可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法。

背景技术：

人胚胎干细胞在转化医学、再生医学以及新药筛选方面有着广阔的运用应用前景，而目前人胚胎干细胞(hESC)的培养，一般都需要小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞，但是使用这些动物源性材料会给今后临床运用带来一定的生物安全问题。此外，由于一般只能用5代之内MEF作为饲养层来培养人胚胎干细胞，而不同批次胎鼠来源的MEF之间存在差异，维持人胚胎干细胞多能性生长的能力也不一样，这些都会给人胚胎干细胞的体外长期培养带来不稳定性。虽然加拿大著名的STEMCELL公司最近研发的TeSR^TM-E8^TM是一种成分高度确定、无需饲养层细胞(feeder-free)的培养基，适用于人胚胎干细胞的培养，尽管TeSR-E8培养基能够在没有动物蛋白的情况下支持干细胞的生长，但其中添加了人血清白蛋白和人源基质蛋白，这就使得培养条件极其昂贵，不适合常规使用。因此，研究和开发可支持人胚胎干细胞生长的永生化人源性饲养层细胞对于今后人胚胎干细胞运用于临床有着重要意义。

E-cadherin(钙黏着素E)是钙依赖性黏附分子的亚族成员，是一种跨膜蛋白，广泛分布在非神经上皮组织，它与细胞内的特异性分子结合，参与同种亲和性的细胞-细胞间的黏附，胚胎发育以及正常组织中上皮细胞层的形成和维持。此外有研究显示在维持胚胎干细胞的多能性方面，E-cadherin也起着重要作用。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，制得的人源饲养层细胞可稳定转染E-cadherin基因从而稳定表达E-cadherin蛋白，而且稳定表达E-cadherin基因后不会影响TWE3R细胞的增殖能力。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，包括以下步骤：

S1、将人骨髓间充质干细胞置于MSC培养基中进行传代培养；

S2、将含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染S1中传代培养的人骨髓间充质干细胞中，然后加入hygromycin B进行筛选，得到含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓间充质干细胞；

S3、将含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染S2中含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓间充质干细胞中，然后加入G418进行筛选，得到含有hTERT基因、潮霉素抗性基因、Wnt3a基因、新霉素抗性基因的TW2R细胞；

S4、将含有E-cadherin基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒颗粒感染S3中TW2R细胞中，然后加入puromycin进行筛选，得到过表达E-cadherin的TWE3R细胞，即为人源饲养层细胞。

优选的是，所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S1中MSC培养基为每毫升培养基中含有0.08～0.1mL的胎牛血清、0.01～0.015mL的Antibiotic-Antimycotic、0.9～1.1ng的bFGF、以及余量的DMEM。

优选的是，所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S2中含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒的制备方法包括以下步骤：

A1、将293T细胞接种至预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，加入含有FBS、不含抗生素的高糖DMEM，培养24h，其中，FBS的体积分数为1％；

A2、在容器一中加入OPTI-MEM、然后依次加入hTERT RV-Vector、Gag/pol、VSV-G的病毒质粒，混匀，静置；在容器二中加入OPTI-MEM、Lipofectamine 2000，混合均匀；将容器一和容器二中的原料混合均匀；

A3、将容器一和容器二中混合后的原料加入A1中的预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，混匀，置于培养箱培养48h后，收集含有病毒颗粒的细胞上清液，浓缩，得含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒；

其中，hTERT RV-Vector、Gag/pol、VSV-G、OPTI-MEM、DMEM、Lipofectamine 2000

的质量体积比为14.9～15.1μg:5.8～6.1μg:2.8～3.2μg:1ml:18～20ml:34～36μl。

优选的是，所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S3中含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒的制备方法包括以下步骤：

B1、将293T细胞接种至预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，加入含有FBS、不含抗生素的高糖DMEM，培养24h，其中，FBS的体积分数为1％；

B2、在容器三中加入OPTI-MEM、然后依次加入Wnt3a RV-Vector、Gag/pol、VSV-G的病毒质粒，混匀，静置；在容器四中加入OPTI-MEM、Lipofectamine 2000，混合均匀；将容器三和容器四中的原料混合均匀；

