调节重组蛋白生产状况的方法与流程

本发明属于细胞培养领域。具体地说，本发明涉及在细胞培养基中培养表达重组蛋白的宿主细胞的方法，所述细胞培养基补充了包含有效量戊酸的补料，从而使得所述宿主细胞的活力和所述蛋白质的生产高于无戊酸补料培养的细胞。

背景技术：

过去20年中，生物制药公司致力于寻找能够促进细胞生长和重组蛋白生产力的化合物。许多作者报道称小分子添加剂对比生产力有积极影响，通常是因为它们将细胞培养物阻留在g0期[1]，这正是对生产而言最重要的相期。其中，羧酸对于培养物的表现有最大影响。它们被发现抑制hdac1活性(组蛋白去乙酰化酶1)[2]。但是，在培养过程中添加化合物，既便可能提高效价，通常会降低质量。这些化合物还会有细胞毒性和凋亡活性。因此，许多方案意图通过比较不同的羧酸并研究它们对于效价和质量的影响来寻找对蛋白质危害更低的添加剂。

所以，需要能够安全培养宿主细胞并增加重组蛋白生产的培养条件和生产方法。本发明为此提供了方法和组合物用于增加重组蛋白生产，同时改善宿主细胞活力。

发明概述

一方面，本发明提供一种增加重组蛋白生产的方法，所述方法包括在细胞培养基中培养表达所述蛋白的宿主细胞，所述细胞培养基补充了至少一份包含有效量戊酸的补料。

另一方面，本发明提供一种培养表达重组蛋白的宿主细胞的方法，所述方法包括在细胞培养基中培养所述宿主细胞，所述细胞培养基补充了至少一份包含有效量戊酸的补料。

另一方面，本发明提供一种补料组合物，其包含有效量的戊酸。

另一方面，本发明提供戊酸作为补料用于细胞培养来增加重组蛋白生产的用途。

另一方面，本发明提供戊酸作为诱导剂用于细胞培养的用途。

附图说明

图1显示用不同浓度戊酸、不同补料时机培养的表达蛋白p1的宿主细胞的活细胞密度(a)、活力(b)和效价(c)。图1a、1b和1c的图例如图1d中所述。

图2显示不同时机添加1.5mm戊酸来培养的表达抗体p2的宿主细胞的活细胞密度(a)、活力(b)和效价(c)。图2a、2b和2c的图例如图2d中所述。

两图中：va＝戊酸，wd＝工作日(即向细胞培养物中加戊酸的日子)

发明详述

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用整体纳入。

除非另外定义，本文所用科技术语的含义与本文主题所属领域的技术人员通常理解的含义相同。按照本文中的使用，提供以下定义以便理解本发明。

“包含”一词在此普遍表示包括的意思，即允许存在一项或多项特征或组分。在本申请说明书和权利要求中，“包含”可包括用“由……构成或组成”和/或“主要由……构成或组成”之类描述的类似的实施方式。

在本申请说明书和权利要求中，“一(个)”、“一(项)”和“所述”等单数形式涵盖复数意义，除非文中明确另有所指。“和/或”用于“a和/或b”之类表述时意在涵盖“a和b”、“a或b”、“a”和“b”。

术语“细胞培养”或“培养”(含复数)指细胞体外(invitro)生长和繁殖，即生物体或组织之外。适合哺乳动物细胞的培养条件是本领域周知的，例如《用于制药和细胞疗法的细胞培养技术》(cellculturetechnologyforpharmaceuticalandcell-basedtherapies)(2005)[3]中所授。哺乳动物细胞可悬浮培养或于固体基材上贴附培养。

术语“细胞培养基”或“培养基”指可培养任意类型细胞的任意培养基。“基础培养基”指含有供细胞代谢所需所有必要成份的细胞培养基。这包括例如氨基酸、脂类、碳源、维生素和矿物盐。dmem(达尔伯克改良的伊格尔培养基)、rpmi(斯维·帕克纪念研究所培养基)或f12培养基(哈姆f12(ham’sf12)培养基)是可商业途径获得的基础培养基的例子。或者，基础培养基可以是完全内部研发的专有培养基，文中亦称“化学组成明确的培养基”，其中所有成份以化学式描述且浓度已知。培养基可不含蛋白质和/或不含血清，并可根据培养的细胞所需补充其他化合物(例如氨基酸、盐、糖类、维生素、激素、生长因子)。

