本发明属于红花药材的提取方法
技术领域：
。更具体地说，本发明涉及一种生物法提取平均纯度不低于95％的羟基红花黄素a的高纯度羟基红花黄素a的提取方法。
背景技术：
：红花属于双子叶植物纲的菊科红花属，为一年生草本植物。红花的原产地是埃及，经中东和印度等地首先传入到中国的西部地区，目前主要产地为新疆、甘肃、浙江、河南、四川等地区。红花在中国属于单一栽培植物，早在一千多年前就已被使用。红花的花朵具有活血通经、祛瘀止痛之功效，是传统的活血化瘀中药。红花还是天然红色素的原料，常用作染料和食用色素。红花的化学成分比较复杂，生物活性也很广泛，目前是亚洲地区研究和应用的“热点”植物之一。已有研究报道，红花中含有260多种化合物，比如核苷、核黄素及其降解产物、黄酮、木脂体、有机酸和箔醇类等，但其主要化学成分为查尔酮类色素和黄酮醇类化合物，其中查尔酮类色素的含量最高，主要包括红花黄素和红花红素，均属于黄酮类衍生物。黄酮醇类化合物包括山柰酚类和槲皮素等。红花黄色素(saffloweryellow)是红花活血化瘀功效的有效成分，它有效阻止血栓进一步发展、促进血栓溶解，使阻塞的部分畅通、改善组织微循环，从而使组织得到更多的营养。它可以解除血管平滑肌的痉挛，具有镇痛、抗炎、抗疲劳、耐缺氧、降压等药理作用。因此，在平时的饮食中适当地补充红花黄色素，有益于人体健康。羟基红花黄素a的结构式目前一些企业正在开发的羟基红花黄素a制剂的主要有效成分即为羟基红花黄素a。20世纪80年代之前，大多学者认为羟基红花黄素a为saffloweryellow或者carthaminyellow，其化学分子式为c24h30015，但不能够确定其化学结构式。随后，羟基红花黄素a的化学组成及其化学结构式相继被给出。1981年，onodera等分离得到safflomina，并确定是查尔酮的双糖碳甙；做ahashi等分离得到saffioryellowa和saffioryellowb，确定了其化学结构式，认为saffloryellowa与safllomina的化学结构相似。onodera等分离得到safllominc，确定了其结构式。meselhy等分离得到两种新的黄色素成hsya(hydroxysaffioryellowa)和tinctorimine。kazuma等分离得到precarthamin，并且认为其结构式与saffioryellowb相似。常见植物素的提取方法主要有：浸提法、纤维素酶法和有机溶媒提取法等。传统的浸提法具有操作简便、设备简单的优点，主要机理是相似相溶。选择溶剂的原则：选择性好，即对目标成分的溶解度大，对杂质的溶解度小；与其它组分不发生反应。羟基红花黄素a的极性较大，通常用水或者不同浓度的乙醇浸提。水的价格低廉且容易取得，而且安全无毒，大多数选用水提法。韩书昌等考察了水、30％的乙醇水溶液、70％的乙醇水溶液对羟基红花黄素a的提取效果。实验结果表明，在水中羟基红花黄素a的溶解性最好，提取率也最高，加热浸提优于常温浸提。但是，羟基红花黄素a受热易分解，加热影响提取率，因此采用常温提取。陆国权等用ph为3的酸性水提取羟基红花黄素a，料液比为1：50，在70℃下浸提72min，提取2次，收率达到93.4％。周平兰等确定的提取条件是，浸提2次，料液比是1：12或1：14，浸泡30rain，提取20min，其中浸泡时间和提取时间对羟基红花黄素a的提取都有重要的影响，回流提取比温浸法耗时短，中间不需要搅拌，节能省时。王义潮等确定的提取条件为，料液比1：40，在70℃下浸提时间90min、浸提3次。杨志福等分别用80％的丙酮、70％的甲醇和水提取羟基红花黄素a，其中70％的甲醇和水提取的效果好，但是甲醇有毒、挥发性大，故选用水提法。吴冬青等比较了几种浸取剂对羟基红花黄素a的提取效果，实验结果表明70％的酸性乙醇水溶液的提取效果最好。许珍珍等用hplc法测定，以羟基红花黄素a百分含量为指标，对红花药液的醇沉工艺进行了评价和优化，并考察了醇沉浓度、药液浓度及ph值对羟基红花黄素a纯化效果的影响。