B3、将容器三和容器四中混合后的原料加入B1中的预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，混匀，置于培养箱培养48h后，收集含有病毒颗粒的细胞上清液，浓缩，得含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒；

其中，Wnt3a RV-Vector、Gag/pol、VSV-G、OPTI-MEM、DMEM、Lipofectamine 2000

的质量体积比为14.9～15.1μg:5.8～6.1μg:2.8～3.2μg:1ml:18～20ml:34～36μl。

优选的是，所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S4中含有E-cadherin基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒颗粒为LV6-homo E-cadherin病毒颗粒。

优选的是，所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S1中传代培养的条件为于CO2体积浓度为5～10％、温度为36～37℃下培养60～80h。

优选的是，所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，A3中培养48h后，收集细胞上清液，然后再向混合后的原料中加入体积与A1中DMEM体积相等的的含有FBS不含抗生素的高糖DMEM，培养72h后，再次收集细胞上清液，合并两次细胞上清液，浓缩得含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒，其中，FBS的体积分数为1％。

优选的是，所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S2中使用50ug/ml的hygromycin B进行筛选；S3中使用500ug/ml的G418进行筛选；S4中使用1ug/ml的puromycin进行筛选。

优选的是，所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S1中将10⁵个人骨髓间充质干细胞置于1.9～2.1ml的MSC培养基中进行传代培养。

优选的是，所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S2中将125～250μl的含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染10⁵个S1中传代培养的人骨髓间充质干细胞中；S3中将125～250μl的含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染10⁵个S2中含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓间充质干细胞中；S4中将125～250μl的含有E-cadherin基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒颗粒感染10⁵个S3中TW2R细胞中。

本发明至少包括以下有益效果：

1、通过本发明的制备方法制得的TWE3R细胞，可稳定转染E-cadherin基因从而稳定表达E-cadherin蛋白，而且转染E-cadherin基因后不会影响TWE3R细胞的增殖能力；同时TWE3R细胞可提高H9人胚胎干细胞克隆形成率，且H9人胚胎干细胞在TWE3R细胞上连续传代培养10代后，细胞仍然保持正常未分化形态和表达人胚胎干细胞特异性标志物。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为MSC、TW2R、TWN3R和TWE3R细胞E-cadherin抗体和Wnt3a抗体细胞免疫荧光染色结果的示意图；

图2为MSC、TW2R、TWN3R和TWE3R细胞E-cadherin抗体、Wnt3a抗体和内参抗体β-tubulin的Western blot分析结果的示意图；

图3为TWN3R和TWE3R细胞扩增曲线示意图；

图4为TWE3R细胞核型分析结果的示意图；

图5为H9人胚胎干细胞分别在TW2R、TWN3R、TWE3R和MEF细胞上的克隆形成率比较示意图；

图6为H9人胚胎干细胞在TWE3R细胞上连续传代10代后的形态学和人胚胎干细胞标志物的细胞免疫荧光染色结果的示意图；

图7为H9人胚胎干细胞在TWE3R细胞上连续传代10代后的细胞核型分析结果的示意图；

图8为H9人胚胎干细胞在TWE3R细胞上连续传代10代后，体外拟胚体形成实验和NOD-SCID免疫缺陷小鼠体内畸胎瘤成瘤实验细胞免疫荧光染色结果的示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

一种可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，包括以下步骤：

S1、将人骨髓间充质干细胞置于MSC培养基中进行传代培养；人骨髓间充质干细胞即为MSC细胞；

S2、将含有hTERT基因和潮霉素(hygromycin B)抗性基因的逆转录病毒颗粒感染S1中传代培养的人骨髓间充质干细胞中，然后加入hygromycin B进行筛选，得到含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓间充质干细胞；

S3、将含有Wnt3a基因和新霉素(neomycin)抗性基因的逆转录病毒颗粒感染S2中含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓间充质干细胞中，然后加入G418进行筛选，得到含有hTERT基因、潮霉素抗性基因、Wnt3a基因、新霉素抗性基因的TW2R细胞；

S4、将含有E-cadherin基因和嘌呤霉素(puromycin)基因的慢病毒颗粒感染S3中TW2R细胞中，然后加入puromycin进行筛选，得到过表达E-cadherin的TWE3R细胞，即为人源饲养层细胞。