术语“补料培养基”或“补料(feed)”(含复数)指培养期间用作补充的培养基(或组合物)，用来补充消耗掉的营养成分和/或提供其他营养成分和/或细胞培养期间所需的其他化合物(例如用于增强或改善细胞生长和重组蛋白生产)。补料培养基可以是可通过商业途径获得的补料培养基或专有补料培养基(在此亦或化学组成明确的补料培养基)。当仅需向培养基中添加特定的化合物(例如戊酸)时，补料可以仅含该化合物，优选呈液态。

术语“生物反应器”或“培养系统”指各种可在其中培养细胞(例如灌流式、分批式或批次流加式培养)的系统。该术语包括但不限于烧瓶、静态烧瓶、旋转瓶、管、摇管、摇瓶、波袋、生物反应器、纤维生物反应器、流化床生物反应器和搅拌罐生物反应器，其中有或没有微载体。或者，“培养系统”一词还包括微量滴定板、毛细装置或多孔板。各种大小规格的生物反应器均可使用，例如从0.1毫升(0.1ml，很小规格)到20000升(20000l或20kl，大规格)，例如0.1ml、0.5ml、1ml、5ml、0.01l、0.1l、1l、2l、5l、10l、50l、100l、500l、1000l(或1kl)、2000l(或2k)、5000l(或5kl)、10000l(或10kl)、15000l(或15kl)或20000l(20kl)。

“批次流加培养”指这样一种细胞培养方法：其中有批量或连续的补料培养基补加来补充消耗掉的营养成分和/或补充其他营养成分和/或细胞培养期间所需其他化合物(例如用于增强或改善细胞生长和重组蛋白生产)。这样的细胞培养技术能够达到超过10x10⁶至30x10⁶细胞/ml数量级的高细胞密度，具体视培养基配方、细胞系及其他细胞生长条件而定。可用多种补料策略和培养基配方形成和维持双相培养条件。

也可采用灌流培育。灌流培育中，细胞接收新鲜灌流补料培养基，同时去除旧培养基。灌流可以是连续的、分步的、间歇式的，或以上全部或部分之任意组合。灌流的速度可以是每日一个工作体积以下至多个工作体积。较好的是，细胞留在培养物中且去除的旧培养基中基本不含细胞或其中的细胞含量显著低于培养物中的细胞含量。灌流可用许多细胞截留技术来实施，这包括离心、沉降或过滤[4]。

采用本发明的方法和/或细胞培养技术时，重组蛋白一般直接分泌进入培养基。一旦所述蛋白质分泌到培养基中，即可首先对此类表达系统的上清液用可商业途径获得的蛋白质浓缩过滤器进行浓缩。

本文中，“细胞密度”指一定体积培养基中的细胞数。“活细胞密度”指一定体积培养基中的活细胞数，例如据标准活力检测所得。如果细胞密度在与对照培养条件(即细胞生长所用补料不含戊酸及其他诱导剂)相差约-10％至+10％的范围内则认为细胞密度得以维持。

术语“活力”或“细胞活力”指活细胞总数与培养物中细胞总数之比。活力只要不低于培养起点值60％即认为是可以接受的(但是，可接受的阈值可视情况而定)。活力一般用来确定收获的时机。例如，批次流加培养中，可在活力达到60％或在培养14天后进行收获。

“效价”一词指溶液中物质(此处为目标重组蛋白)的量或浓度。它提示溶液被稀释而仍然留有可测量目标分子的可稀释倍数。举例来说它一般如下计算：将含有目标蛋白质的样品连续稀释(1:2、1:4、1:8、1:16等)然后用合适的检测方法(例如比色法、色谱法等)检测每个稀释度中是否存在可测水平的目标蛋白质。效价可用例如fortébio或biacore等手段来测定，如实施例部分所述，或用本领域技术人员所知任何其他手段。

