本发明涉及植物保护制剂领域，具体涉及一种红藻多糖复合菌剂及其制备方法，以及所述红藻多糖复合菌液在植物保护中的应用。
背景技术：
海藻多糖是一类多组分混合物，由不同的单糖基通过糖苷键相连，是海藻细胞间和细胞内所含各种高分子碳水化合物的总称，大多含有硫酸基，多具有高粘度或凝固能力。海藻多糖根据其来源不同可分为红藻多糖、绿藻多糖和和藻多糖等。
红藻多糖是从红藻中提取得到的半乳聚糖硫酸酯，现有研究表明，红藻多糖具有增强机体细胞免疫、抗病毒、抗氧化等生物活性，广泛地应用于食品和药品领域。
目前，对于红藻多糖的研究主要集中在其抗病毒和免疫调节作用中，对于红藻多糖对植物病原菌的抑制作用研究不多。现有研究主要利用红藻多糖的成膜性来实现抗菌作用，即红藻多糖的良好成膜性能够在植物表面形成一层保护膜以隔绝病原菌侵染，但是这种抗菌作用较差，并且只能作为预防手段，对于已经感染了病原菌的植物无法起到良好的抑菌作用，需要配合其他农药使用，同样会带来农药滥用等问题。
技术实现要素：
有鉴于此，为了解决植物病原菌安全环保的防治问题，提供了一种红藻多糖复合菌剂。
为了实现上述发明目，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种红藻多糖复合菌剂，包括红藻多糖水解物、复合菌液和霍格兰氏营养液；
所述复合菌液中包括芽孢杆菌，还包括丁酸梭菌和植物乳杆菌中的一种或两种；所述复合菌液含有1.0×108～1.0×109cfu/ml的芽孢杆菌；
所述红藻多糖水解物与霍格兰氏营养液的质量体积比为15～35g:90～120ml；所述复合菌液与霍格兰氏营养液的体积比为0.5～2:0.5～2。
优选的，所述复合菌液中的总活菌数为1.0×108～3.0×109cfu/ml。
优选的，所述红藻多糖水解物的聚合度为3～12。
优选的，所述红藻多糖水解物是由坛紫菜为原料经过酸水解、氧化水解或酶解得到的水解物。
优选的，所述酸水解的方法包括以下步骤：以坛紫菜为原料提取得到红藻多糖；将所述提取得到的红藻多糖与质量分数5～10％的酸溶液混合，超声条件下水解24～48h，将所述水解产物干燥，得到聚合度为3～12的红藻多糖水解物。
优选的，所述红藻多糖与酸溶液的质量体积比为1g:50～300ml。
本发明提供了上述技术方案所述的红藻多糖复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1、将红藻多糖水解物与霍格兰氏营养液按照质量体积比混合，得到红藻多糖水解物溶液；
s2、将复合菌液与所述藻多糖水解物溶液按照复合菌液与霍格兰氏营养液的体积比混合，得到红藻多糖复合菌剂。
本发明还提供了前述技术方案所述的红藻多糖复合菌剂或上述技术方案所述制备方法得到的红藻多糖复合菌剂在植物保护中的应用。
优选的，所述植物保护包括促进植物生长和防治植物微生物病害。
优选的，所述应用的方法为：将所述红藻多糖复合菌剂直接施用于植物根系土壤或植物地上部位。
有益效果：
本发明提供了一种红藻多糖复合菌剂，包括红藻多糖水解物、复合菌液和霍格兰氏营养液；所述复合菌液中包括芽孢杆菌，还包括丁酸梭菌和植物乳杆菌中的一种或两种；所述复合菌液含有1.0×108～1.0×109cfu/ml的芽孢杆菌；所述红藻多糖水解物与霍格兰氏营养液的质量体积比为15～35g:90～120ml；所述复合菌液与霍格兰氏营养液的体积比为0.5～2:0.5～2。本发明所述红藻多糖复合菌剂将红藻多糖水解物与复合菌液进行复配作为抑菌活性物质，获得了良好的抑菌作用；霍格兰氏营养液能够为复合菌液提供稳定的生存环境以及初始繁殖的营养物质。本发明所述的红藻多糖复合菌剂对植物病原菌的抑菌效果好，安全环保，操作简单方便，成本低廉，易于大规模推广应用。