杨晓君等考察了ztc澄清剂对红花水提液的除杂效果的影响，以提取液中羟基红花黄素a含量和收膏率为指标对正交实验结果进行了综合评价。结果同时表明澄清剂的加入并没有造成有效成分的明显损失，可以应用于红花水提液的纯化。陈英等采用正交设计表，以羟基红花黄素a得率为指标，用hplc法测定含量，对壳聚糖纯化红花的工艺进行了优化。雷玉霞等将红花水提液浓缩后大孔吸附树脂柱，以羟基红花黄素a含量为考察指标，对树脂柱进行了筛选，并对影响黄素色分离纯化的工艺参数进行了一系列的考察。目前红花的分离纯化技术除了传统的醇沉法外，澄清剂法(ztc、壳聚糖凝胶等)、大孔树脂法都被广泛采用。醇沉法作为传统的纯化方法，曾经因为操作简便和工艺要求低而被广泛采用。但是醇沉法随着乙醇浓度的降低，红花中有效成分的含量也随之明显下降，要提高有效成分的含量需要提高醇浓度，而这样会导致生产成本的增加。澄清剂法和醇沉法相比较，在有效成分保留效果上相近，此外澄清剂多是以天然多糖为原料制成，安全无毒，适合药物和食品行业的纯化，与醇沉法相比显得更简单、更经济。大孔树脂法与其它两种方法相比较，所得羟基红花黄素a的纯度明显较高，比较适用于进一步的分离纯化提高纯度。但是，目前国内还未出现规模化生产红花黄素a的方法，随着红花黄素a被进一步的开发，市场的需求不断增加，提供一种能大规模生产高含量高品质的羟基红花黄素a产品的方法是目前市场上迫切需要的。技术实现要素：本发明的一个目的是解决至少上述问题或缺陷，并提供至少一个后面将说明的优点。本发明还有一个目的是提供一种获得高品质的高纯度羟基红花黄素a的提取方法，采用超临界c02流体萃取技术来提取红花中的挥发油，不仅提高了提取率，还保护了药材中的其他热敏性成分，为接下来进一步从超临界萃余物里提取羟基红花黄素a打下了基础。本发明还有一个目的是提供一种避免现有技术中填料昂贵和分离条件中沉降过大等问题，大大降低了提取分离的成本的高纯度羟基红花黄素a的提取方法，由于纳滤系统分离大分子进行富集和初步纯化，然后又用大孔树脂对红花提取液对其进行进一步纯化，再经过有机溶剂精制等工艺提取得到高品质的羟基红花黄素a，提取方法操作简单，效率高，分离羟基红花黄素a纯度达到95％以上。不仅提高了产品的质量还避免了现有技术中填料昂贵和分离条件中沉降过大等问题，大大降低了产品的成本。为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，本发明提供了一种高纯度羟基红花黄素a的提取方法，包括：步骤一、红花挥发性成分提取：将粉碎过的红花药材置于超临界仪器中1000ml的萃取釜中以超临界co2流体进行萃取得到红花超临界萃取物；步骤二、羟基红花黄素a的提取：向所述步骤一得到的红花超临界萃取物中加入醇水混合物，将温度升高到30～70℃，搅拌下提取1～4小时得到红花水提取液；步骤三、羟基红花黄素a的纯化：首先，将所述步骤二得到的红花水提取液采用纳滤装置进行富集和初步纯化；其次，采用离子交换树脂吸附洗脱得洗脱液；步骤四、将所述步骤三得到的洗脱液进行浓缩至干，将所得固体加入乙酸乙酯中，加入活性炭，搅拌下加热回流，趁热过滤，滤液于-20℃～-5℃下冷却6～10小时，真空抽滤，2～3倍体积冷乙酸乙酯淋洗，所得固体在20～30℃真空干燥得羟基红花黄素a。优选的是，其中，所述步骤一中超临界co2流体进行萃取的条件为：萃取温度为40～50℃、萃取压力为20～25mpa、萃取时间为2.5～4.0h。优选的是，其中，所述步骤二中醇水混合物中醇水的体积比为1:5～30；提取条件为：提取温度为40～50℃、料液体积比为1:15～20、提取时间为2.5～4.5h。优选的是，其中，所述步骤三中，采用纳滤装置进行富集和初步纯化具体包括步骤：采用型号为uof～4中空纤维膜为组件的纳滤装置，以20～30l/h，压力为0.2～0.4兆帕的流速进行浓缩，截留分子量为5000以上，得透过液。