所述的人源饲养层细胞可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S1中MSC培养基为每毫升培养基中含有0.08mL的胎牛血清、0.01mL的Antibiotic-Antimycotic、0.9ng的bFGF、以及余量的DMEM。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S2中含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒的制备方法包括以下步骤：

A1、将293T细胞接种至预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，加入18ml含有FBS、不含抗生素的高糖DMEM，培养24h，其中，FBS的体积分数为1％；

A2、在容器一中加入1.1ml的OPTI-MEM、然后依次加入14.9μg的hTERT RV-Vector、5.8μg的Gag/pol、2.8μg的VSV-G的包装质粒，混匀，静置；在容器二中加入1.1ml的OPTI-MEM、34μl的Lipofectamine 2000，混合均匀；将容器一和容器二中的原料混合均匀；

A3、将容器一和容器二中混合后的原料加入A1中的预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，混匀，置于培养箱培养48h后，收集含有病毒颗粒的细胞上清液，浓缩，得含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S3中含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒的制备方法包括以下步骤：

B1、将293T细胞接种至预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，加入18ml含有FBS、不含抗生素的高糖DMEM，培养24h，其中，FBS的体积分数为1％；

B2、在容器三中加入1.1ml的OPTI-MEM、然后依次加入14.9μg的hTERT RV-Vector、5.8μg的Gag/pol、2.8μg的VSV-G的病毒质粒，混匀，静置；在容器四中加入1.1ml的OPTI-MEM、34μl的Lipofectamine 2000，混合均匀；将容器三和容器四中的原料混合均匀；

B3、将容器三和容器四中混合后的原料加入B1中的预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，混匀，置于培养箱培养48h后，收集含有病毒颗粒的细胞上清液，浓缩，得含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S4中含有E-cadherin基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒颗粒为LV6-homo E-cadherin病毒颗粒。所述LV6-homo E-cadherin病毒浓缩液由上海吉玛制药技术有限公司合成的。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S1中传代培养条件为于CO2体积浓度为5％、温度为36℃下培养60h。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，A3中培养48h后，收集细胞上清液，然后再向混合后的原料中加入体积与A1中DMEM体积相等的的含有FBS不含抗生素的高糖DMEM，培养72h后，再次收集细胞上清液，合并两次细胞上清液，浓缩得含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒，其中，FBS的体积分数为1％。

所述的人源饲养层细胞可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S2中使用50ug/ml的hygromycin B进行筛选；S3中使用500ug/ml的G418进行筛选；S4中使用1ug/ml的puromycin进行筛选。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S1中将10⁵个人骨髓间充质干细胞置于1.9ml的MSC培养基中进行传代培养。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S2中将125μl的含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染10⁵个S1中传代培养的人骨髓间充质干细胞中；S3中将125μl的含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染10⁵个S2中含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓间充质干细胞中；S4中将125μl的含有E-cadherin基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒颗粒感染10⁵个S3中TW2R细胞中。

实施例2

一种可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，包括以下步骤：

S1、将人骨髓间充质干细胞置于MSC培养基中进行传代培养；

S2、将含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染S1中传代培养的人骨髓间充质干细胞中，然后加入hygromycin B进行筛选，得到含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓间充质干细胞；

S3、将含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染S2中含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓间充质干细胞中，然后加入G418进行筛选，得到含有hTERT基因、潮霉素抗性基因、Wnt3a基因、新霉素抗性基因的TW2R细胞；

S4、将含有E-cadherin基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒颗粒感染S3中TW2R细胞中，然后加入puromycin进行筛选，得到过表达E-cadherin的TWE3R细胞，即为人源饲养层细胞。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S1中MSC培养基为每毫升培养基中含有0.09mL的胎牛血清、0.013mL的Antibiotic-Antimycotic、1ng的bFGF、以及余量的DMEM。

所述的人源饲养层细胞可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，其特征在于，S2中含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒的制备方法包括以下步骤：

A1、将293T细胞接种至预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，加入19ml含有FBS、不含抗生素的高糖DMEM，培养24h，其中，FBS的体积分数为1％；

A2、在容器一中加入1.2ml的OPTI-MEM、然后依次加入15μg的hTERT RV-Vector、6μg的Gag/pol、3μg的VSV-G的病毒质粒，混匀，静置；在容器二中加入1.2ml的OPTI-MEM、35μl的Lipofectamine 2000，混合均匀；将容器一和容器二中的原料混合均匀；

