本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及原位杂交检测环状rnacircrnf13的试剂在制备舌鳞癌辅助诊断制剂上的应用。
背景技术：
人类基因组计划及其后续的dna元件百科全书计划(theencyclopediaofdnaelementsproject,encode)研究成果表明，蛋白编码基因序列仅占人类基因组序列的1-3％，而人类基因组中绝大部分可转录的序列为非编码rna(non-codingrna,ncrna)。非编码rna尽管不编码蛋白质，但由于广泛参与了细胞内基因表达调控，在生物医学研究领域一直备受关注。研究得较多的是线性的ncrna分子，从rna序列长短可分为微小rna(microrna,mirna,19-23nt)和长链非编码rna(longnon-codingrna,lncrnas,>200nt)，它们在包括恶性肿瘤在内的多种人类常见疾病的发生发展中发挥着重要的功能。最近，一类全新的ncrna分子，环状rna(circularrna,circrna)由于其独特的构型和被日益发现的重要生物学功能，已经成为生物医学领域新的前沿和热点。
circrna曾一度被当做基因转录后加工过程中的错误产物。和mrna及lncrna等线性rna的加工过程很相似，circrna的形成也是由剪接复合体对rna前体进行剪接加工时生成的，只不过在这一过程中，侧翼的成环序列首先结合成环，随后剪接复合体进行剪接，最终将侧翼序列切除形成circrna。近年来随着测序技术尤其是rna-seq等新一代测序技术的发展，越来越多的circrna被人们发现，并已经通过研究揭示了部分circrna在众多的生命活动中都发挥着重要的作用。此外由于其独特的结构导致circrna对核酸酶不敏感，在肿瘤标志物的开发应用方面circrna也具有明显优势，因此极有可能作为一种重要的分子标志物和新兴的药物开发的靶点。但由于本领域刚刚兴起，大部分circrna尚未被发现或者尚无研究。
舌鳞状细胞癌(tonguesquamouscellcarcinoma,tscc)是发病率最高的口腔恶性肿瘤，舌鳞癌多数为鳞癌，多发生于舌缘，其次为舌尖、舌背及舌根等处，常为溃疡型或浸润型。一般恶性程度较高，生长快，浸润性较强，常波及舌肌，致使舌运动受限，使说话、进食及吞咽均发生困难。手术治疗辅以顺铂类药物为主的化疗是舌鳞癌临床上主要的治疗方案。然而，在临床中发现舌鳞癌患者的治疗效果往往不理想，5年生存率仅为55-65％，究其原因主要在于手术残留的癌细胞(比如已经侵袭转移到了血管或淋巴管中的循环肿瘤细胞)普遍存在的耐药，导致肿瘤的复发和转移，引起治疗失败。因此，找出舌鳞癌细胞对化疗药物的抵抗机制，筛选新的药物作用靶点，最终提高患者生存率和生存质量，是值得临床科研工作者们研究的重要课题。
为了研究circrna在舌鳞癌细胞对顺铂类药物耐药中的作用和机制，我们使用agilent公司的circrna基因芯片arraystarhumancircularrnamicroarrayv2.0对两对顺铂处理前后的舌鳞癌细胞株(tca8113和cal27)中circrnas的表达情况进行了分析。我们发现circrnf13的表达变化最为显著，提示circrnf13可能和舌鳞癌的顺铂耐药相关，而到目前为止，circrnf13的生物学功能和作用机制未见任何报道。
由于基因芯片只能基于circrna环状拼接位点上下游序列设计探针，通过这些探针特异性捕获circrna，从而检测细胞或组织中circrna的表达丰度；具体对于我们通过circrna芯片发现的circrnf13来说，通过基因芯片提供的技术资料我们能查到其对应的探针共60bp，前一段是rnf13基因的8号外显子3’末端30bp的序列，而后一段则是rnf13基因2号外显子5’末端30bp，提示它是由rnf13基因转录的前体rna的2号和8号外显子首尾相连加工而成，但具体是rnf13哪几个外显子加工产生(是不是2～8号外显子全部包括在内？是否还包含内含子序列？因为有的circrna就包括内含子序列)并不清楚。随后，我们设计引物并通过两次嵌套的pcr成功克隆了circrnf13的全长序列，证实了circrnf13确实是由位于染色体3q25.1区域上的rnf13基因(ringfingerprotein13,nm_183381.2)的第2-8号外显子环化拼接形成，全长为716bp。
为了进一步研究circrnf13的生物学功能，我们设计了针对circrnf13的小分子干扰rna(sirna)序列特异性敲低了circrnf13的表达，同时成功构建了circrnf13过表达载体在舌鳞癌细胞中过表达circrnf13。mtt和流式细胞计数检测证实了上调circrnf13可以明显抑制舌鳞癌细胞增殖，其机制是阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡，而敲低circrnf13则得到了相反的结果。进一步地，我们通过诱导培养，成功地获得了舌鳞癌化疗耐药细胞株，实时定量pcr检测了细胞中circrnf13的表达水平，发现circrnf13在耐药细胞株中的表达与原始细胞株相比显著下调了；而我们在耐药细胞中过表达circrnf13，可以明显逆转舌鳞癌细胞的耐药表型，而在原始细胞株中敲低circrnf13的表达，则可以显著提高舌鳞癌细胞对顺铂的耐受。