“更高效价”或“生产增加”及其同义表述表示：效价相比对照培养条件提高至少10％。如果效价在与对照培养条件相差-10％至10％的范围内则认为效价得以维持。“较低效价”及其同义表述表示效价相比对照培养条件(即细胞生长所用补料不含戊酸或任何其他诱导剂)降低至少10％。

“蛋白质”在此包括肽和多肽，指包含两个或更多氨基酸残基的化合物。本发明所述蛋白质包括但不限于细胞因子、生长因子、激素、融合蛋白、抗体或其片段。治疗性蛋白质指可用于或实际用于治疗的蛋白质。

“重组蛋白”表示用重组技术生产的蛋白质。重组技术是本领域技术人员已知的[5]。

术语“抗体”包括但不限于多克隆抗体、亲和纯化的多克隆抗体、单克隆抗体和抗原结合片段，例如f(ab')2、fab蛋白水解片段和单链可变区片段(scfv)。一般来说还包括工程化完整抗体或片段，如嵌合抗体、人源化抗体、人或全人抗体、scfv和fab片段，以及合成的抗原结合性肽和多肽。

“人源化”免疫球蛋白(或“人源化抗体”)指含有人框架区和一个或多个非人(通常是小鼠或大鼠)免疫球蛋白cdr的免疫球蛋白。提供cdr的非人免疫球蛋白称为“供体”，而提供框架区的人免疫球蛋白称为“受主”(人源化可通过将非人cdr移植到人框架区和恒定区上或将完整非人可变区安装到人恒定区上(嵌合))。恒定区不是必需的，但如果存在则必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85-90％、更好约95％或更高程度相同。因此，可能除cdr和重链恒定区内某些残基(如果需要进行效应功能修饰)之外，人源化免疫球蛋白的全部组件与天然人免疫球蛋白相应组件的序列基本相同。通过抗体人源化可延长生物半衰期，并降低人给药时可能的不良免疫反应。

“全人”免疫球蛋白(或“全人”抗体)指既含人框架区又含人cdr的免疫球蛋白。恒定区不是必需的，但如果存在则必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85-90％、更好约95％或更高程度相同。因此，可能除cdr和重链恒定区内某些残基(如果需要进行效应功能或药代动力学特性修饰)之外，全人免疫球蛋白的全部组件与天然人免疫球蛋白相应组件的序列基本相同。某些情形中，可在cdr、框架区或恒定区内引入氨基酸突变来提高结合亲和力和/或降低免疫原性和/或改善抗体的生物化学/生物物理学特性。

“重组抗体”(或“重组免疫球蛋白”)表示重组技术生产的抗体。由于重组dna技术在抗体生成中的运用，重组抗体不限于天然抗体中的氨基酸序列；抗体可经重新设计而具备所需特征。此类可能的改变有很多，包括从仅改变一个或几个氨基酸到例如可变区或恒定区完全重新设计。恒定区内的改变一般用来改善、降低或改变诸如补体结合(如补体依赖性细胞毒性，cdc)、与fc受体的相互作用、其他效应功能(如抗体依赖性细胞毒性，adcc)、药代动力学特性(如与新生儿fc受体(fcrn)的结合)等特征。可变区内的改变用来改善抗原结合特征。在抗体之外，免疫球蛋白还可以许多其他形式存在，这些形式包括例如单链抗体或fv、fab和(fab')2，以及双抗、线性抗体、多价或多特异性杂交抗体。

“抗体部分”一词指完整或全长链或抗体的片段，通常是结合区或可变区。所述部分或片段应保留完整链/抗体的至少一项活性，即它们是“功能性部分”或“功能性片段”。假设它们保留了至少一项活性，则以保留靶标结合特性为佳。抗体部分(或抗体片段)的例子包括但不限于“单链fv”、“单链抗体”、“fv”或“scfv”。这些术语指单条多肽链内包含重轻两链可变区但没有恒定区的抗体片段。通常，单链抗体还含有vh域和vl域之间的多肽接头，从而令该单链抗体能够形成抗原结合所需的结构。具体实施方式中，单链抗体还可以是双特异性的和/或人源化的。