本发明所述红藻多糖复合菌剂含有的红藻多糖水解物和复合菌液还能够抑制植物根系土壤中的病原菌活性，促进有益菌的增殖，调理微生态环境，进而促进微生物对土壤有机物的分解和转化、促进腐殖质生成；还能够改善土壤透气性、透水性以及保水保肥能力，达到保护植物以及促进生长的作用。
在本发明所述的红藻多糖复合菌剂中，红藻多糖水解物主要通过自身的抑菌活性来抑制病原菌活性，红藻多糖水解物与以芽孢杆菌为主的复合菌液复配后能够促进芽孢杆菌等微生物的活性，提高复合菌液的抑菌效果。
在本发明所述的红藻多糖复合菌剂中，所述复合菌液主要起到抑菌作用，同时其中含有的芽孢杆菌与红藻多糖水解物复配后还能够增强红藻多糖水解物的抑菌作用，从而提高红藻多糖复合菌剂的抑菌效果。本发明将芽孢杆菌与丁酸梭菌和植物乳杆菌中的一种或两种复配制成复合菌液还能够改善土壤微生态结构，其中丁酸梭菌和植物乳杆菌分泌的代谢产物能够进一步提高植物根系土壤中有效物质的积累以及腐殖质的生产，提供对植物生长有促进作用的代谢产物，还能够提高构建有益菌为主的植物根系微生物菌群结构的效率。
在本发明中，所述霍格兰氏营养液主要起到溶剂作用，其ph值为弱酸性，有助于红藻多糖水解物的溶解；霍格兰氏营养液中的营养成分能够为芽孢杆菌等复合菌提供适宜的生存环境，有利于保持红藻多糖复合菌剂的抑菌性能，延长保质期。
在本发明的一些具体实施方式中，本发明以坛紫菜为提取原料制得的红藻多糖进行水解获得红藻多糖水解物，该红藻多糖水解物的抑菌效果更优、抗菌谱广，可用于抑制胡萝卜软腐欧氏杆菌，最低抑菌浓度为25mg/ml。对感染软腐欧氏杆菌的胡萝卜施用本发明所述红藻多糖复合菌剂5～7d后，治愈率即可达到60～80％，见效快。
本发明所述的红藻多糖复合菌剂还能够用于植物保护中，将所述红藻多糖复合菌剂广谱抑菌效果好，施用于土壤中能够有效抑制土壤中的多种病原微生物生长，不但能够降低植物病害的发病率，在发挥抑菌作用的同时还能够有效调节植物根系土壤中的微生物结构，促进有机质分解、产生丰富的代谢物，从而对植物起到促进生长和保护作用。
具体实施方式
本发明提供了一种红藻多糖复合菌剂，包括红藻多糖水解物、复合菌液和霍格兰氏营养液；
所述复合菌液中包括芽孢杆菌，还包括丁酸梭菌和植物乳杆菌中的一种或两种；所述复合菌液含有1.0×108～1.0×109cfu/ml的芽孢杆菌；
所述红藻多糖水解物与霍格兰氏营养液的质量体积比为15～35g:90～120ml；所述复合菌液与霍格兰氏营养液的体积比为0.5～2:0.5～2。
在本发明中，所述红藻多糖水解物与霍格兰氏营养液的质量体积比优选为25～34g:95～110ml；更优选为28～32g:100ml。在本发明中，所述复合菌液与霍格兰氏营养液的体积比更为0.8～1.5:0.8～1.5，更优选为1.0:1.0。
在本发明中，所述红藻多糖复合菌剂中的红藻多糖水解物浓度优选为25～311.1mg/ml，含有的总活菌数优选为0.2×107～2.4×109cfu/ml。
在本发明中，所述芽孢杆菌选自枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和短小芽孢杆菌中的一种或多种；更优选为枯草芽孢杆菌。本发明对所述芽孢杆菌、丁酸梭菌和植物乳杆菌的来源无特殊限定，采用市售菌剂即可。
在本发明中，所述复合菌液优选的由丁酸梭菌和植物乳杆菌中的一种或两种与芽孢杆菌组成，其中芽孢杆菌在复合菌液中的活菌数不低于1.0×108cfu/ml，对于丁酸梭菌和植物乳杆菌的加入量则无特殊限定，采取任意比例即可。在本发明所述的红藻多糖复合菌剂中，所述复合菌液主要起抑菌作用，芽孢杆菌与其中的红藻多糖水解物复配后能够增强抑菌作用。
本发明所述复合菌液中的总活菌数优选为1.0×108～3.0×109cfu/ml，更优选为1.5×108～2×109cfu/ml，进一步优选为1.5×108cfu/ml。