最后，我们在舌鳞癌临床样本中通过实时荧光定量pcr和原位杂交的方法检测了circrnf13的表达情况，发现circrnf13在舌鳞癌中表达显著下调，且circrnf13表达低的患者其生存时间短于circrnf13表达高的患者，因此针对该lncrna的检测制剂也可以用于舌鳞癌的辅助诊断和预后判断。
技术实现要素：
本发明的目的是提供原位杂交检测环状rnacircrnf13的试剂在制备舌鳞癌辅助诊断制剂上的应用。所述的环状rnacircrnf13的序列如seqno:1所示。circrnf13rna序列由于是一个环状rna，序列表中只是展示了其完整数目的716bp序列，但实际该rna首尾相连，无始无终。
原位杂交检测试剂中包含用于原位杂交检测circrnf13表达的寡核苷酸探针：
tcgttgtaaaatcacctttcttgaatttat。
所述的原位杂交检测试剂为试剂盒。
试剂盒中还含有：
阳性对照探针：
gapdh探针1：5’-ccactttaccagagttaaaagcagccctgg-3’；
gapdh探针2：5’-cagtagaggcagggatgatgttctggagag-3’；
gapdh探针3：5’-gtcagaggagaccacctggtgctcagtgta-3’。
我们通过原位杂交技术在存档的舌鳞癌及癌旁对照组织中检测了circrnf13的表达，进一步证实了circrnf13在舌鳞癌活检组织中表达较低或不表达。提示circrnf13可作为舌鳞癌辅助诊断的分子标志。本发明为舌鳞癌的辅助诊断提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
附图说明
图1：通过qrt-pcr验证了circrnf13在顺铂处理后表达显著上调(左)，测序结果证实了qrt-pcr所检测的确实是circrnf13(右)。箭头代表拼接位点，箭头左侧为rnf138号外显子3’端，箭头右侧为rnf13基因2号外显子的5’端序列。
图2：通过两次嵌套pcr-测序，首次成功克隆了circrnf13分子的全长序列，证明了circrna是由位于染色体3q25.1区域上的rnf13基因转录本nm_183381.2的2-8号外显子环化拼接形成，全长为716bp。
图3：设计并成功构建circrnf13过表达载体，以pcdna3.1载体为基本骨架，通过在其cmv启动子下游加入两段成环序列以及限制性酶切位点，将rnf13的第2-8号外显子通过pcr，酶切，连接到载体中(左)，然后转染到舌鳞癌细胞中，成功地在舌鳞癌细胞中过表达了circrnf13(右)。
图4：针对circrnf13环状拼接位点(外显子8和外显子2连接处)设计了特异性靶向该环状rna的sirna序列(左)，然后转染到舌鳞癌细胞中，成功地在舌鳞癌细胞中敲低了circrnf13的表达(右)。
图5：mtt增殖实验表明与对照组(nc)相比，过表达circrnf13(oe-circrnf13)可以抑制舌鳞癌细胞的增殖，而敲低circrnf13的表达(si-circrnf13)可以促进舌鳞癌细胞的增殖。
图6：流式细胞仪分析发现与对照组(nc)相比，过表达circrnf13(oe-circrnf13)后舌鳞癌细胞g2/m期分布比例明显增高，表明细胞周期阻滞于g2/m期，而敲低circrnf13的表达(si-circrnf13)后，s期分布显著增多，表明细胞周期进程加速。
图7：流式细胞仪分析细胞凋亡情况，发现与对照组(nc)相比，过表达circrnf13(oe-circrnf13)后舌鳞癌细胞凋亡比例明显增高，正常培养情况下，肿瘤细胞凋亡比例较低，所以敲低circrnf13的表达，凋亡细胞比例稍有降低。
图8：与对照组(nc)相比化疗耐药细胞(cr)中circrnf13表达显著降低。
图9：在原始舌鳞癌细胞(nc)中敲低circrnf13的表达(si-circrnf13)或者在耐药细胞(cr)中过表达circrnf13(oe-circrnf13)后，用相同浓度的顺铂处理细胞，然后流式细胞仪检测细胞凋亡情况，发现敲低circrnf13的表达可以增加细胞对顺铂的耐受(凋亡减少)，而过表达circrnf13则可以显著降低耐药细胞的耐药性。
图10：在28对新鲜舌鳞癌活检组织(t)及癌旁对照组织(n)中通过qrt-pcr检测了circrnf13的表达水平，发现circrnf13在舌鳞癌活检组织中表达显著下调。
图11：通过原位杂交技术在存档的舌鳞癌(右)及癌旁对照组织(左)中检测了circrnf13的表达，进一步证实了circrnf13在舌鳞癌活检组织中表达较低或不表达。