“fab片段”包含一条轻链和一条重链的可变域和ch1域。fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。含有一条轻链和一条重链并含有ch1域与ch2域之间更多恒定区因而能形成两重链间二硫键的“fab'片段”称为f(ab')2分子。“f(ab')2”含有两条轻链和两条重链，所述重链含有ch1域与ch2域之间的恒定区部分由此能在两重链之间形成二硫键。以上对重要术语进行了定义，现在重点关注本发明的具体实施方式。

可用于本发明的已知抗体的例子包括但不限于：阿达木单抗(adalimumab,阿仑单抗(alemtuzumab)、贝利单抗(belimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、康纳单抗(canakinumab)、聚乙二醇化人的塞妥珠单抗(certolizumabpegol)、西妥昔单抗(cetuximab)、地诺单抗(denosumab)、依库丽单抗(eculizumab)、戈利木单抗(golimumab)、英利昔单抗(infliximab)、那他珠单抗(natalizumab)、法木单抗(ofatumumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、司妥昔单抗(siltuximab)、托珠单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、优特克单抗(ustekinumab)或维多立单抗(vedolizomab)。

术语“诱导性物质”、“诱导剂”或“生产力增强剂”指加入细胞培养物时令蛋白质生产增加的化合物。例如，已知用于大肠杆菌(e.coli)生产的诱导剂之一是iptg(异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷)，用于cho生产的诱导剂包括但不限于丁酸钠、强力霉素或地塞米松。

“对象”包括(但不限于)哺乳动物，例如人、狗、牛、马、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔子或大鼠。较好的是，对象是人。

本发明提供增加重组蛋白生产、同时避免生产期间细胞活力降低的方法和组合物。本发明是基于针对蛋白质生产(例如抗体或抗原结合片段生产)的细胞培养条件优化，其效果是增加重组蛋白生产、同时避免生产期间细胞活力降低。

发明人出人意料地发现：培养过程中补加戊酸的细胞培养条件下，重组蛋白生产可增加(即效价提高)，并且生产期间没有发生细胞活力实质性或显著降低。因此，在细胞培养生产运行期间，意欲提高所产重组蛋白的效价时，可向细胞培养物中添加至少一份含有戊酸或由戊酸组成的补料。的确，在不同时机、按不同浓度以至少一份补料形式补充了戊酸的细胞培养物相比没有补充戊酸的类似细胞培养物(1)g0/g1细胞百分比显著提高，并且(2)效价提高。

戊酸或戊烷酸是直链烷基羧酸，化学式为c5h10o2。

本发明的一个方面提供一种增加重组蛋白生产的方法，所述方法包括：在细胞培养基中培养表达重组蛋白的宿主细胞，所述细胞培养基补充了至少一份包含有效量戊酸或由有效量戊酸组成的补料。一些优选实施方式中，给细胞培养基补充一份、两份、三份或四份包含有效量戊酸的补料。另一些优选实施方式中，包含戊酸或由戊酸组成的补料可开始于培养的第3或第4天或大致上述时间或在此前后一两天。另一些优选实施方式中，包含戊酸或由戊酸组成的补料可在以下时间或大致以下时间添加：第3天、和/或第4天、和/或第5天、和/或第6天、和/或第7天，或更晚。

或者，本发明提供培养表达重组蛋白的宿主细胞的方法，所述方法包括在细胞培养基中培养所述宿主细胞，所述细胞培养基补充了至少一份包含有效量戊酸或由有效量戊酸组成的补料。一些优选实施方式中，给细胞培养基补充一份、两份、三份或四份包含有效量戊酸或由有效量戊酸组成的补料。另一些优选实施方式中，包含戊酸或由戊酸组成的补料可开始于培养的第3或第4天或大致上述时间或在此前后一两天。另一些优选实施方式中，包含戊酸或由戊酸组成的补料可在以下时间或大致以下时间添加：第3天、和/或第4天、和/或第5天、和/或第6天、和/或第7天。