在本发明中，本发明所述复合菌液中除了芽孢杆菌等复合菌还含有能够溶解复合菌的溶剂，所述溶剂为任何能够溶解复合菌且不降低芽孢杆菌活性的液体，包括但不限于水、霍格兰氏营养液等，更优选为霍格兰氏营养液。
在本发明中，所述霍格兰氏营养液的组成优选为：硝酸钙945mg/l、硝酸钾607mg/l、磷酸铵115mg/l、硫酸镁493mg/l、铁盐溶液2.5ml/l、微量元素5ml/l，ph＝6.0。所述微量元素的组成为：碘化钾0.83mg/l、硼酸6.2mg/l、硫酸锰22.3mg/l、硫酸锌8.6mg/l、钼酸钠0.25mg/l、硫酸铜0.025mg/l和氯化钴0.025mg/l；所述铁盐溶液为由七水硫酸亚铁2.78质量份、乙二胺四乙酸二钠(edta.na)3.73质量份和蒸馏水500质量份组成，ph＝5.5。本发明对所述霍格兰氏营养液的来源无特殊限定，自行配制或购买市售商品均可。
在本发明所述的红藻多糖复合菌剂中，所述霍格兰氏营养液主要作用为溶剂，用以溶解红藻多糖水解物和复合菌液。霍格兰氏营养液作为溶剂还能够为芽孢杆菌等复合菌提供适宜的生存环境，为芽孢杆菌等复合菌的生存提供一定的营养物质，从而提高了红藻多糖复合菌液抑菌效果的稳定性，延长保质期。
在本发明中，所述红藻多糖水解物的聚合度优选为3～12。优选的，本发明所述红藻多糖水解物是由坛紫菜为原料提取的红藻多糖通过酸水解、氧化水解或酶解等方式得到的；进一步优选为由坛紫菜为原料提取的红藻多糖经酸水解得到的。
在一些优选的实施方式中，本发明所述酸水解制备红藻多糖水解物的方法包括：以坛紫菜为原料提取得到红藻多糖；将所述提取得到的红藻多糖与质量分数5～10％的酸溶液混合，超声条件下水解24～48h，将所述水解产物干燥，得到聚合度为3～12的红藻多糖水解物。
本发明优选的将坛紫菜为原料提取的红藻多糖与质量分数5～10％的酸溶液混合，超声处理24～48h，干燥，得到聚合度为3～12的红藻多糖水解物。
在所述优选的实施方式中，坛紫菜与质量分数5～10％的酸溶液优选的按照质量体积比1g:50～300ml混合；更优选为1g:100～200ml。在本发明中，所述酸溶液优选为醋酸溶液或盐酸溶液。本发明更优选的采用质量分数8～9％的酸溶液。
在所述优选的实施方式中，所述超声频率优选为30～35khz，更优选为32～33khz；所述超声时间优选为26～35h，更优选为28～30h。
所述超声处理后，本发明将得到的液相组分干燥，得到红藻多糖水提物。在所述优选的实施方式中，所述干燥的条件优选为：干燥温度60～80℃，更优选为70℃；干燥至物料水分含量小于15％，得到红藻多糖水解物。
本发明提供了上述技术方案所述的红藻多糖复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
s1、将红藻多糖水解物与霍格兰氏营养液按照质量体积比混合，得到红藻多糖水解物溶液；
s2、将复合菌液与红藻多糖水解物溶液按照体积比混合，得到红藻多糖复合菌剂。
具体的，本发明将红藻多糖水解物与霍格兰氏营养液按照质量体积比为15～35g:90～120ml进行混合，得到红藻多糖水解物溶液；按照复合菌液与霍格兰氏营养液体积比0.5～2:0.5～2的比例取复合菌液与红藻多糖水解物溶液混合，得到红藻多糖复合菌剂。
本发明的目的还在于提供前述技术方案所述的红藻多糖复合菌剂或上述技术方案所述制备方法得到的红藻多糖复合菌剂在植物保护中的应用。
在本发明中，所述红藻多糖复合菌剂优选的在防治植物病害和促进植物生长中进行应用。
具体来说，所述红藻多糖复合菌剂用于植物保护时，直接将红藻多糖复合菌剂施用于植物根系土壤或植物地上部位即可；所述地上部位包括但不限于植物的花、叶、果实等。在本发明中，所述红藻多糖复合菌剂优选的按照30～60ml/株对棉花施用。
本发明所述红藻多糖复合菌剂优选的作为软腐欧氏杆菌的防治制剂，当本发明所述红藻多糖复合菌剂施用于被软腐欧氏杆菌感染的作物时，治愈率高达60％以上。