优选的是，其中，所述步骤三中，采用离子交换树脂吸附洗脱得洗脱液具体包括步骤：将充分溶胀好的离子交换树脂进行湿法上柱，采用径高比为1:10～20上柱量，用80～95％乙醇进行洗柱，洗至采用1l洗柱液加水不显白色浊液为止，用大量蒸馏水洗至离子交换树脂无醇味，加40～50％乙醇洗脱液平衡1～3h，分离红花水提液30～50l，按1～3％柱体积上样，洗脱速度为1～3l/min，洗脱液浓度为40～50％乙醇，分管收集洗脱液，用聚酰胺薄膜分析收集到的洗脱液，按此方法重复分离三次，将经过三次分离后得到的分离液按体积比1.5～3.0﹕l，30～50℃减压浓缩，取浓缩后的分离液1ml置于10ml容量瓶中定容，并用紫外可见分光光度计测得吸光度数据记录。优选的是，其中，所述步骤二还包括步骤：移取一定量的提取液，稀释一定的倍数，用紫外分光光度计测量其吸光度，根据吸光度和浓度在一定的范围内呈线性关系来计算其浓度，提取率的计算公式为：式中，c为n次提取液混合后溶液中羟基红花黄素a的浓度mg/ml；v为n次提取液混合后溶液的总体积ml；m0为所用红花药材的质量mg。优选的是，其中，所述步骤一中，粉碎过的红花药材的粉碎步骤具体包括：采用动态高压微射流超微化技术，对红花药材进行超微化粉碎至粒度为200～300目，其中超微化粉碎的工作压力为115～118mpa，工作温度为22～24℃。优选的是，其中，所述离子交换树脂为amberlitexad系列吸附树脂。优选的是，其中，所述步骤四中得到的羟基红花黄素a的纯度为95％以上。优选的是，其中，所述步骤一中超临界co2流体进行萃取包括静态萃取和动态萃取，静态萃取时间为2h：动态萃取时间为1.5h。本发明至少包括以下有益效果：1、本发明提供的高纯度羟基红花黄素a的提取方法，通过采用超临界c02流体萃取技术来提取红花中的挥发油，不仅提高了提取率，还保护了药材中的其他热敏性成分，为接下来进一步从超临界萃余物里提取羟基红花黄素a打下了基础。本发明以超临界c02萃取物的萃取率为指标，对影响萃取率的主要因素，萃取压力、萃取温度、萃取时间等进行分析，确定了羟基红花黄素a萃取工艺条件；2、本发明提供的高纯度羟基红花黄素a的提取方法，由于采用搅拌浸提法，其原理就是通过搅拌器使物料和溶剂充分接触，进行动态提取。搅拌主要使溶质从与颗粒密切接触的液体中向液体主体扩散，加快传质的速度，也使溶剂快速渗透到植物细胞中，有利于植物中的有效成分溶于溶剂中，一定的温度可以加速溶质的溶解和整个扩散过程，提取的工艺条件直接关系到红花黄色素的产率和生产成本，以提取率为指标研究其影响因素，有溶剂种类、提取温度、料液比、提取时间等条件，确定了羟基红花黄素a提取工艺条件；3、本发明提供的高纯度羟基红花黄素a的提取方法，由于先采用纳滤系统分离大分子进行富集和初步纯化，然后又用大孔树脂对红花提取液对其进行进一步纯化，再经过有机溶剂精制等工艺提取得到高品质的羟基红花黄素a，提取方法操作简单，效率高，分离羟基红花黄素a纯度达到95％以上。不仅提高了产品的质量还避免了现有技术中填料昂贵和分离条件中沉降过大等问题，大大降低了产品的成本；4、本发明提供的高纯度羟基红花黄素a的提取方法，在进行超临界co2流体进行萃取之前，对红花药材进行超微粉碎，不仅可以改善超临界二氧化碳与红花的互溶率，而且有利于超临界二氧化碳和红花中挥发性成分的充分作用，提高了红花中挥发性成分与其他成分分离的速率；5、本发明提供的高纯度羟基红花黄素a的提取方法，通过在超临界co2流体进行萃取中，进行静态萃取和动态萃取，严格控制静态萃取和动态萃取的时间，静态提取保持一定的表观接触时间，可改善超临界co2流体与红花的接触，提高互溶效率，也有利于超临界co2流体与红花挥发性成分的充分作用，动态提取通过补充新鲜的超临界co2流体，使得超临界co2流体中红花的浓度始终较低，有利于红花的萃取，通过静态萃取和动态萃取的结合使得红花的提取率达到最大。附图说明图1为本发明的一个实施例中高纯度羟基红花黄素a的提取方法的工艺流程示意图。具体实施方式下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。