A3、将容器一和容器二中混合后的原料加入A1中的预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，混匀，置于培养箱培养48h后，收集含有病毒颗粒的细胞上清液，浓缩，得含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S3中含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒的制备方法包括以下步骤：

B1、将293T细胞接种至预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，加入19ml含有FBS、不含抗生素的高糖DMEM，培养24h，其中，FBS的体积分数为1％；

B2、在容器三中加入1.2ml的OPTI-MEM、然后依次加入15μg的Wnt3a RV-Vector、6μg的Gag/pol、3μg的VSV-G的病毒质粒，混匀，静置；在容器四中加入1.2ml的OPTI-MEM、35μl的Lipofectamine 2000，混合均匀；将容器三和容器四中的原料混合均匀；

B3、将容器三和容器四中混合后的原料加入B1中的预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，混匀，置于培养箱培养48h后，收集含有病毒颗粒的细胞上清液，浓缩，得含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S4中含有E-cadherin基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒颗粒为LV6-homo E-cadherin病毒颗粒。

所述的人源饲养层细胞可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S1中传代培养的条件为于CO2体积浓度为8％、温度为37℃下培养70h。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，A3中培养48h后，收集细胞上清液，然后再向混合后的原料中加入体积与A1中DMEM体积相等的的含有FBS不含抗生素的高糖DMEM，培养72h后，再次收集细胞上清液，合并两次细胞上清液，浓缩得含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒，其中，FBS的体积分数为1％。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S2中使用50ug/ml的hygromycin B进行筛选；S3中使用500ug/ml的G418进行筛选；S4中使用1ug/ml的puromycin进行筛选。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S1中将10⁵个人骨髓间充质干细胞置于2ml的MSC培养基中进行传代培养。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S2中将200μl的含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染10⁵个S1中传代培养的人骨髓间充质干细胞中；S3中将200μl的含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染10⁵个S2中含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓间充质干细胞中；S4中将200μl的含有E-cadherin基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒颗粒感染10⁵个S3中TW2R细胞中。

实施例3

一种可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，包括以下步骤：

S1、将人骨髓间充质干细胞置于MSC培养基中进行传代培养；

S2、将含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染S1中传代培养的人骨髓间充质干细胞中，然后加入hygromycin B进行筛选，得到含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓间充质干细胞；即将含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染S1中经过传代培养后的人骨髓间充质干细胞中；

S3、将含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染S2中含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓间充质干细胞中，然后加入G418进行筛选，得到含有hTERT基因、潮霉素抗性基因、Wnt3a基因、新霉素抗性基因的TW2R细胞；

S4、将含有E-cadherin基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒颗粒感染S3中TW2R细胞中，然后加入puromycin进行筛选，得到过表达E-cadherin的TWE3R细胞，即为人源饲养层细胞。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S1中MSC培养基为每毫升培养基中含有0.1mL的胎牛血清、0.015mL的Antibiotic-Antimycotic、1.1ng的bFGF、以及余量的DMEM。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S2中含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒的制备方法包括以下步骤：

A1、将293T细胞接种至预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，加入20ml含有FBS、不含抗生素的高糖DMEM，培养24h，其中，FBS的体积分数为1％；

A2、在容器一中加入1.3ml的OPTI-MEM、然后依次加入15.1μg的hTERT RV-Vector、6.1μg的Gag/pol、3.2μg的VSV-G的病毒质粒，混匀，静置；在容器二中加入1.3ml的OPTI-MEM、36μl的Lipofectamine 2000，混合均匀；将容器一和容器二中的原料混合均匀；

A3、将容器一和容器二中混合后的原料加入A1中的预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，混匀，置于培养箱培养48h后，收集含有病毒颗粒的细胞上清液，浓缩，得含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S3中含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒的制备方法包括以下步骤：

B1、将293T细胞接种至预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，加入20ml含有FBS、不含抗生素的高糖DMEM，培养24h，其中，FBS的体积分数为1％；