本发明提供的红藻多糖复合菌剂具有广谱抑菌作用，并且抑菌活性高，当其施用于植物根系土壤时，能够抑制土壤中的众多病原微生物活性，使有益微生物处于优势地位，结合本发明所述红藻多糖复合菌剂中含有的复合菌能够有效地调理植物根系土壤的微生态环境，使植物根系土壤中的微生物菌群结构改善，进而能够促进土壤中的有机质分解速度、产生更为丰富的代谢产物，达到改善植物根系土壤环境，促进植物生长的作用。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
取150g坛紫菜按照中国专利cn201410642608.4所述方法提取红藻多糖，得到135g红藻多糖。取135g红藻多糖与15l质量分数5％的醋酸溶液混合，在30khz条件下超声24h，在60℃下干燥至得到水分低于15％的低分子量红藻多糖水解物，该红藻多糖水解物的聚合度为3～8。
取上述制备得到的红藻多糖水解物13.5g与80ml霍格兰氏营养液混合，得到质量体积分数16.875％的红藻多糖水解物溶液80ml。
取活菌数1.5×108cfu/g的枯草芽孢杆菌剂200g、0.2×108cfu/g的丁酸梭菌120g溶于320ml霍格兰氏营养液中，得到总活菌数为1.08×108cfu/ml的复合菌液320ml。
将总活菌数为1.08×108cfu/ml的复合菌液320ml与质量体积分数16.875％的红藻多糖水解物溶液80ml混合，得到400ml红藻多糖复合菌剂，其中红藻多糖水解物的含量为33.75mg/ml，总活菌数为8.64×107cfu/ml。
实施例2
取200g坛紫菜按照中国专利cn201410642608.4所述方法提取红藻多糖，得到181g红藻多糖。取181g红藻多糖与20l质量分数10％的醋酸溶液混合，在35khz条件下超声48h，在65℃下干燥至得到水分低于12％的低分子量红藻多糖水解物，该红藻多糖水解物的聚合度为4～10。
取上述制备得到的红藻多糖水解物60g与200ml霍格兰氏营养液混合，得到质量体积分数30％的红藻多糖水解物溶液200ml。
取活菌数1.6×108cfu/g的枯草芽孢杆菌剂100g、0.2×108cfu/g的丁酸梭菌100g和0.5×108cfu/g的植物乳杆菌100g溶于200ml霍格兰氏营养液中，得到总活菌数为1.15×108cfu/ml的复合菌液200ml。
将总活菌数为1.15×108cfu/ml的复合菌液200ml与质量体积分数30％的红藻多糖水解物溶液200ml混合，得到400ml红藻多糖复合菌剂，其中红藻多糖水解物的含量为150mg/ml，总活菌数为5.75×107cfu/ml。
实施例3
取160g坛紫菜按照中国专利cn201410642608.4所述方法提取红藻多糖，得到144g红藻多糖。取144g红藻多糖与14.4l质量分数6％的醋酸溶液混合，在33khz条件下超声36h，在70℃下干燥至得到水分低于10％的低分子量红藻多糖水解物，该红藻多糖水解物的聚合度为5～12。
取上述制备得到的红藻多糖水解物50g与200ml霍格兰氏营养液混合，得到质量体积分数25％的红藻多糖水解物溶液200ml。
取活菌数1.0×108cfu/g的巨大芽孢杆菌剂100g、1.5×108cfu/g的丁酸梭菌80g和0.2×108cfu/g的植物乳杆菌20g溶于100ml水中，得到总活菌数为2.24×108cfu/ml的复合菌液100ml。
将总活菌数为2.24×108cfu/ml的复合菌液100ml与质量体积分数25％的红藻多糖水解物溶液200ml混合，得到300ml红藻多糖复合菌剂，其中红藻多糖水解物的含量为166.67mg/ml，总活菌数为7.47×107cfu/ml。
实施例4
本次试验对实施例1～3得到的红藻多糖水解物抑菌浓度进行检测。