图1示出了高纯度羟基红花黄素a的提取方法的工艺流程示意图，其包括红花原粉粉碎、超临界co2流体进行萃取、提取液提取、纳滤分离、精制纯化、真空干燥步骤，下面结合实施例对高纯度羟基红花黄素a的提取方法的步骤进行具体说明。实施例1一种高纯度羟基红花黄素a的提取方法，包括以下步骤：步骤一、红花挥发性成分提取：将粉碎过的红花药材100g置于超临界仪器中1000ml的萃取釜中以超临界co2流体进行萃取得到红花超临界萃取物，其中，超临界co2流体进行萃取的条件为：萃取温度为45℃、萃取压力为20mpa、萃取时间为2.5h，红花超临界萃取物的提取率在124.6mg/g，其中，粉碎采用常规粉碎方法如粉碎机进行粉碎；步骤二、羟基红花黄素a的提取：向所述步骤一得到的红花超临界萃取物中加入体积比为1:15的醇水混合物，将温度升高到50℃，搅拌下提取3小时得到红花水提取液，料液体积比为1:15；步骤三、羟基红花黄素a的纯化：首先，将所述步骤二得到的红花水提取液，确定管道及容器干净后，原料槽装入料液，采用型号为uof～4中空纤维膜为组件的纳滤装置，以20l/h，压力为0.3兆帕的流速进行浓缩，截留分子量为5000以上，得透过液备下一步纯化；其次，采用离子交换树脂吸附洗脱得洗脱液：将充分溶胀好的amberlitexad系列吸附树脂进行湿法上柱，采用径高比为1:15上柱量，用90％乙醇进行洗柱，洗至采用1l洗柱液加水不显白色浊液为止，改用大量蒸馏水洗至树脂无醇味，加50％乙醇洗脱液平衡2h，分离红花水提液50l，按2％柱体积上样，洗脱速度为2l/min，洗脱液浓度为40％乙醇，分管收集洗脱液，用聚酰胺薄膜分析收集到的洗脱液，按此方法重复分离三次，将经过三次分离后得到的分离液按体积比1.5﹕l，40℃减压浓缩，取浓缩后的分离液1ml置于10ml容量瓶中定容，并用紫外可见分光光度计测得吸光度数据记录，根据吸光度和浓度在一定的范围内呈线性关系来计算其浓度，提取率的计算公式为：式中，c为n次提取液混合后溶液中羟基红花黄素a的浓度mg/ml；v为n次提取液混合后溶液的总体积ml；m0为所用红花药材的质量mg；步骤四、将所述步骤三得到的洗脱液进行浓缩至干，将所得固体加入乙酸乙酯中，加入活性炭，搅拌下加热回流，趁热过滤，滤去活性碳，滤液于-10℃下冷却8小时，真空抽滤，2倍体积冷乙酸乙酯淋洗，滤液回收，蒸馏套用，所得到固体在30℃真空干燥，固体为羟基红花黄素a精品，得到羟基红花黄素a纯度为96.5％。实施例2一种高纯度羟基红花黄素a的提取方法，包括以下步骤：步骤一、红花挥发性成分提取：将粉碎过的红花药材99g置于超临界仪器中1000ml的萃取釜中以超临界co2流体进行萃取得到红花超临界萃取物，其中，超临界co2流体进行萃取的条件为：萃取温度为50℃、萃取压力为23mpa、萃取时间为3.0h，红花超临界萃取物的提取率在127.3mg/g，其中，粉碎采用常规粉碎方法如粉碎机进行粉碎；步骤二、羟基红花黄素a的提取：向所述步骤一得到的红花超临界萃取物中加入体积比为1:10的醇水混合物，将温度升高到50℃，搅拌下提取4小时得到红花水提取液，料液体积比为1:20；步骤三、羟基红花黄素a的纯化：首先，将所述步骤二得到的红花水提取液，确定管道及容器干净后，原料槽装入料液，采用型号为uof～4中空纤维膜为组件的纳滤装置，以25l/h，压力为0.4兆帕的流速进行浓缩，截留分子量为5000，得透过液备下一步纯化；其次，采用离子交换树脂吸附洗脱得洗脱液：将充分溶胀好的amberlitexad系列吸附树脂进行湿法上柱，采用径高比为1:20上柱量，用85％乙醇进行洗柱，洗至采用1l洗柱液加水不显白色浊液为止，改用大量蒸馏水洗至树脂无醇味，加45％乙醇洗脱液平衡2h，分离红花水提液50l，按2％柱体积上样，洗脱速度为3l/min，洗脱液浓度为50％乙醇，分管收集洗脱液，用聚酰胺薄膜分析收集到的洗脱液，按此方法重复分离三次，将经过三次分离后得到的分离液按体积比2.0﹕l，50℃减压浓缩，取浓缩后的分离液1ml置于10ml容量瓶中定容，并用