本发明的另一方面提供一种补料组合物，其包含有效量戊酸或由有效量戊酸组成。

本发明的另一方面提供戊酸作为补料或补料组分用于细胞培养来增加重组蛋白生产的用途。

本发明的另一方面提供戊酸作为蛋白质生产诱导剂用于细胞培养的用途。

就本发明整体而言，有效量的戊酸表示所述量的戊酸加入细胞培养物(或细胞培养基)作为补充(即液体形式的仅由戊酸组成的补料)或作为补料组分(即与细胞培养所需其他营养成分一起)将与没有含戊酸补料的类似宿主细胞相比以可测知的量提高宿主细胞的重组蛋白表达，并可能提高或至少维持细胞活力。培养开始时，细胞培养基中不含也不向其中补加戊酸。较好的是，戊酸作为补料或补料组分加入细胞培养物(或细胞培养基)，浓度为或约为以下所述：0.1mm至10.0mm、优选0.5mm至3.0mm、更优选约1mm至2mm，例如1.5mm。有些实施方式中，戊酸浓度可以是或约为例如0.5mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2.0mm、2.5mm或3.0mm(培养系统中培养基中出现过的戊酸浓度)。举例来说而非限定，通过调节戊酸浓度可调节(即增加)分泌型重组蛋白的生产。

就本发明整体而言，当戊酸作为补料或补料组分加入细胞培养物(或细胞培养基)时，相比没有戊酸的类似细胞生长，细胞活力没有实质性或显著降低且重组蛋白生产增加。

本文中，相比无戊酸及其他任何诱导剂条件下培养的细胞“细胞活力没有实质性或显著降低”表示与对照培养物(即不用含戊酸及其他任何诱导剂的补料培养的细胞)相比细胞活力降低不超过约15％。

就本发明目的而言，细胞培养基是适合动物细胞例如哺乳动物细胞在细胞培养物中体外(invitro)生长的培养基。细胞培养基配方是本领域周知的。可以向细胞培养基补充其他组分，例如氨基酸、盐、糖类、维生素、激素和生长因子，具体取决于培养物中细胞的需要。较好的是，细胞培养基不含动物性组分；它们可以是无血清和/或无蛋白的。

就本发明整体而言，以批次流加或连续方式给细胞培养基补充戊酸，优选批次流加方式。可以根据测得的中间效价来添加戊酸补料。

本发明整体实施方式之一中，宿主细胞优选哺乳动物宿主细胞(文中亦称哺乳动物细胞)，这包括但不限于hela、cos、3t3、骨髓瘤细胞系(例如ns0、sp2/0)和中国仓鼠卵巢(cho)细胞(如cho-s细胞和cho-k1细胞)。优选实施方式之一中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞，如cho-s细胞和cho-k1细胞。

就本发明整体而言，重组细胞(优选哺乳动物细胞)培养在培养系统例如生物反应器中。向生物反应器中接种含于培养基中的活细胞。培养开始后，优选待细胞进入静止期时向所述培养基中补充戊酸。较好的是，培养基是无血清和/或无蛋白的。接种到生产用生物反应器中后，重组细胞发生指数期生长。可用一次或多次批量补料的批次流加来维持静止期(即生产期)，所述批量补料是补充了戊酸的液态补料培养基或是由戊酸组成的液态补料。较好的是，所述补料无血清和/或无蛋白。批量补料一般在细胞接种到生物反应器中之后不久、在估计或确定细胞培养物需要补料的时候开始。例如，包含戊酸或由戊酸组成的补料可以开始于培养的第3、4、5、6或7天或大致上述时间或在此前后一两天。培养物可在生长期接受一次、两次、三次或更多次包含戊酸或由戊酸组成的批量补料。补充戊酸可以批次流加和/或连续方式进行。培养基可包含糖类(如葡萄糖)或补加糖类(如葡萄糖)。所述糖类的补加可在培养开始之时、批次流加、和/或连续补加。

本发明的方法、组合物和用途可用于多步骤培养过程来改善重组蛋白的生产。在多阶段过程中，细胞培养可分成两个或更多独特的相期。例如，首先在增强细胞繁殖和活力的条件下进行一个或多个生长期细胞培养，然后转入一个或多个生产期。在多步骤培养过程中，当由一个步骤(或相期)进入其他步骤或相期时，有些条件是会变化的：培养基组成、ph改变、温度改变，等等。生长期的温度可高于生产期。例如，生长期可先在约35℃至约38℃的第一温度进行，然后为进入生产期而改变温度为约29℃至约37℃、优选约34℃至约36.5℃的第二温度。收获之前，细胞培养物可在生产期维持数日或甚至数周。