图12：我们收集了88例有临床随访资料的舌鳞癌组织标本，原位杂交检测了circrnf13的表达情况，其中21例检测不到circrnf13的表达(negative)，这些患者的生存时间较其他患者(尽管circrnf13表达水平不高，但可以检测得到，positive)更短，预后更差。
具体实施方式
以下结合具体实施方式进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1，pcr测序确定了舌鳞癌细胞中circrnf13的全长序列
1.材料与方法
1.1细胞系
舌鳞癌细胞tca8113和cal27购自中南大学细胞中心，常规条件进行培养。
1.2试剂及试剂盒
trizoltmreagent(invitrogen)；胶回收试剂盒(omega)；逆转录试剂盒(promega)；蛋白酶k、dnasei、rnasin、rnasea(gbicol公司)；la
1.3荧光定量pcr检测circrnf13在舌鳞癌细胞中表达
抽提总rna，1μgrna经逆转录成cdna后，进行实时荧光定量pcr。circrnf13正向引物为5-gtccaggatagacatagagc-3，如seqno:2所示，和反向引物5-gtgtagacttgtgtggctga-3。如seqno:3所示。
用于对照的gapdh正向引物为5’-accacagtccatgccatcac-3’如seqno:4所示，和反向引物5’-tccaccaccctgttgctgta-3’，如seqno:5所示。
实时荧光定量pcr反应体系
实时荧光定量pcr反应步骤
反应结束后确认实时荧光定量pcr的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据ct值(thresholdcyclevalues)、内参基因(gapdh)标化后，采用groupt-test检验计算p值。
最后，我们将实时荧光定量pcr扩增出来的片段进行测序，对所扩增的片段进行序列比对，确证我们扩增的就是circrnf13，并获得circrnf13环化拼接的具体位点。
1.4逆转录pcr获得circrnf13全长
1)以舌鳞癌细胞tca8113cdna为模板，通过设计两对引物，进行两次相互叠加嵌套的pcr扩增全长circrnf13序列(引物设计及pcr扩增所得序列如图2所示)。circrnf13全长序列扩增引物如下：
第一次扩增，上游引物：5-gctagaagaaacagacttcgtaaa-3；如seqno:6所示；
下游引物：5-ctaatgaggtcatcagaatcaaca-3，如seqno:,7所示；
第二次扩增，上游引物：5-aatgttgattctgatgacct-3，如seqno:8所示，
下游引物：5-agattgtgtagacttgtgtgg-3，如seqno:9所示。
2)pcr扩增，circrnf13全长序列，pcr反应条件如下：
pcr反应步骤
5返回到第2步，共进行39次反应循环；
3)将pcr产物胶回收目的片段后进行测序分析。
2.结果
2.1circrnf13在顺铂处理后的舌鳞癌细胞中表达显著升高
舌鳞癌细胞经顺铂(p)处理后，我们通过实时荧光定量pcr检测了细胞中circrnf13的表达，发现与阴性对照(nc)相比circrnf13表达水平明显升高(图1，左)；我们为了确证实时荧光定量pcr检测的确实是circrnf13，我们对实时荧光定量pcr产物进行了测序分析，发现扩增片段确实是rnf13的8号外显子3’端和2号外显子5’端拼接而成，确实是一个新的circrna分子。
2.2我们扩增测序确证了circrnf13的全长序列
因为circrnf13是一个新的环状rna分子，其具体的序列，特别是在舌鳞癌中表达的转录本序列需要进一步确证。我们设计两对引物并通过两次嵌套的pcr成功克隆了circrnf13的全长序列，证实了circrnf13确实是由位于染色体3q25.1区域上的rnf13基因(ringfingerprotein13,nm_183381.2)的第2-8号外显子环化拼接形成(图2)，全长为716bp(如seqno:1所示)。
实施例2，circrnf13抑制舌鳞癌细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡
1.材料与方法
1.1试剂及试剂盒
限制性内切酶clai和sacii及t4dna连接酶等购自takara公司；trizoltmreagent(invitrogen)；质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒(omega)；逆转录试剂盒(promega)；蛋白酶k、dnasei、rnasin、rnasea(gbicol公司)；四甲基偶氮唑蓝(mtt，sigma)；抗生素g418(ameresc)；细胞周期检测试剂盒(invitrogen)、细胞凋亡检测试剂盒(invitrogene)。
1.2舌鳞癌耐药细胞的诱导培养
在细胞培养基中，添加低剂量的顺铂，并逐渐提高顺铂浓度，经过长时间诱导培养，最终获得了对顺铂耐受的耐药细胞株。