紫外可见分光光度计测得吸光度数据记录，根据吸光度和浓度在一定的范围内呈线性关系来计算其浓度，提取率的计算公式为：式中，c为n次提取液混合后溶液中羟基红花黄素a的浓度mg/ml；v为n次提取液混合后溶液的总体积ml；m0为所用红花药材的质量mg；步骤四、将所述步骤三得到的洗脱液进行浓缩至干，将所得固体加入乙酸乙酯中，加入活性炭，搅拌下加热回流，趁热过滤，滤去活性碳，滤液于-20℃下冷却6小时，真空抽滤，2倍体积冷乙酸乙酯淋洗，滤液回收，蒸馏套用，所得到固体在20℃真空干燥，固体为羟基红花黄素a精品，得到羟基红花黄素a纯度为97.1％。实施例3一种高纯度羟基红花黄素a的提取方法，包括以下步骤：步骤一、红花挥发性成分提取：将粉碎过的红花药材100g置于超临界仪器中1000ml的萃取釜中以超临界co2流体进行萃取得到红花超临界萃取物，其中，超临界co2流体进行萃取的条件为：萃取温度为45℃、萃取压力为20mpa、萃取时间为2.5h，红花超临界萃取物的提取率在130.5mg/g，其中，粉碎采用动态高压微射流超微化技术，对红花药材进行超微化粉碎至粒度为200～300目，其中超微化粉碎的工作压力为115mpa，工作温度为23℃；步骤二、羟基红花黄素a的提取：向所述步骤一得到的红花超临界萃取物中加入体积比为1:15的醇水混合物，将温度升高到50℃，搅拌下提取3小时得到红花水提取液，料液体积比为1:15；步骤三、羟基红花黄素a的纯化：首先，将所述步骤二得到的红花水提取液，确定管道及容器干净后，原料槽装入料液，采用型号为uof～4中空纤维膜为组件的纳滤装置，以20l/h，压力为0.3兆帕的流速进行浓缩，截留分子量为5000以上，得透过液备下一步纯化；其次，采用离子交换树脂吸附洗脱得洗脱液：将充分溶胀好的amberlitexad系列吸附树脂进行湿法上柱，采用径高比为1:15上柱量，用90％乙醇进行洗柱，洗至采用1l洗柱液加水不显白色浊液为止，改用大量蒸馏水洗至树脂无醇味，加50％乙醇洗脱液平衡2h，分离红花水提液50l，按2％柱体积上样，洗脱速度为2l/min，洗脱液浓度为40％乙醇，分管收集洗脱液，用聚酰胺薄膜分析收集到的洗脱液，按此方法重复分离三次，将经过三次分离后得到的分离液按体积比1.5﹕l，40℃减压浓缩，取浓缩后的分离液1ml置于10ml容量瓶中定容，并用紫外可见分光光度计测得吸光度数据记录，根据吸光度和浓度在一定的范围内呈线性关系来计算其浓度，提取率的计算公式为：式中，c为n次提取液混合后溶液中羟基红花黄素a的浓度mg/ml；v为n次提取液混合后溶液的总体积ml；m0为所用红花药材的质量mg；步骤四、将所述步骤三得到的洗脱液进行浓缩至干，将所得固体加入乙酸乙酯中，加入活性炭，搅拌下加热回流，趁热过滤，滤去活性碳，滤液于-10℃下冷却8小时，真空抽滤，2倍体积冷乙酸乙酯淋洗，滤液回收，蒸馏套用，所得到固体在30℃真空干燥，固体为羟基红花黄素a精品，得到羟基红花黄素a纯度为97.5％。实施例4一种高纯度羟基红花黄素a的提取方法，包括以下步骤：步骤一、红花挥发性成分提取：将粉碎过的红花药材99g置于超临界仪器中1000ml的萃取釜中以超临界co2流体进行萃取得到红花超临界萃取物，其中，超临界co2流体进行萃取的条件为：萃取温度为50℃、萃取压力为23mpa、萃取时间为3.0h，红花超临界萃取物的提取率在130.3mg/g，其中，粉碎采用常规粉碎方法如粉碎机进行粉碎，其中，粉碎采用动态高压微射流超微化技术，对红花药材进行超微化粉碎至粒度为200～300目，其中超微化粉碎的工作压力为118mpa，工作温度为24℃；步骤二、羟基红花黄素a的提取：向所述步骤一得到的红花超临界萃取物中加入体积比为1:10的醇水混合物，将温度升高到50℃，搅拌下提取4小时得到红花水提取液，料液体积比为1:20；步骤三、羟基红花黄素a的纯化：首先，将所述步骤二得到的红花水提取液，确定管道及容器干净后，原料槽装入料液，采用型号为uof～4中空纤维膜为组件的纳滤装置，以25l/h，压力为0.4