用于本发明的细胞系(亦称“重组细胞”或“宿主细胞”)经基因工程改造而表达具有商业或科研意义的蛋白质。对细胞和/或细胞系进行基因工程改造从而表达目标多肽的方法和载体是本领域技术人员所周知的，例如ausubel等的著述(1988，及其更新[6])或sambrook等的著述(1989，及其更新[5])中所述的多种技术。本发明的方法可用来培养表达目标重组蛋白的细胞。所述重组蛋白通常分泌进入培养基，然后从培养基中将其回收。然后可用已知方法或可向商业提供者获取的产品对回收所得蛋白质进行纯化或部分纯化。然后可将经纯化的蛋白质配制成药物组合物。药物组合物的合适配方可见《雷明顿药物科学》(remington'spharmaceuticalsciences)(1995及其更新；[7])。

就本发明整体而言，重组蛋白选自：抗体或其抗原结合片段，例如人(或全人)抗体或其抗原结合部分，人源化抗体或其抗原结合部分，嵌合抗体或其抗原结合部分，融合蛋白，生长因子，激素或细胞因子。

本领域技术人员可以看出，对本文所述发明进行改变和修饰从而不同于本文具体所述是容易的。应当明白，本发明涵盖符合本发明构思或必要特征的所有这些改变和修饰。本发明还包括本文所述所有步骤、特征、组合物和化合物，不论是各别意义上还是集和意义上的，并且包括两个或更多这些步骤或特征的任意及所有组合。

因此，本文所有方面的内容均应视为是对本发明范围的说明而非限定，本发明范围由权利要求定义，且包含意义和范围等同的所有改变。

结合以下实施例可更为充分地理解以上描述。然而，这些实施例是本发明实施方法的示例，不是要限定本发明的范围。

实施例

材料与方法

i.细胞，细胞扩增和细胞生长

1)细胞

用2种cho细胞系进行试验：

-表达融合蛋白p1的cho-s细胞，在此称为“细胞p1”或“p1细胞”。“p1”是igg1融合蛋白，包含一个针对膜蛋白的部分(igg部分)，这一部分与靶向可溶性免疫蛋白的第二部分相连。它的等电点(pi)约6.3-7.0。

-表达单克隆抗体p2的cho-k1细胞，在此称为“细胞p2”或“p2细胞”。“p2”是针对细胞膜上受体的人源化单克隆抗体。它的等电点(pi)约9.20-9.40。

2)细胞扩增

在试管中于适合细胞扩增的培养基中进行细胞扩增。批次流加试验在至少扩增一周以后开始。

3)接种

接种每毫升(ml)0.2x10⁶个表达p1和p2的活细胞。

4)批次流加条件

所有试验以批次流加培养方式进行。将宿主细胞培养在微孔板(“深孔板”，“dwp”)或旋管(spin)中的批次流加系统中，于36.5℃、90％相对湿度、5％co2、320rpm振荡培养14天。

在标准生产专有培养基中制备戊酸储备液。该储备液的戊酸浓度是195mm。用该储备液对培养基进行补充，从培养一开始就测试不同浓度的戊酸(第0天，测试浓度：1、1.5和2mm)。该溶液也用作补料在批次流加过程中的不同时机(第3、4、5或7天)向培养物中补充戊酸。将该溶液用作补料时，在培养物中的目标浓度始终是1.5mm。

ii.分析方法

用guava流式细胞仪或vicell测定活细胞密度和活力。用fortébio或biacore测定抗体效价。

结果

a.p1细胞的情况

为了更好地理解戊酸用于批次流加培养的能力，对补充在培养基中(“0”时)或另外在补料中进行补充(在不同的时刻，即第3、4、5或7天)进行了测试。细胞生长受到显著影响。