1.3circrnf13真核表达载体的构建
我们首先在pcdna3.1载体(来源于invitrogen公司)中多克隆位点处插入上、下游成环序列，即gtgctgggattacaggtgtgagctaccacccccggcccacttttt如seqno:10所示，gaaaagaattaggctcggcacggtagctcacacctgtaatcccagca如seqno:11所示)用于帮助插入片段转录加工为环状rna，这就是环状rna真核表达空白表达载体；具体构建过程如下：
根据circrna的形成机制和真核生物rna剪接的基本法则，设计出适用于circrna表达的成环序列；根据商业化载体pcdna3.1的序列信息，设计合适的多克隆位点，从而得到完整的实现circrna过表达的dna序列：
gtgctgggattacaggtgtgagctaccacccccggcccactttttcttaagcttggtaccgagctcggatccacatcgattggtggaattctgcagatatccaccgcggtggcggccgctcgagtctagagaaaagaattaggctcggcacggtagctcacacctgtaatcccagca，如seqno:12所示；
中间下划线部分为多克隆位点，两端分别为上下游成环序列；
将上述合成的实现circrna过表达的dna序列一端添加nhei酶切位点序列，另一端添加apai酶切位点序列，通过nhei和apai酶切后构建入pcdna3.1载体中，得到pccirc空白质粒(序列如seqno:13所示)，测序确认质粒正确。
为了构建circrnf13过表达载体。我们选择clai和sacii酶切位点用于酶切pccirc空白质粒(即上述构建好的插入了上、下游成环序列的pcdna3.1载体)，并将circrnf13序列插入载体的上、下游成环序列之间(图3，左)。
构建circrnf13过表达载体(即真核表达载体)步骤如下：
1)以舌鳞癌细胞tca8113cdna为模板，利用takarala
上游引物：5’-gtgattttacaacgagat-3’如seqno:14所示；
下游引物：5’-ctttcttgaatttatgta-3’如seqno:15所示；
在上、下游引物的5’端分别加上限制性内切酶clai和sacii识别位点及保护碱基后，引物序列如下：
上游：5’-aggaatcgatgtgattttacaacgagat-3’(下划线部分为clai识别位点)如seqno:16所示；
下游：5’-atgcccgcggctttcttgaatttatgta-3’(下划线部分为sacii识别位点)如seqno:17所示；
2)pcr扩增，circrnf13全长序列，pcr反应条件如下：
pcr反应步骤
3)将pcr产物电泳、胶回收目的片段后经clai和sacii双酶切后电泳，再次胶回收；
4)pccirc空白质粒经clai和sacii双酶切后电泳胶回收目的片段；
5)以t4dna连接酶连接3)和4)步胶回收产物，即可得到可用于真核表达circrnf13的载体质粒；
6)将第5)步得到的包含circrnf13全长序列的真核表达质粒转化感受态大肠杆菌，以扩增质粒。
1.4circrnf13小rna干扰序列(sirna)
我们针对circrnf13的剪接位点设计了特异性的小干扰rna(sirna,图4,左显示了sirna的位置)序列如下：
5-agaaaggugauuuuacaacga-3如seqno:18所示，
同时选择在人类基因组序列中不存在靶点的scramble序列作为sirna的对照：
scramble序列如下：
5’-gacacgcgacuuguaccac-3’。如seqno:19所示，
该序列由invitrogen公司合成。
1.5制备多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒
多聚赖氨酸包被的硅纳米颗粒是运用op-10/环己烷/氨水微乳液自组装技术进行硅纳米颗粒(silicananoparticle,sinp)的合成，并利用硅纳米颗粒的表面能和通过离子静电作用，制备多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒；所述的纳米颗粒可以由以下方法制备得到：
1)将op-10(壬基酚聚氧乙烯醚)、环己烷和氨水混合，室温搅拌均匀后加入正硅酸异酯(teos)，继续搅拌至聚合完成，加入等体积丙酮，超声分散，离心，双蒸水洗涤三次，离心收集沉淀于80℃干燥，研细得硅纳米颗粒(sinp，粒径范围10-50nm)。其中h2o与op-10及h2o与teos的摩尔比为2～10、氨水浓度为1.6～28％、teos在环己烷中的摩尔浓度为0.1～3mol/l。
2)将sinp按0.1～10mg/ml重悬于0.6mnaco3溶液中，超声分散，离心，弃上清，再将沉淀物按0.1～10mg/ml重悬于pbs(ph7.4)中，超声分散，加多聚赖氨酸(终浓度为4～15nmol/ml)，充分混匀，室温混摇；离心，弃上清，沉淀按0.1～10mg/ml重悬于双蒸水中，得到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒。
