本发明涉及生物材料领域，特别涉及一种四氧化三铁-海藻酸钠-聚乙烯亚胺纳米复合物基因载体及其制备方法。
背景技术：
基因载体是一种将基因传递进细胞的工具，其主要作用是运载目标基因进入宿主细胞并使其能够成功进行复制和表达，广泛应用于生物医药、细胞工程、酶工程、分子生物学等领域。但是，常见的基因载体不可回收，提高了基因工程的应用成本。基因载体难以回收的主要原因在于基因载体不具有磁响应性，在完成基因转染后，无法在磁场存在的情况下被富集回收。因此，迫切需要研发一种具有磁响应性的基因载体，提高基因载体的可回收性能，降低基因转染的成本。
聚乙烯亚胺(PEI)作为阳离子基因传递载体被应用于生物医学研究，但是 PEI在提高基因转染效率的同时也增加了细胞毒性，因此其在生物体内的应用受到制约。如何实现PEI的低毒高效基因转染成为一大难题。海藻酸钠是从海带或马尾藻中提取的天然多糖，其分子由甘露糖醛酸和古洛糖醛酸按(1-4)糖苷键连接而成，具有稳定性、溶解性、粘性和安全性。海藻酸钠已经在食品工业和医药领域得到了广泛应用。海藻酸钠分子链中含有带负电的羧基基团，可以与PEI分子通过静电相互作用降低PEI分子的表面正电荷强度，从而降低PEI 的细胞毒性。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种四氧化三铁-海藻酸钠-聚乙烯亚胺多层纳米复合物基因载体，通过内层的四氧化三铁使基因载体获得磁响应性，通过海藻酸钠外壳层使基因载体具有高生物相容性，通过聚乙烯亚胺使材料获得高基因转染效率。
本发明的另一目的在于提供上述四氧化三铁-海藻酸钠-聚乙烯亚胺多层纳米复合物基因载体的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种四氧化三铁-海藻酸钠-聚乙烯亚胺多层纳米复合物基因载体，包括磁性纳米内核、包覆在磁性纳米内核外的外壳1和外壳2，磁性纳米内核和外壳1 紧密配合，外壳1和外壳2紧密配合；磁性纳米内核的材料为Fe3O4，外壳1 的材料为海藻酸钠(分子式为(C6H11NO4)m)，外壳2的材料为聚乙烯亚胺(分子式为(CH2CH2NH)n)。
上述四氧化三铁-海藻酸钠-聚乙烯亚胺多层纳米复合物基因载体的制备方法，包括下述步骤：
(1)将可溶性的二价铁盐和三价铁盐、海藻酸钠加入反应容器，然后加入水充分溶解分散；
(2)再加入氨水、环氧氯丙烷进行反应，制得含有海藻酸钠外壳1的磁性 Fe3O4；
(3)将含有海藻酸钠外壳1的磁性Fe3O4、聚乙烯亚胺(分子量为 25kDa-750kDa)和环氧氯丙烷加入反应容器中，然后加入1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐的水溶液(水分含量为1％～99％)，搅拌反应，制得具有核壳结构的四氧化三铁-海藻酸钠-聚乙烯亚胺多层纳米复合物基因载体。
步骤(1)中，二价铁盐、三价铁盐和海藻酸钠的摩尔质量比1:(1.5～5):(1～2)，其中二价铁盐、三价铁盐按铁元素的摩尔质量计，海藻酸钠按糖残基的摩尔质量计；二价铁盐优选为硫酸亚铁、硝酸亚铁、氯化亚铁；三价铁盐优选为硫酸铁、硝酸铁、氯化铁。
步骤(2)中，反应的温度为60～90℃，反应的时间为1～3小时。
步骤(2)中，环氧氯丙烷与海藻酸钠的摩尔质量比为(1～2):1，氨水与铁盐中铁元素的摩尔质量比为(3～6):1。
步骤(3)中，含有海藻酸钠外壳1的磁性Fe3O4与聚乙烯亚胺的摩尔质量比为1:(5～10)；环氧氯丙烷与聚乙烯亚胺的摩尔质量比为1:(1～2)；含有海藻酸钠外壳1的磁性Fe3O4与1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐的水溶液的质量比为 1:(20-200)。
步骤(3)中，聚乙烯亚胺的分子量为25kDa-750kDa。
步骤(3)中，搅拌反应的温度为30～60℃，时间为5min～24h。
本发明与现有技术相比具有如下优点和效果：
(1)本发明的基因载体，具有磁响应特性，增强了基因转染的可导向性，提高基因的转染效率。
(2)本发明的基因载体具有高生物相容性和高基因转染效率
(3)本发明的基因载体可以回收利用，能降低基因转染的成本。
附图说明
图1为四氧化三铁-海藻酸钠-聚乙烯亚胺多层纳米复合物基因载体的结构示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
