为0.3～0.6μmol/l。
本发明是通过引物筛选得到上述的引物，对白芍dna进行pcr扩增，所得结果表现出白芍品种的差异，以该方法对白芍品种进行检测，简单准确稳定且重复性好。
用于白芍品种鉴定的试剂盒，包括上述的pcr引物。
在其中一些实施例中，所述的试剂盒还包括反应液，所述反应液包括dna聚合酶、镁离子、dntps。
在其中一些实施例中，所述dna聚合酶的浓度为0.5～1.25u/20μl；所述镁离子的浓度为1.5～3mmol/l；所述dntps的浓度为0.1～0.25mmol/l。最终得到的反应体系扩增效果好，能够得到稳定且清晰的电泳条带，有利于后续试验的鉴别和分析。
一种白芍品种的鉴定方法，包括如下步骤：
(1)提取不同品种的已知白芍dna，分别加入上述的pcr引物进行pcr反应，分离所得已知白芍pcr反应产物，得到第一结果；
(2)提取待测白芍dna，分别加入上述的pcr引物对进行pcr反应，分离所得待测白芍pcr反应产物，得到第二结果；
(3)分析所述第一结果及所述第二结果，得出鉴定结果。
本发明以dna水平的分子标记为基础，建立了上述白芍品种的分子鉴定方法，为解决白芍市场品种混乱和优劣问题提供了一种新型的便利手段。也为白芍的引种和培育提供了技术支持。该方法快速简便，只要少量样本即可实现，可用于鉴别白芍种苗，从基因水平选择白芍种植品种，从源头保障药材质量。
在其中一些实施例中，所述第一结果为将已知白芍pcr反应产物所含片段记为1、未含有片段记为0所得到的0/1矩阵；
所述第二结果为将待测白芍pcr反应产物所含片段记为1、未含有片段记为0所得到的0/1矩阵。
在其中一些实施例中，所述步骤(3)包括：采用通用ntsys-pc软件计算已知白芍、待测白芍间的相似系数，并用不加权成对算术平均法建立聚类树图谱。
在其中一些实施例中，所述pcr反应的程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，53～59℃退火45s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。上述反应程序适合白芍的pcr扩增反应，得到了良好的扩增效果，pcr产物稳定清晰，有利于后续实验结果的鉴别和分析。
在其中一些实施例中，所述退火的温度为53℃、56℃、57℃或59℃。
与现有技术相比，本申请具备如下有益效果：
发明人经过长期的实验和研究，本发明针对白芍品种，获得具有代表性的引物。进一步地，创造性地选择了合适的引物组合，该引物组合中的不同引物序列能够适用于同一扩增条件及反应程序，用其对不同品种的白芍进行pcr扩增，最终能够获得多态性最丰畗，且准确性高、稳定性好、可重复性强的结果。
基于本申请引物组合的鉴定方法，为解决品种混乱和品种优劣问题提供了有效可靠的鉴定手段，也为白芍的引种和培育工作提供了技术支持；不受采样部位和采样时期的限制，从基因层面对其进行鉴别和区分，从源头上控制药材质量和提供用药安全保障，为白芍的引种和大面积选苗培育提供了有利的技术支持；该方法快速简便，样品需求量少。
附图说明
图1正交体系优化电泳图，其中，1～16分别为正交1～16组不同pcr反应体系；
图236条引物初筛电泳图，其中，编号1-36分别为s1-s36号引物；
图3s29和s30在8个温度梯度下扩增电泳图，其中1-8分别为50℃-60℃梯度温度；
图4部分引物多态性筛选，其中，a：安徽白芍a1，b：四川白芍c1，c：浙江白芍z1；
图5s6引物对22份材料scot-pcr扩增电泳图，其中，1-22为样品表中依次排序的a1-j号样品；
图6s25引物对22份材料pcr扩增电泳图：1-22为样品表中依次排序的a1-j号样品；
图722个不同产地白芍样品的聚类分析图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明白芍品种鉴定的引物、试剂盒、鉴定方法作进一步详细的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件，实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
1.以下实施例中实验仪器、试剂和材料