3)将改性硅纳米颗粒超声分散，每毫升纳米颗粒悬液加入10～50ugcircrnf13过表达载体或者10-100pmolsirna，混合，室温静置使其结合。
1.6细胞培养与转染
将生长状态良好的舌鳞癌细胞tca8113和cal27或者耐药细胞按2×105个细胞/孔接种于6孔板中，将6孔板置于37℃，5％co2培养箱中，待培养细胞生长至50-70％密度即可开始circrnf13过表达载体或sirna的转染；转染过程如下：
在无菌ep管中加入100μl制备好的携带circrnf13真核表达质粒或sirna的多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒悬液，与100μl无血清培养基温和混匀；用d-hank's液洗涤细胞3次；将上述混合物中加入800μl无血清培养基(无抗生素)，温和混匀后加入6孔板中的1个孔；将6孔板置于co2培养箱中，37℃培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续培养过夜。用空载体或者scramble序列的多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒作为实验对照。1.7实时荧光定量pcr检测细胞内circrnf13的表达水平
细胞处理后，在合适的时间点收集细胞，抽提总rna，1μgrna经逆转录成cdna后，进行实时荧光定量pcr。circrnf13正向引物为5-gtccaggatagacatagagc-3，如seqno:2所示，和反向引物5-gtgtagacttgtgtggctga-3。如seqno:3所示。
用于对照的gapdh正向引物为5’-accacagtccatgccatcac-3’如seqno:4所示，和反向引物5’-tccaccaccctgttgctgta-3’，如seqno:5所示。
实时荧光定量pcr反应体系
实时荧光定量pcr反应步骤
反应结束后确认实时荧光定量pcr的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据ct值(thresholdcyclevalues)、内参基因(gapdh)标化后，采用groupt-test检验计算p值。
1.8mtt细胞增殖实验
1)消化上一步得到的细胞，用细胞计数仪对细胞进行计数，将转染circrnf13和pcdna3.1空载体的细胞接种于96孔板中，每孔接种1000个细胞，每种细胞接种5孔，结果取其均值。
2)37℃，5％co2培养箱培养6小时，待细胞贴壁后，每孔加mtt液(5mg/ml)20μl。继续孵育4小时，终止培养，弃去培养液。每孔再加入150μldmso，振荡10分钟，使结晶物溶解。
3)选择490nm波长，同时设定调零孔，在酶联免疫检测仪上，测定各孔吸光度值并记录结果。
4)每隔24小时重复步骤同上，共检测6天。以吸光度值为纵坐标，间隔时间为横坐标绘制mtt曲线。
5)实验重复三次。以各时间点为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
1.9流式细胞仪分析细胞周期
1)培养细胞达到85％融合时用胰酶消化细胞，1200rpm/min离心5min，收集细胞沉淀。
2)1xpbs重悬细胞，1200rpm/min，离心5min，收集细胞。重复此步骤2次。
3)1xpbs重悬细胞，加入预冷的70％乙醇固定细胞过夜。
4)1000rcf/min，离心5min，收集细胞沉淀。
5)ph7.4pbs洗涤细胞1次，离心后加入pbs重悬细胞，并调整细胞浓度至ix106/ml。
6)加入碘化丙锭(pi)染色液(含50mg/lpi,1g/ltritonx-100，100g/lrnase)混匀，4℃避光孵育30min。
7)流式细胞仪facstar(美国bd公司)检测。接收的信号经cellquest软件处理，对检测细胞的荧光强度进行分析。实验重复3次。
1.10流式细胞仪分析细胞调亡率
1)培养细胞达到85％融合时，用胰酶消化各组细胞并收集于离心管内，同时收集各组上清悬浮细胞。注意轻轻吹打细胞，避免胰酶过度消化。
2)分别合并各组细胞并转移至离心管内，1000rpm离心5min，弃上清收集细胞，pbs轻轻重悬后，细胞计数。
3)取5～10万重悬细胞，1000rpm离心5min，弃上清，加入195ulannexinv-fitc结合液轻轻重悬细胞。
4)加入5ulannexinv，轻轻混匀。避光室温孵育10min。
5)1000rpm离心5min，弃上清，加入190ulannexinv-fitc结合液轻轻重悬细胞。
6)加入10ulpi染色液，轻轻混匀，冰浴避光。
7)随即进行流式细胞仪检测，annexinv-fitc为绿色荧光，pi为红色荧光。
2.结果
2.1circrnf13抑制舌鳞癌细胞的生长