在第0天使用了不同浓度。浓度越高，最大活细胞密度越小(图1a)。活力维持得比对照实验持久，但因为细胞密度低，最终效价没有改善(图1b和1c)。

当戊酸在不同的补料日添加时，其影响次日即清楚可见。与对照相比，在第3天添加戊酸时细胞生长速度下降，但在第5天或第7天添加戊酸时总体维持(图1a)。然而，如图1b所示，这对细胞活力没有影响，直到第11天。如第12天所见，培养物的活力相比对照延长了。如图1c所示，虽然第3天添加戊酸时细胞生长速度低于对照，添加戊酸对效价的影响是积极的(图1c)。不论哪天添加戊酸都可看到这样的积极影响。例如在第12天，与对照相比，第3或第7天添加戊酸的效价提高是约20％，第5天添加戊酸则是约30％。细胞直径似乎也受到影响(数据不公开)，并且与比生产力关联。如果细胞被诱导停留在g0/g1态，则他们可能会更多地把能量用于蛋白质生产。

这个实验中，可以清楚地看到，在第0天向培养基中添加戊酸没有改善过程的生产。相反，在这个时间点添加戊酸对细胞密度和效价都非常不利。就作为补料添加而言，添加的时机似乎具有重要意义，对此进行了进一步的研究。

b.p2细胞的情况

本实验中，对在第3、第4或第5天添加1.5mm戊酸进行测试。本实验用cho-k1细胞系(p2细胞)来确认戊酸具有与对cho-s细胞(p1细胞，如“a.”中所述)相同的效果。

如果在培养较早期添加戊酸，最大活细胞密度相比对照降低(图2a)。然而，相比对照，这对细胞活力没有影响(图2b)。就像前文p1细胞的情况，直至第12天，活力维持与对照相当，然后从第13天开始相比对照培养延长。这一观察结果不依赖于与戊酸添加的时机。此外，虽然直至第12天效价都与对照相当，但从第13天开始，效价相比对照持升高(图2c)。例如，第17天，与对照相比，第3或第7天添加戊酸的效价提高约25％，第5天添加戊酸的则提高约35％。结果是，细胞能够进行更长时间的生产，而这一运行过程可以进一步延长(直至第20天)。本实施例中，生产改善在第17天后变得明显，最佳条件下几乎可以达到5g/l，没有戊酸的对照培养则为0.9g/l(数据不公开)。

结论

发明人已经表明，第0天在培养基中添加戊酸不会提高过程的生产力。相反，此时添加戊酸对细胞密度和效价都非常不利。然而，令人惊讶的是，他们已经表明，第3天或之后添加戊酸作为补料时，无论细胞系或待生产的分子是什么，都可以提高效价。由于活力延长，细胞能够更长久地进行产生，甚至更多地提高蛋白质(例如抗体)的生成水平。细胞培养基中加入戊酸的确切浓度必须根据具体情况确定，尽管1.5mm似乎非常值得期待。这可以基于本发明的教导来确定，这不需要任何创造性技能。技术人员还将理解，他可以将戊酸用于生产任何蛋白质，例如抗体或融合蛋白的任何方法。

参考文献

[1]m.butler,“动物细胞培养：生物制药生产方面的最新成就与前景(animalcellcultures:recentachievementsandperspectivesintheproductionofbiopharmaceuticals),”第283–291页,2005.

[2]g.bora-tatar,d.-erden,a.s.demir,s.dalkara和k.“对作为组蛋白去乙酰化酶有效抑制剂的羧酸衍生物的生物有机和药物化学分子修饰：活性和对接研究(bioorganic&medicinalchemistrymolecularmodificationsoncarboxylicacidderivativesaspotenthistonedeacetylaseinhibitors:activityanddockingstudies)”bioorg.med.chem.,第17卷,第14期,第5219–5228页,2009.

[3]《用于制药和细胞疗法的细胞培养技术》(cellculturetechnologyforpharmaceuticalandcell-basedtherapies),sadettinozturk,wei-shouhu编辑,crc出版社(2005)

[4]voisard等，2003,biotechnol.bioeng.82:751-765

[5]sambrook等，1989及其更新，《分子克隆：实验室手册》(molecularcloning:alaboratorymanual),冷泉实验室出版社

[6]ausubel等，1988及其更新，《当代分子生物学方案》(currentprotocolsinmolecularbiology)，wiley&sons，纽约

[7]《雷明顿药物科学》(remington'spharmaceuticalsciences),1995,第18版，麦克出版公司,宾夕法尼亚州伊斯顿