仪器：核酸蛋白测定仪(implennanophotometer)、pcr扩增仪(bio-rad)、高速离心机(eppendorf5418)、超低温冰箱(thermo902-ults)、电泳仪、电泳槽(bio-rad)、凝胶成像系统(bio-rad)。
试剂：extaqdna聚合酶(takara，5u/μl)、dntp(takara，2.5mm)、dnamarker(广州东盛生物科技有限公司)、10×loadingbuffer(tiangen)、琼脂糖(biowest)、goldenview(北京博凌科为生物科技有限公司)。
引物序列如下表1：
表1本申请采用的扩增引物
实验材料：采集来自浙江，山东，四川，安徽四个不同产地的22个白芍样品，对样品进行编号和信息记录，用75％(v/v)乙醇清洁叶表面后保存于-80℃冰箱备用，具体情况见下表。
表2样品信息表
2.实验方法
(1)提取22个白芍样品的基因组dna模板
采用天根植物基因组试剂盒提取所有白芍样品的基因组dna。用微量紫外核酸仪检测dna浓度和纯度。将合格样品dna浓度稀释至20ng/μl后置于-20℃保存备用。
(2)筛选最佳pcr反应体系
选用l16(54)正交试验设计(表3)，对mg2+、dntps浓度、e×taqdna聚合酶、引物和dna用量进行5因素4水平的正交试验。以山东编号为j的dna为模板，随机挑选s6号引物作为扩增引物，反应总体积20μl，含有10×pcrbuffer2μl，每个处理重复2次。
表3pcr反应正交体系浓度表
(3)pcr引物初筛
根据以上步骤(2)所得的正交试验结果获得最佳反应体系，用该最佳反应体系，模板为样品编号j的dna对36条scot通用引物进行扩增。筛选出在该条最佳反应体系下能够获得条带清晰且多态性好的引物，作为初筛结果。
(4)筛选最优退火温度
根据以上步骤(2)所得的正交试验结果获得最佳反应体系，用s29引物对样品编号j的dna进行扩增，退火温度设置8个温度梯度，即50℃，50.9℃，52.3℃，54℃，56.3℃，58.1℃，59.3℃，60℃；以s30为引物做同样的操作。筛选出条带清晰结果对应的退火温度。
(5)pcr反应体系的验证与多态性引物筛选
采用步骤(2)获得的最佳反应体系及步骤(4)筛选的最优退火温度，选择浙江、四川、安徽三个不同产地的白芍样品dna为模板，筛选出同时满足最佳反应体系、最优退火温度的多态性好、条带清晰的引物。
(6)pcr扩增与检测
分别用步骤(5)筛选到的引物扩增步骤(1)提取的dna。pcr扩增反应在pcr仪上进行，扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。扩增反应结束后，取10μl扩增产物加入2μl6×loadingbuffer用2.0％琼脂糖凝胶，在1×tae电极缓冲液，120v,30min电泳下检测条带，凝胶成像仪下拍照。
(7)数据分析
根据pcr扩增产物的电泳结果，对清晰且易于辨认的条带采用“0/1”系统记录其位置，建立scot标记的0/1矩阵。用ntsys-pc2.10e软件计算样品间的相似系数，并用不加权成对算术平均法(upgma)进行聚类分析。
3结果判读
(1)dna提取结果
将提取的所有样品在超微量紫外分光光度计下测量其浓度和纯度，得到其a260/a280均在1.7～2.0之间，说明dna纯度较高，符合pcr技术要求，详细提取结果见表4。
表424个白芍样品dna提取结果
(2)scot-pcr反应体系正交优化结果分析
使用引物s6对反应体系优化的电泳结果见图1，参考桂腾琴直观评价法依次对16个实验组结果多态性进行评分，条带数量丰富、清晰的计16分，涂布或无条带的计1分，反应1～16组体系的平均整数计分依次为:4、8、5、9、7、12、7、6、8、9、3、10、5、15、16、14分。依照计分原则，以第15组计分最高，条带最为清晰明亮。因此考虑体系最终为：1×pcrbuffer，3mmol·l–1mg2+，0.2mol·l–1dntps，0.6μmol·l–1primer，0.75uextaq酶，30ngdna模板。
(3)pcr引物初筛
以最佳反应体系对36条引物(编号s1至s36)进行筛选，重复2次初筛选出14条引物见下图2。根据图2，筛选出条带清晰且多态性好的引物为s3、s6、s7、s10、s16、s20、s23、s25、s29、s30、s31、s33、s34、s35。