B2、在容器三中加入1.3ml的OPTI-MEM、然后依次加入15.1μg的Wnt3a RV-Vector、6.1μg的Gag/pol、3.2μg的VSV-G的病毒质粒，混匀，静置；在容器四中加入1.3ml的OPTI-MEM、36μl的Lipofectamine 2000，混合均匀；将容器三和容器四中的原料混合均匀；

B3、将容器三和容器四中混合后的原料加入B1中的预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，混匀，置于培养箱培养48h后，收集含有病毒颗粒的细胞上清液，浓缩，得含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S4中含有E-cadherin基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒颗粒为LV6-homo E-cadherin病毒颗粒。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S1中传代培养的条件为于CO2体积浓度为10％、温度为37℃下培养80h。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，A3中培养48h后，收集细胞上清液，然后再向混合后的原料中加入体积与A1中DMEM体积相等的的含有FBS不含抗生素的高糖DMEM，培养72h后，再次收集细胞上清液，合并两次细胞上清液，浓缩得含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒，其中，FBS的体积分数为1％。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S2中使用50ug/ml的hygromycin B进行筛选；S3中使用500ug/ml的G418进行筛选；S4中使用1ug/ml的puromycin进行筛选。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S1中将10⁵个人骨髓间充质干细胞置于2.1ml的MSC培养基中进行传代培养。

所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S2中将250μl的含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染10⁵个S1中传代培养的人骨髓间充质干细胞中；S3中将250μl的含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染10⁵个S2中含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓间充质干细胞中；S4中将250μl的含有E-cadherin基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒颗粒感染10⁵个S3中TW2R细胞中。

对比例1

TW2R细胞的制备方法同实施例1中TW2R细胞的制备方法。

对比例2

TWN3R细胞系的制备方法：将上海吉玛制药技术有限公司合成的LV6NC(空载病毒，即不含目的基因只含有抗性基因的病毒颗粒)慢病毒浓缩液加入实施例1中的S3中TW2R细胞中，然后加入puromycin进行筛选，即得过表达E-cadherin的TWN3R细胞。

分别对MSC、TW2R、TWN3R和TWE3R细胞进行生物学特性的鉴定，以下实验中用到的TW2R细胞由对比例1的方法得到，TWN3R细胞由对比例2的方法得到，TWE3R细胞由实施例1的方法得到。

1、MSC、TW2R、TWN3R、TWE3R细胞免疫荧光染色

首先将MSC、TW2R、TWN3R、TWE3R细胞分别接种于24孔板中，在细胞贴壁后，按以下步骤进行细胞的免疫荧光染色：

1)将24孔培养板中的培养基吸出，用1ml 0.01M PBS洗一遍，然后用4％的多聚甲醛固定40分钟后，用0.01M PBS洗三遍，每遍5分钟。

2)用0.3％TritonX-100作用20分钟。

3)0.01M PBS洗三遍，每遍5分钟。

4)5％正常封闭用驴血清封闭1小时。

5)加入用0.5％封闭用正常驴血清稀释抗E-Cadherin抗体(1:200稀释)和抗Wnt3a抗体(1:100稀释)，于4℃孵育过夜。

6)0.01M PBS洗三遍，每遍5分钟。

7)加入用稀释荧光二抗，于室温下孵育2小时。

8)0.01M PBS洗三遍，每遍5分钟。

9)细胞核复染：加250微升DAPI(1ng/ml)室温避光孵育5分钟，PBS洗3次，每次3分钟；

9)用10％甘油-0.01M PBS封片液封片，并用无色指甲油封闭盖玻片四周，于荧光显微镜下下观察拍照。结果如图1所示(标尺为50μm)，从图1中可知，抗Wnt3a抗体免疫荧光染色结果显示，TW2R、TWN3R和TWE3R稳定表达Wnt3a蛋白，而原代MSC不表达Wnt3a蛋白，抗E-cadherin抗体免疫荧光染色结果显示，TWE3R稳定表达E-cadherin蛋白，而MSC、TW2R和TWN3R均不表达E-cadherin蛋白。