转染circrnf13真核表达载体后，我们通过实时荧光定量pcr检测了细胞中circrnf13的表达，发现circrnf13表达水平明显升高(图3)；而转染靶向circrnf13的小干扰rna(sirna)后，细胞内circrnf13的表达水平明显下调(图4)；
与转染空载体的细胞相比，过表达circrnf13的舌鳞癌细胞tca8113和cal27的生长速度显著减慢，而利用sirna干扰序列敲低circrnf13的表达后，细胞生长速度加快(图5)。
2.2circrnf13通过阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡抑制舌鳞癌细胞的生长。
流式细胞仪分析表明，在舌鳞癌细胞中转染circrnf13后，g2/m期细胞比例显著增加，而s期细胞比例减少，表明circrnf13可将舌鳞癌细胞阻滞于g2/m期，使其细胞分裂减慢速度(图6)。同时，在舌鳞癌细胞中转染circrnf13后凋亡细胞比例明显增加(图7)，这也是circrnf13抑制舌鳞癌细胞生长的原因之一。而敲低circrnf13则得到了相反的结果。
2.3circrnf13在舌鳞癌耐药细胞中表达下调
我们通过在培养基中逐步增加顺铂浓度，经过几个月地培养，成功地诱导得到了tca8113和cal27对顺铂耐药的细胞，实时定量pcr检测了细胞中circrnf13的表达水平，发现circrnf13在耐药细胞株中的表达与原始细胞株相比显著下调了(图8)。
2.4过表达circrnf13可以逆转舌鳞癌细胞耐药表型
在原始舌鳞癌细胞(nc)中敲低circrnf13的表达(si-circrnf13)或者在耐药细胞(cr)中过表达circrnf13(oe-circrnf13)后，用相同浓度的顺铂处理细胞，然后流式细胞仪检测细胞凋亡情况，发现敲低circrnf13的表达可以增加细胞对顺铂的耐受(凋亡减少)，而过表达circrnf13则可以显著降低耐药细胞的耐药性(图9)。
实施例3，实时荧光定量pcr法检测证实circrnf13在舌鳞癌中表达下调
1.材料与方法：
收集28例舌鳞癌旁和28例舌鳞癌组织，抽提总rna，1μgrna经逆转录成cdna后，进行实时荧光定量pcr。circrnf13正向引物为5-gtccaggatagacatagagc-3，如seqno:2所示，和反向引物5-gtgtagacttgtgtggctga-3。如seqno:3所示。
用于对照的gapdh正向引物为5’-accacagtccatgccatcac-3’如seqno:4所示，和反向引物5’-tccaccaccctgttgctgta-3’，如seqno:5所示。
实时荧光定量pcr反应体系
实时荧光定量pcr反应步骤
反应结束后确认实时荧光定量pcr的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据ct值(thresholdcyclevalues)、内参基因(gapdh)标化后，采用groupt-test检验计算p值。
2.结果
circrnf13在癌旁对照组织中表达较高，而在舌鳞癌组织中表达显著降低p<0.01(图10)。
实施例4，原位杂交检测发现circrnf13在舌鳞癌中的低表达与患者不良预后相关
1.材料方法
1.1设计并合成杂交探针
为了采用原位杂交方法检测circrnf13的表达情况，我们针对circrnf13环化拼接位点(也就是rnf13基因2号外显子和8号外显子拼接处)设计了寡核苷酸探针1条，以及用做阳性对照的原位杂交寡核苷酸探针3条。
用于原位杂交检测circrnf13表达的寡核苷酸探针：tcgttgtaaaatcacctttcttgaatttat如：seqno:20所示，
阳性对照探针(检测看家基因gapdh)：
gapdh探针1：5’-ccactttaccagagttaaaagcagccctgg-3’，如seqno:21所示，
gapdh探针2：5’-cagtagaggcagggatgatgttctggagag-3’，如seqno:22所示，
gapdh探针3：5’-gtcagaggagaccacctggtgctcagtgta-3’，如seqno:23所示。
采用化学合成方法合成上述设计的各基因特异性寡核苷酸探针序列。
1.2寡核苷酸探针标记试剂盒和原位杂交检测试剂