兆帕的流速进行浓缩，截留分子量为5000，得透过液备下一步纯化；其次，采用离子交换树脂吸附洗脱得洗脱液：将充分溶胀好的amberlitexad系列吸附树脂进行湿法上柱，采用径高比为1:20上柱量，用85％乙醇进行洗柱，洗至采用1l洗柱液加水不显白色浊液为止，改用大量蒸馏水洗至树脂无醇味，加45％乙醇洗脱液平衡2h，分离红花水提液50l，按2％柱体积上样，洗脱速度为3l/min，洗脱液浓度为50％乙醇，分管收集洗脱液，用聚酰胺薄膜分析收集到的洗脱液，按此方法重复分离三次，将经过三次分离后得到的分离液按体积比2.0﹕l，50℃减压浓缩，取浓缩后的分离液1ml置于10ml容量瓶中定容，并用紫外可见分光光度计测得吸光度数据记录，根据吸光度和浓度在一定的范围内呈线性关系来计算其浓度，提取率的计算公式为：式中，c为n次提取液混合后溶液中羟基红花黄素a的浓度mg/ml；v为n次提取液混合后溶液的总体积ml；m0为所用红花药材的质量mg；步骤四、将所述步骤三得到的洗脱液进行浓缩至干，将所得固体加入乙酸乙酯中，加入活性炭，搅拌下加热回流，趁热过滤，滤去活性碳，滤液于-20℃下冷却6小时，真空抽滤，2倍体积冷乙酸乙酯淋洗，滤液回收，蒸馏套用，所得到固体在20℃真空干燥，固体为羟基红花黄素a精品，得到羟基红花黄素a纯度为97.6％。实施例5一种高纯度羟基红花黄素a的提取方法，包括以下步骤：步骤一、红花挥发性成分提取：将粉碎过的红花药材100g置于超临界仪器中1000ml的萃取釜中以超临界co2流体进行萃取得到红花超临界萃取物，其中，超临界co2流体进行萃取的条件为：萃取温度为45℃、萃取压力为20mpa、静态萃取时间为1.5h，动态萃取时间为1h，红花超临界萃取物的提取率在135.8mg/g，其中，粉碎采用动态高压微射流超微化技术，对红花药材进行超微化粉碎至粒度为200～300目，其中超微化粉碎的工作压力为115mpa，工作温度为23℃；步骤二、羟基红花黄素a的提取：向所述步骤一得到的红花超临界萃取物中加入体积比为1:15的醇水混合物，将温度升高到50℃，搅拌下提取3小时得到红花水提取液，料液体积比为1:15；步骤三、羟基红花黄素a的纯化：首先，将所述步骤二得到的红花水提取液，确定管道及容器干净后，原料槽装入料液，采用型号为uof～4中空纤维膜为组件的纳滤装置，以20l/h，压力为0.3兆帕的流速进行浓缩，截留分子量为5000以上，得透过液备下一步纯化；其次，采用离子交换树脂吸附洗脱得洗脱液：将充分溶胀好的amberlitexad系列吸附树脂进行湿法上柱，采用径高比为1:15上柱量，用90％乙醇进行洗柱，洗至采用1l洗柱液加水不显白色浊液为止，改用大量蒸馏水洗至树脂无醇味，加50％乙醇洗脱液平衡2h，分离红花水提液50l，按2％柱体积上样，洗脱速度为2l/min，洗脱液浓度为40％乙醇，分管收集洗脱液，用聚酰胺薄膜分析收集到的洗脱液，按此方法重复分离三次，将经过三次分离后得到的分离液按体积比1.5﹕l，40℃减压浓缩，取浓缩后的分离液1ml置于10ml容量瓶中定容，并用紫外可见分光光度计测得吸光度数据记录，根据吸光度和浓度在一定的范围内呈线性关系来计算其浓度，提取率的计算公式为：式中，c为n次提取液混合后溶液中羟基红花黄素a的浓度mg/ml；v为n次提取液混合后溶液的总体积ml；m0为所用红花药材的质量mg；步骤四、将所述步骤三得到的洗脱液进行浓缩至干，将所得固体加入乙酸乙酯中，加入活性炭，搅拌下加热回流，趁热过滤，滤去活性碳，滤液于-10℃下冷却8小时，真空抽滤，2倍体积冷乙酸乙酯淋洗，滤液回收，蒸馏套用，所得到固体在30℃真空干燥，固体为羟基红花黄素a精品，得到羟基红花黄素a纯度为98.3％。