2、MSC、TW2R、TWN3R和TWE3R细胞Western blot实验

取生长状态良好的MSC、TW2R、TWN3R和TWE3R细胞，分别加入适量RIPA蛋白裂解液(1ml裂解液加10μl 100mM PMSF，10μl 100mM cocktail)，置于冰上裂解1小时，用细胞刮将细胞刮下来，收集细胞裂解液于4℃，12000×g离心20分钟，取上清液。蛋白样品中按3:1比例加入4×蛋白电泳上样缓冲液液混匀，然后加热煮沸5-10分钟。蛋白经SDS-PAGE分离，并电转移到PVDF膜上。转移膜先在5％脱脂奶粉室温封闭1小时，然后在一抗作用下4℃孵育过夜(E-cadherin抗体(1:1000)、Wnt3a抗体(1:1000)，内参抗体β-tubulin(1:1000))，TBST洗膜洗3次，每次10分钟，洗去未结合的一抗，转移膜在抗兔抗体(1:10000)作用下室温孵育60分钟，TBST洗膜,洗3次，每次10分钟，洗去未结合的二抗后，ECL法发光，暗室曝光显影，洗片后扫描。结果如图2所示，在稳定转染Wnt3a基因后，TW2R、TWN3R和TWE3R细胞可稳定表达Wnt3a蛋白，在进一步稳定转染E-cadherin基因后TWE3R细胞开始稳定表达E-cadherin蛋白，而原代MSC细胞不表达Wnt3a蛋白和E-cadherin蛋白。

3、TWN3R和TWE3R细胞扩增实验

分别将0.5×10⁶个TWN3R、TWE3R细胞接种于两个T75细胞培养瓶中，于接种后第4天，用0.05％typsin+0.02％EDTA消化细胞并苔盼蓝染色计数活细胞数，然后再将0.5×10⁶消化获得的TWN3R和TWE3R细胞悬液分别接种于两个新的T75细胞培养瓶中，再于接种后第4天，用0.05％typsin+0.02％EDTA消化细胞并苔盼蓝染色计数活细胞数，以此类推连续传代，第n代细胞累计扩增倍数(cumulative fold of expansion)＝(第n代细胞数/第n-1代细胞数)×(第n-1代细胞数/第n-2代细胞数)×…(第1代细胞数/第0代细胞数)。

图3为TWN3R和TWE3R细胞扩增曲线示意图，从图中可知，连续传代中TWN3R和TWE3R细胞的细胞增殖曲线显示，稳定转染E-cadherin基因不会影响TWE3R细胞的增殖能力，空转对照组的TWN3R细胞和TWE3R细胞的细胞倍增时间在长期连续传代培养过程中无明显改变。

4、TWE3R细胞核型分析

在对数生长期的TWE3R细胞中加入浓度为50μg/ml秋水仙素(Colcemid)，37℃继续培养40～60min。然后DPBS洗净完全培养基，加入0.05％胰酶-EDTA消化5min，加入全血清培养基终止消化。置离心管中离心，1000r/min，3min。加入0.075mol/L KCl进行低渗处理，用吸管充分吹打后，放入37℃水浴箱中继续孵育10～15min，然后加入固定液(甲醇:冰醋酸3:1)进行预固定10min，离心弃上清。再加入固定液，固定30min，然后离心弃上清，再加入固定液，4℃固定过夜。然后将固定好的细胞悬液，滴在冰片上，立即放入75℃烤箱，3h。G显带将玻片放在预温至37℃的0.25％胰酶溶液中消化60s后，立即在生理盐水里漂洗2次，随后在Giemsa混合液中染色5min，自来水冲洗、晾干镜检。共计数30个分裂相，分析3个核型。TWE3R细胞核核型形态如图4所示，从图4中可知，核型分析结果显示，TWE3R细胞具有正常的核型。

5、不同饲养层细胞支持人胚胎干细胞的培养

为了比较不同饲养层细胞支持胚胎干细胞生长的效率，本研究比较了H9胚胎干细胞在TW2R、TWN3R、TWE3R和MEF饲养层细胞上的克隆形成效率。具体实验步骤简单介绍如下：