地高辛寡核苷酸加尾试剂(digoligonucleitidetailingkit2ndgeneration，roche公司)，抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂盒(anti-digoxigenin-pod，fabfragments，roche公司)，增强原位表达检测信号的tsa信号放大系统(tsatmbiotinsystem，nel700试剂盒，perkinelmer公司)，dab染色试剂盒(北京中山公司)，20x柠檬酸钠缓冲溶液(salinesodiumcitrate,ssc)，硫酸葡聚糖(dextransulphate)，去离子甲酰胺(deionizedformamide)，多聚腺苷酸(polyadenylicacid，polya)，多聚脱氧腺苷酸(polydeoxyadenylicacid，polyda)，变性剪切的蛙精dna(denaturedandshearedsalmonspermdna，ssdna)，酵母转运rna(yeastt-rna，trna)，二硫苏糖醇(dtt)，50x邓罕氏缓冲液(denhardts’ssolution)，磷酸缓冲液(pbsbuffer)，胃蛋白酶k，牛血清白蛋白(bsa)，三乙醇胺(tea)，tnbbuffer(0.1mtris-hcl，ph7.5，0.15mnacl，0.5％blockingreagent)，tntbuffer(0.1mtris-hcl，ph7.5，0.15mnacl，0.05％tween20)，醋酸酐，阻断试剂(blockingreagentagent，roche公司)。
1.3其他主要试剂和材料
无水乙醇、90％酒精、70％酒精、50％酒精、松节油、双蒸水、pbs缓冲液(ph7.2～7.4，nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo44.3mmol/l，kh2po41.4mmol/l)；3％甲醇-双氧水溶液(80％甲醇和30％双氧水配置)；0.01mol/l柠檬酸盐缓冲液(citratebuffer,cb，ph6.0±0.1，9ml0.1m柠檬酸溶液和41ml0.1m柠檬酸钠溶液加入450ml蒸馏水中临时配置后再校正工作液ph值)；0.1％胰蛋白酶；苏木素；1％盐酸酒精(1ml浓盐酸+99ml70％酒精配置)；封片胶(ptscuremountⅱ)；专用盖玻片(480×240mm2)定制于郑州玻璃仪器厂。leica低熔点(58℃)石蜡，国产蜂蜡，无水酒精，二甲苯，10％中性多聚甲醛(0.01mol/l,ph7.4，depc双蒸水和pbs缓冲液配制)，苏木素，伊红，中性封片树胶，盖玻片，载玻片。
1.4标记探针
利用3-tailingdigolignucleutidekit进行寡核苷酸探针标记，反应体系如下。
100pmololigonucleotide+ddh2o＝9μl(control:controloligonucleutide5μl+ddh2o4μl)
混匀，稍离心。37℃水浴反应30min，加2μledta(0.2m，ph8.0)中止反应。
1.5寡核苷酸探针标记后纯化
为了增加标记探针的纯度，需对已标记的探针进行纯化，具体操作如下：
1)探针反应混合物(22μl)+2.5μl4mlicl+75μl100％冷乙醇(-20℃).
2)-70℃沉淀60min，or-20℃2h。
3)13.000×g4℃离心15min。
4)弃上清，用50μl冰冷的70％(v/v)乙醇洗涤。
5)13.000xg4℃，离心5min。
6)弃上清，真空4℃干燥。
7)用无菌双蒸水重溶探针。
1.6原位杂交检测存档石蜡切片中circrnf13的表达
石蜡切片杂交前处理
1)4℃保存的石蜡切片置于58℃烤片30min，熔化表面石蜡。
2)二甲苯依次脱蜡3×5min。
3)梯级酒精洗涤，100％酒精2×2min→95％酒精1×5min→70％酒精1×5min→50％酒精1×5min→depc水洗涤2×3min→depc-pbs洗涤2×5min。
4)滴加300μl胃蛋白酶k(10μg/ml)于切片上，37℃消化20min。
5)切片入pbs(0.1mpbs+2mg/ml谷氨酸)洗涤1min，中止反应。
6)切片入0.2nhcl，于37℃反应20-30min，增加组织的通透性。
7)切片用4％多聚甲醛(0.1mpbs溶解)后固定10min，室温。
8)为了增加组织阳性杂交强度，对切片进行乙酰处理。切片入0.25％乙酸酐bufferⅰ(0.1m三乙醇胺)，室温10min。
9)1mpbs洗涤2×5min。
预杂交和杂交
预杂交：-20℃保存的预杂交液，先置于37℃孵育60min，预杂交液的用量为50μl，石蜡膜履盖切片，37℃湿盒中预杂交2小时。(预杂交液成份包括：2xssc，10％dextransulphate，1xdenhardt’ssolution，50mmphosphatebuffer(ph7.0)，50mmdtt，250μl，100μg/mlpolya，5μg/mlpolyda，250μg/mlyeastt-rna，500μg/mlssdna，47％deionizedformamide)。
1)移去石蜡膜，甩掉预杂交液，切片置于2×ssc中5min。
2)杂交反应：37℃杂交过夜(18-20h)。每一切片加入250μl杂交液并用石蜡膜履盖。
预杂交液中加入相应的探针就成为杂交液。杂交液在预杂交时配制，放置37℃孵育，使探针充分溶解于杂交液中，本实验用多条寡核苷酸探针混合，按每一探针500ng/ml浓度配制成探针杂交液。地高辛加尾标记试剂盒标记探针浓度计算依据：每一探针的浓度按其与阳性定量探针时检测反应时显色进行比对和100pmol30个碱基的裸探针标记反应理论探针产量为900ng两种标准进行综合计算出标记探针的浓度。