1、菌液的制备：取保存的胡萝卜软腐欧氏杆菌转接到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，37℃下恒温培养18h，对胡萝卜软腐欧氏杆菌进行活化。用接种环挑取少量菌体置于装有无菌生理盐水的试管中，振荡均匀，得到菌悬液，使菌悬液中的活菌数为103cfu/ml。取100μl菌悬液稀释到5ml，依次进行10倍逐级稀释，分别取10-8、10-9、10-10、10-11稀释倍数的菌液进行涂布实验。
2、样品的制备：分别取1g实施例1～3制备得到的红藻多糖水解物，所述水解物的聚合度在3～12之间，分别溶于10ml生理盐水溶液中，得到样品溶液。
3、抑菌试验：分别将0.1ml不同稀释倍数的菌液和0.1ml样品溶液均匀涂布于加药平板上，每个浓度设置三个平行试验；其中加药平板是加入100μl/平板的二甲基亚砜的lb固体培养基。以lb培养基作为完全空白对照组，以0.1ml不同稀释倍数的菌液和0.1ml清水涂布的加药平板作为空白对照组。
各组涂布30min后在37℃下倒置培养24h，统计菌落个数，计算抑菌浓度。
4、结果：根据统计结果，计算显示，实施例1～3制备得到的红藻多糖水解物对胡萝卜软腐欧氏杆菌最低抑菌浓度为25mg/ml。
红藻多糖水解物单独抑菌试验表明，红藻多糖水解物对胡萝卜软腐欧氏杆菌的最低抑菌浓度为25mg/ml，当红藻多糖水解物的浓度提高时其对胡萝卜软腐欧氏杆菌的抑菌效果也相应提高。
实施例5
本次试验对红藻多糖复合菌剂的抑菌效果进行验证。
取按照实施例1所述方法制备的红藻多糖复合菌剂400ml，对感染胡萝卜软腐欧氏杆菌的10株胡萝卜植株根部进行喷洒，施用前胡萝卜植株根部稍有腐烂伴有黑点，施用7d后，统计胡萝卜植株的感染情况。
结果显示，施用本发明所述的红藻多糖复合菌剂7d后，感染胡萝卜软腐欧氏杆菌的10株胡萝卜植株中有8株根部腐烂痊愈且黑点消失，，即治愈率为80％。
实施例6
本次试验对红藻多糖复合菌剂的抑菌效果进行验证。
取按照实施例2所述方法制备的红藻多糖复合菌剂400ml，对叶柄部感染胡萝卜软腐欧氏杆菌的10株胡萝卜植株叶柄部进行喷洒，施用前植株叶柄稍有腐烂和偏黄迹象，施用5d后，统计胡萝卜植株的感染情况。
结果显示，施用本发明所述的红藻多糖复合菌剂5d后，感染胡萝卜软腐欧氏杆菌的10株胡萝卜植株中有6株腐烂和偏黄迹象消失，叶柄恢复健康状态，即治愈率为60％。
由实施例5、6的试验可以看出，采用本发明提供的红藻多糖复合菌剂能够有效的对已经感染了植物病原菌的植株进行救治，治愈率可以达到60％以上。
实施例7
本次试验对红藻多糖复合菌剂作为植物保护制剂的抑菌效果进行验证。
选取历年发病较重的同一田地中生长的20株胡萝卜，分为对照组和试验组，试验前取各组胡萝卜植株根系土壤1g进行微生物分离培养，分析土壤中的微生物种类和数量。
取实施例1所述方法制备得到的红藻多糖复合菌剂400ml，喷施于试验组胡萝卜根系土壤，连续喷施7d；对照组喷施相同量的清水。7d后分别取试验组和对照组胡萝卜植株根系土壤1g进行微生物分离培养，分析土壤中的微生物种类和数量，并与试验前的结果进行对比。
结果显示，与试验前的土壤样品相比，对照组中的真菌、放线菌数量有显著提高，细菌数量无显著差异；试验组中的真菌数量有显著降低，放线菌数量与试验前土壤相差不大，细菌数量有显著升高。具体的，试验组土壤样品中的病原菌黑星菌、疫霉菌、黑粉菌、白锈菌和线虫数量有显著降低。
一般的棉花病株根系土壤的真菌数量多于健康植株，施用本发明所述的胡萝卜复合菌液后能够有效降低植物根系土壤的真菌数量，抑制病原菌活性，并能够调理植物根系土壤的微生物菌群结构，进而实现对植物的保护作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。