(4)筛选最优退火温度
根据信号强度判断条带，采用区间温度对筛选的引物进行匹配最终获得在53℃，56℃，57℃，59℃四个温度扩增下的13条引物，其中s29和s30号引物的退火温度梯度筛选如下图3。
(5)pcr反应体系的验证与多态性引物筛选
以浙江，四川，安徽三个地域差异大的样品对退火优化后的13条引物进行多态性筛选，最终获得12条扩增带型完整、清晰、多态性丰畗的引物(表5)。利用这12条引物对24份材料进行扩增，共获得总条带121条，其中多态性条带共77条，多态位点百分率共占63.6％，多态性比率较高，在分子水平证实了白芍具有丰富的种内遗传多样性。部分多态性筛选结果见图4，其中a是样品编号为a1的安徽白芍，b是样品编号为c1的四川白芍，c是样品编号为z1的浙江白芍。
表5引物扩增结果
(6)数据分析
对电泳图上重复性好且条带清晰的电泳条带计数，有条带的记为1，无条带的记为0，建立0/1矩阵表，如下表6和表7。
(7)scot标记的遗传相似性及聚类分析:利用ntsys软件构建全部材料基于scot数据的upgma树状图，结果如图7。22份白芍材料两两之间的相似系数在0.78～0.94之间，以相似系数0.82为阈值可将22份材料划分为5组，浙江的4个样品z1-z4聚为一支；四川的4个样品c3、c4、c5、c6聚为一支；安徽a1、a2与四川c1、c2聚为一支；山东b、c、k三个样品聚为一支；剩下7个的山东样品聚为一组。
从上述结果来看，不同地区白芍样品分别聚在一起，同时也能通过聚类图谱分析不同地区白芍样品的亲缘关系。此方法有望解决白芍品种混杂的难题，为白芍的大规模种植提供了有利的品种选育技术支持。
对比例1
本对比例采用如下引物组合对实施例1中样品编号1至12的白芍dna进行分别扩增：
引物序列包括：s2(seqidno.14)、s4(seqidno.15)、s5(seqidno.16)、s7(seqidno.17)、s13(seqidno.22)、s14(seqidno.23)、s17(seqidno.25)、s18(seqidno.26)、s19(seqidno.27)、s21(seqidno.28)、s24(seqidno.24)、s27(seqidno.32)、s28(seqidno.28)、s32(seqidno.34)、s34(seqidno.34)、s36(seqidno.36)。
结果：采用以上引物组合进行聚合酶链式反应之后，用琼脂糖凝胶电泳分别对聚合酶链式反应产物进行电泳分离，结果是条带无多态性，即所有样品的电泳条带无区别，无法进行后续的聚类分析和相似系数的计算。
对比例2
本对比例虽然采用seqidno.1至seqidno.12中的十二条引物对白芍dna进行扩增，但是引物的浓度为0.65μmol/l，dna聚合酶的浓度为1.5u/20μl；所述镁离子的浓度为1.0mmol/l,dntps的浓度为0.05mmol/l。
结果：将上述得到的扩增产物用用琼脂糖凝胶电泳进行电泳分离，与实施例1相比，电泳条带模糊，较难进行后续的聚类分析和相似系数的计算。
综上所述，本发明针对白芍品种，从其atg翻译起始位点侧翼序列的保守性出发，获得具有代表性的引物组合，该引物组合中的不同引物序列能够适用于同一扩增体系及反应程序，用其对不同品种的白芍进行pcr扩增，最终能够获得准确性高、稳定性好、可重复性强，且多态性丰畗的结果。本申请提供的鉴别方法，分析不同白芍品种的遗传多样性和亲缘关系，确定不同产区的白芍种质资源的差异，从基因水平对白芍品种进行鉴别区分。为解决品种混乱和品种优劣问题提供了有效可靠的鉴定手段，也为白芍的引种和培育工作提供了技术支持。相比传统鉴别具有极大优势，不受采样部位和采样时期的限制，从基因层面对其进行鉴别和区分，该方法快速简便，样品需求量少，可从用以鉴别白芍种苗品种，从而从源头上控制药材质量和提供用药安全保障，为白芍的引种和大面积选苗培育提供了有利的技术支持。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110>广州市香雪制药股份有限公司
<120>白芍品种鉴定的引物、试剂盒、鉴定方法
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