3)杂交后洗涤，切片浸入2×ssc，10min，揭去石蜡膜。依次于摇床上摇动洗涤，2×ssc(0.5％sds)，2×15min→0.25×ssc(0.5％sds)，2×15min。
杂交后显色检测反应
1)采用anti-digoxigenin-pod检测地高辛探针与mrna结合复合物；tsa放大系统增强原位杂交反应显色反应的阳性信号，dab显色。
2)切片转至tnt缓冲液中，3×5min。
3)滴加tnb阻断缓冲液，300μl/tmas，室温，30min。
4)吸去多余阻断剂，1:100稀释的anti-digoxigenin-pod(tbs+0.1％tritonx-100+1％阻断剂)，室温4小时。
5)tntbuffer(0.1mtris-cl，ph7.5，0.15mnacl，0.05％tween20)洗涤，3x5min。
6)切片上滴加信号放大试剂biotinyltyamid，300μl/tmas，(biotinyltyramid贮存液：biotinyltyramid溶解于0.2mldmso，biotinyltyramid工作液：1×稀释液，1:50稀释biotinyltyramid贮存液)，室温10分钟。
7)tnt洗，3×5min。
8)切片滴加sa-hrp(链霉卵白素-辣根过氧化物酶)，300μl/tmas，室温30min。
9)tnt洗，3×5min。
10)蒸溜水洗涤，1×1min。
11)dab显色，显微镜下控制显色反应。
12)苏木素复染，
13)酒精梯级脱水，切片干燥。
14)滴加封片胶，相应规格的盖玻片盖片，紫外灯下交联切片1min。
1.7结果判断及标准
应用光学显微镜分别在低倍和高倍镜下进行观察，首先观察目标rna的阳性表达信号在观察目标细胞内的定位：位于细胞核、细胞浆或细胞膜。
再分别以该检测rna表达部位阳性信号的强度和阳性表达的细胞数两种标准进行综合评分，判断标准为：(1)依据阳性细胞染色强度判断：a.细胞无染色，记0分；b.细胞染成浅棕色为弱阳性，记1分；c.细胞染成棕色且无背景着色，或细胞染成深棕色并有浅棕色背景为中等阳性，记2分；d.细胞染成深棕色且无背景着色为强阳性，记3分。(2)依据阳性细胞表达数计分：a.无阳性细胞表达，记0分；b.阳性表达细胞数≤25％，记1分；c.25％＜阳性细胞数＜50％，记2分；d.阳性表达细胞数≥50％，记3分。
为了尽量降低评分结果的主观因素，由两位病理学专家分别按上述标准之一各自进行判断和评分，再将两者评分相乘，结果为：①0分者最终计为0分，认为阴性表达；②1分和2分者最终计为1分，认为弱阳性表达；③3分和4分者最终计为2分，认为中等阳性表达；④6分到9分者最终计为3分，认为强阳性表达。
1.8分析和统计软件
应用spss13.0统计软件对实验结果进行统计学分析，两两比较用χ2test或fisherexacttest，相关性分析采用spearmencorrelation方法；p＜0.05即差异有统计学意义。生存曲线分析采用kaplan-meiermethod及log-ranktest；多变量分析采用cox’sproportionalhazardsmodel；p＜0.05即差异有统计学意义。
2结果
2.1circrnf13在舌鳞癌中的表达比正常对照组织中的表达显著升高
circrnf13在舌鳞癌组织中不表达或者表达水平较低，而在舌鳞癌癌旁正常对照组织中有表达(图11)，两者之间具有明显的统计学差异。
2.2circrnf13低表达的舌鳞癌患者预后更差
对88例舌鳞癌患者进行了电话随访，详细询问了他们的首发时间、治疗情况、有无复发、有无再患其他疾病、复发及死亡时间等，并登记了生存时间和状态，并对舌鳞癌组织中circrnf13的表达与病人的生存时间和状态进行的生存分析，发现舌鳞癌组织中不表达circrnf13的患者平均生存时间明显短于circrnf13表达较高的患者(图12)。说明circrnf13是一个与舌鳞癌预后相关的分子标记，该circrna表达低或不表达，病人预后差。
序列表
<110>中南大学
<120>原位杂交检测环状rnacircrnf13的试剂在制备舌鳞癌辅助诊断制剂上的应用
<160>23
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>716
<212>rna
<213>智人(homosapiens)
<400>1
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ugguuauagacuuccagcugaagguuuaaaggguuuuuugauuaacucaaaaccagagaa240
ugccugugaacccauagugccuccaccaguaaaagacaauucaucuggcacuuucaucgu300
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