实施例6一种高纯度羟基红花黄素a的提取方法，包括以下步骤：步骤一、红花挥发性成分提取：将粉碎过的红花药材99g置于超临界仪器中1000ml的萃取釜中以超临界co2流体进行萃取得到红花超临界萃取物，其中，超临界co2流体进行萃取的条件为：萃取温度为50℃、萃取压力为23mpa、静态萃取时间为2h，动态萃取时间为1.0h，红花超临界萃取物的提取率在136.2mg/g，其中，粉碎采用常规粉碎方法如粉碎机进行粉碎，其中，粉碎采用动态高压微射流超微化技术，对红花药材进行超微化粉碎至粒度为200～300目，其中超微化粉碎的工作压力为118mpa，工作温度为24℃；步骤二、羟基红花黄素a的提取：向所述步骤一得到的红花超临界萃取物中加入体积比为1:10的醇水混合物，将温度升高到50℃，搅拌下提取4小时得到红花水提取液，料液体积比为1:20；步骤三、羟基红花黄素a的纯化：首先，将所述步骤二得到的红花水提取液，确定管道及容器干净后，原料槽装入料液，采用型号为uof～4中空纤维膜为组件的纳滤装置，以25l/h，压力为0.4兆帕的流速进行浓缩，截留分子量为5000，得透过液备下一步纯化；其次，采用离子交换树脂吸附洗脱得洗脱液：将充分溶胀好的amberlitexad系列吸附树脂进行湿法上柱，采用径高比为1:20上柱量，用85％乙醇进行洗柱，洗至采用1l洗柱液加水不显白色浊液为止，改用大量蒸馏水洗至树脂无醇味，加45％乙醇洗脱液平衡2h，分离红花水提液50l，按2％柱体积上样，洗脱速度为3l/min，洗脱液浓度为50％乙醇，分管收集洗脱液，用聚酰胺薄膜分析收集到的洗脱液，按此方法重复分离三次，将经过三次分离后得到的分离液按体积比2.0﹕l，50℃减压浓缩，取浓缩后的分离液1ml置于10ml容量瓶中定容，并用紫外可见分光光度计测得吸光度数据记录，根据吸光度和浓度在一定的范围内呈线性关系来计算其浓度，提取率的计算公式为：式中，c为n次提取液混合后溶液中羟基红花黄素a的浓度mg/ml；v为n次提取液混合后溶液的总体积ml；m0为所用红花药材的质量mg；步骤四、将所述步骤三得到的洗脱液进行浓缩至干，将所得固体加入乙酸乙酯中，加入活性炭，搅拌下加热回流，趁热过滤，滤去活性碳，滤液于-20℃下冷却6小时，真空抽滤，2倍体积冷乙酸乙酯淋洗，滤液回收，蒸馏套用，所得到固体在20℃真空干燥，固体为羟基红花黄素a精品，得到羟基红花黄素a纯度为98.7％。实施例1-实施例4中，步骤一中的超临界co2流体萃取均为静态萃取。实施例3与实施例4相比于实施例1与实施例2，对红花药材进行了动态高压微射流超微化粉碎，从提取率实验结果可以看出，对红花药材进行动态高压微射流超微化粉碎相比于普通的粉碎机进行粉碎进行超临界co2流体萃取后提取率要高，因此，进行动态高压微射流超微化粉碎得到的红花粉碎物不仅可以改善超临界二氧化碳与红花粉碎物的互溶率，而且有利于超临界二氧化碳和红花粉碎物中挥发性成分的充分作用，提高了红花中挥发性成分与其他成分分离的速率，提高了红花超临界萃取物的提取率。实施例5与实施例6相比于实施例3与实施例4，在进行超临界co2流体萃取时，对萃取的过程进行了静态萃取和动态萃取，从提取率实验结果可以看出，严格控制静态萃取和动态萃取的时间，静态提取保持一定的表观接触时间，可改善超临界co2流体与红花粉碎物的接触，提高互溶效率，也有利于超临界co2流体与红花挥发性成分的充分作用，动态提取通过补充新鲜的超临界co2流体，使得超临界co2流体中红花的浓度始终较低，有利于红花粉碎物的萃取，通过静态萃取和动态萃取的结合使得红花的提取率达到最大。因此，将红花进行动态高压微射流超微化粉碎后进行超临界co2流体萃取，并控制静态萃取和动态萃取的时间，使得红花的提取率达到最大，通过之后的步骤得到的羟基红花黄素a的纯度也大大地提高了。超临界二氧化碳提取工艺本身具有很多优点，(1)co2的临界温度接近于室温，适合于热敏性物质，完整保留生物活性，而且能把高沸点，低挥发度，易热解的物质分离出来。(2)co2的临界压力适中，目前工业水平易达到；(3)co2的临界密度是常用超临界溶剂中最高的(合成氟化物除外)，即溶解能力较好；(4)co2无毒、无味、不燃、不腐蚀、价廉，易于精制、易于回收，无污染。