将可溶性的氯化亚铁和氯化铁以及海藻酸钠(按氨基葡萄糖残基算)按 1mol:2.5mol:1mol加入反应容器，然后加入水充分溶解分散。在90℃下加入10 mol氨水、2mol环氧氯丙烷反应1小时，制得含有海藻酸钠外壳的磁性Fe3O4。取1mol含有海藻酸钠外壳的磁性Fe3O4、聚乙烯亚胺(5mol，分子量为25kDa) 和环氧氯丙烷(5mol)加入反应容器中，然后加入2315g 1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐的水溶液(水分含量为50％)，在30℃温度下搅拌反应24小时，制得具有核壳结构的四氧化三铁-海藻酸钠-聚乙烯亚胺多层纳米复合物基因载体。
如图1所示，四氧化三铁-海藻酸钠-聚乙烯亚胺多层纳米复合物基因载体包括磁性纳米内核、包覆在磁性纳米内核外的外壳1和外壳2，磁性纳米内核和外壳1紧密配合，外壳1和外壳2紧密配合；磁性纳米内核的材料为Fe3O4，外壳1的材料为海藻酸钠(分子式为(C6H11NO4)m)，外壳2的材料为聚乙烯亚胺 (分子式为(CH2CH2NH)n)
实施例2
将可溶性的氯化亚铁和硝酸铁以及海藻酸钠(按氨基葡萄糖残基算)按1 mol:1.5mol:2mol加入反应容器，然后加入水充分溶解分散。在60℃下加入15 mol氨水、2mol环氧氯丙烷反应1小时，得到含有海藻酸钠外壳的磁性Fe3O4。取1mol含有海藻酸钠外壳的磁性Fe3O4、聚乙烯亚胺(7mol，分子量为750kDa) 和3.5mol环氧氯丙烷加入反应容器中，然后加入4630g1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐的水溶液(水分含量为1％)，在30℃温度下搅拌反应24小时，制得具有核壳结构的四氧化三铁-海藻酸钠-聚乙烯亚胺多层纳米复合物基因载体。
实施例3
将可溶性的硝酸亚铁和硫酸铁以及海藻酸钠(按氨基葡萄糖残基算)按 1:2.2:1.5加入反应容器，然后加入水充分溶解分散。在90℃下加入氨水(氨水与铁元素摩尔比为4:1)、环氧氯丙烷(环氧氯丙烷与海藻酸钠摩尔比为1.5:1) 反应3小时，得到含有海藻酸钠外壳的磁性Fe3O4。取1mol含有海藻酸钠外壳的磁性Fe3O4、聚乙烯亚胺(5mol，分子量为25kDa)和5mol环氧氯丙烷加入反应容器中，然后加入46300g 1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐的水溶液(水分含量为99％)，在30℃温度下搅拌反应24小时，制得具有核壳结构的四氧化三铁- 海藻酸钠-聚乙烯亚胺多层纳米复合物基因载体。
实施例4
将可溶性的硝酸亚铁和氯化铁以及海藻酸钠(按氨基葡萄糖残基算)按 1:2:1.5加入反应容器，然后加入水充分溶解分散。在60℃下加入氨水(氨水与铁元素摩尔比为5:1)、环氧氯丙烷(环氧氯丙烷与海藻酸钠摩尔比为1.8:1) 反应3小时，得到含有海藻酸钠外壳的磁性Fe3O4。取1mol含有海藻酸钠外壳的磁性Fe3O4、聚乙烯亚胺(6mol，分子量为200kDa)和3mol环氧氯丙烷加入反应容器中，然后加入23150g 1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐的水溶液(水分含量为70％)，在30℃温度下搅拌反应24小时，制得具有核壳结构的四氧化三铁-海藻酸钠-聚乙烯亚胺多层纳米复合物基因载体。
实施例5
将可溶性的氯化亚铁和硫酸铁以及海藻酸钠(按氨基葡萄糖残基算)按1:2:1 加入反应容器，然后加入水充分溶解分散。在75℃下加入氨水(氨水与铁元素摩尔比为6:1)、环氧氯丙烷(环氧氯丙烷与海藻酸钠摩尔比为1.75:1)反应1 小时，得到含有海藻酸钠外壳的磁性Fe3O4。取1mol所得的含有海藻酸钠外壳的磁性Fe3O4、聚乙烯亚胺(7mol，分子量为600kDa)和7mol环氧氯丙烷加入反应容器中，然后加入2315g 1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐的水溶液(水分含量为30％)，在30℃温度下搅拌反应24小时，制得具有核壳结构的四氧化三铁- 海藻酸钠-聚乙烯亚胺多层纳米复合物基因载体。