1)24孔板每孔250ul 0.1％明胶铺板，室温孵育1小时，PBS洗1遍；

2)将丝裂霉素处理TW2R、TWN3R、TWE3R和CF1MEF饲养层细胞分别接种到24孔板中，细胞接种密度以刚好汇合为准，过夜培养；

3)将在无饲养层细胞中培养的H9胚胎干细胞用accutase(Invitrogen公司)消化成单个细胞计数后，按1，10，100，1×10³和1×10⁴细胞密度接种到上述24孔培养板中，培养7天后，通过碱性磷酸酶染色，计数阳性克隆数，此实验重复4次，然后比较不同饲养层细胞支持胚胎干细胞克隆形成效率。实验结果如图5所示，从图5中可知，在TWE3R细胞上，不同密度的H9人胚胎干细胞克隆形成率都明显高于TW2R、TWN3R和MEF细胞，而在TW2R、TWN3R和MEF细胞之间克隆形成率无明显区别，并且TWE3R细胞可支持低密度接种条件下(5个细胞/cm2)人胚胎干细胞的克隆形成，而在其他饲养层细胞上几乎观察不到人胚胎干细胞克隆的形成。

6、人胚胎干细胞在TWE3R饲养层细胞上的长期传代培养

为了证实人胚胎干细胞可在TWE3R饲养层细胞上的长期传代培养，并维持人胚胎干细胞的生物学特性，本研究将H9人胚胎干细胞接种于丝裂霉素处理过的含有TWE3R细胞的人胚胎干细胞培养基上培养，并连续传代10代，然后分别进行细胞免疫荧光染色、核型分析、拟配体形成实验和畸胎瘤形成实验，对在TWE3R上连续传代10代的人胚胎干细胞进行生物学特性的分析。

1)H9人胚胎干细胞的细胞核型分析

其实验方法同上述TWE3R细胞核型分析实验方法一致，在实验过程中将TWE3R细胞换成H9人胚胎干细胞即可，H9人胚胎干细胞的细胞核核型形态如图7所示。

2)人胚胎干细胞培养基组成

3)人胚胎干细胞的碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AP)染色

先将已培养6天的人胚胎干细胞用0.01M PBS洗三遍，然后4％多聚甲醛室温固定40分钟，0.01M PBS洗三遍后，加入BCIP/NBT溶液(1片BCIP/NBT溶解于10ml去离子水中)，室温孵育15-20分钟，0.01M PBS洗三遍终止反应。

4)人胚胎干细胞的细胞免疫荧光染色

人胚胎干细胞的细胞免疫荧光染色步骤同TWE3R细胞免疫荧光染色实验方法，其中，抗体稀释比例如下：

上述实验结果如如图6所示(标尺为100μm)，H9人胚胎干细胞在TWE3R细胞上连续传代培养10代后，细胞仍然保持正常未分化形态，AP染色和人胚胎干细胞特异性标志物TRA-1-60、OCT4、NANOG和SSEA-4细胞免疫荧光染色均呈阳性反应。

5)人胚胎干细胞的拟胚体形成实验

将1×10⁶的在TWE3R上连续传代10代的人胚胎干细胞接种到低粘附6孔培养板的一个孔，隔天换液，8天后将形成拟胚体接种于0.1％明胶处理的24孔板，继续培养2天，然后4％多聚甲醛固定，进行免疫荧光染色，染色过程同上，抗体稀释比例如下：

Tuj-1(beta-tubulin-III) 1:1000

AFP 1:500

α-SMA 1:500

6)人胚胎干细胞的畸胎瘤形成实验

将5×10⁶个在TWE3R上连续传代10代的人胚胎干细胞用胶原酶消化，离心重悬于200ul的1:1稀释的Matrigel中，然后注射到NOD-SCID小鼠的后肢肌肉中，4-8周后，将形成的畸胎瘤取出固定，石蜡包埋后进行切片和HE染色。

上述实验结果如图8所示(标尺为100μm)，从图8中可以看出，H9人胚胎干细胞在TWE3R细胞上连续传代培养10代后，仍然具有向三个胚层分化的能力，在体外能形成拟胚体，细胞免疫荧光染色显示拟胚体中表达三胚层特异性标志物Tuj-1(beta-tubulin-III)(外胚层)、AFP(内胚层)和α-SMA(中胚层)。H9人胚胎干细胞在TWE3R细胞上连续传代培养10代后，注射到NOD-SCID免疫缺陷小鼠体内可见畸胎瘤形成，H.E染色结果显示在畸胎瘤内可见外胚层(ectoderm)、中胚层(mesoderm)和内胚层(endoderm)组织形态。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。