超临界二氧化碳提取中的工艺参数的选择表1萃取温度的选择：序号萃取压力(mpa)萃取温度(℃)萃取时间(h)提取率(mg/g)120703.0101.5225703.0103.2320603.0109.2425603.0108.4520503.0125.1625503.0123.9720403.0127.3825403.0128.5920353.0118.21025353.0117.6从表1中可以看出，当萃取温度大于50度，或者小于40度，红花超临界提取物的提取率均大大降低。表2萃取压力的选择序号萃取压力(mpa)萃取温度(℃)萃取时间(h)提取率(mg/g)115403.0113.5230403.0117.2315503.0114.2430503.0112.4520503.0125.1625503.0123.9720403.0127.3825403.0128.5从表2中可以看出，当萃取压力大于25mpa，或者小于20mpa，红花超临界提取物的提取率均大大降低，小于120mg/g。表3萃取时间的选择序号萃取压力(mpa)萃取温度(℃)萃取时间(h)提取率(mg/g)120452.0115.7220452.5124.6320453.0125.2420453.5127.4520454.0125.1620454.5116.9从表3中可以看出，当萃取压力与萃取温度均在最优范围内时，萃取时间大于4.0h，或者小于2.5h时，红花超临界提取物的提取率均大大降低，均小于120mg/g。表4萃取中静态萃取和动态萃取时间的选择从表4中可以看出，采用超临界co2流体进行萃取红花粉碎物时，整个过程均采取静态萃取时，得到的红花超临界萃取物的提取率低于整个萃取过程采取静态萃取和动态萃取相结合的萃取方式。另外，需要严格控制静态萃取时间和动态萃取时间，随静态萃取时间的延长，传质逐步达到良好状态，单位时间的萃取量增加，直至达到最大值；但静态萃取时间过长时，有限的二氧化碳随着溶解物质的增多，携带物质的能力下降。在静态萃取时间一定时，动态萃取时间的长短对提取率有重要的影响，动态萃取可以不断的补充新鲜二氧化碳，使萃取器中超临界co2流体中的红花粉碎物的浓度始终较低，有利于红花中挥发性成分的萃取。同时，动态萃取还可使二氧化碳循环使用。本发明利用生物法技术完成了羟基红花黄素a高效提取工艺的构建，获得了高品质的羟基红花黄素a产品，主要技术特点为：1.1超临界流体萃取技术(scf)是一种新兴的提取技术，具有提取率高、提取温度低，产品纯度好、无有机溶剂残留等优点，特别适合脂溶性、低沸点、热敏性物质的提取。本发明采用超临界c02流体萃取技术来提取红花中的挥发油，不仅提高了提取率，还保护了药材中的其他热敏性成分，为接下来进一步从超临界萃余物里提取羟基红花黄素a打下了基础。本发明以超临界c02萃取物的萃取率为指标，对影响萃取率的主要因素，萃取压力、萃取温度、萃取时间等进行分析，确定了羟基红花黄素a萃取工艺条件。1.2本发明采用搅拌浸提法，其原理就是通过搅拌器使物料和溶剂充分接触，进行动态提取。搅拌主要使溶质从与颗粒密切接触的液体中向液体主体扩散，加快传质的速度，也使溶剂快速渗透到植物细胞中，利于植物中的有效成分溶于溶剂中。一定的温度可以加速溶质的溶解和整个扩散过程。提取的工艺条件直接关系到红花黄色素的产率和生产成本。本发明以提取率为指标研究其影响因素，有溶剂种类、提取温度、料液比、提取时间等条件，确定了羟基红花黄素a提取工艺条件。2.3本发明先采用纳滤系统分离大分子进行富集和初步纯化，然后又用大孔树脂对红花提取液对其进行进一步纯化，再经过有机溶剂精制等工艺提取得到高品质的羟基红花黄素a，提取方法操作简单，效率高，分离羟基红花黄素a纯度达到95％以上。不仅提高了产品的质量还避免了现有技术中填料昂贵和分离条件中沉降过大等问题，大大降低了产品的成本。2.4本发明制备工艺具有技术先进、工艺简单、产率高、成本低、产品纯度高等优点，有利于我国中药提取类药物的发展，提高我国中药高端生物药品的在国际的竞争力。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。当前第1页12