本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种铜绿假单胞菌的扩增引物组、应用及铜绿假单胞菌的检测方法。
背景技术：
铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa，pa)又称绿脓杆菌，属假单胞菌属，是一种需氧的革兰阴性杆菌，也是一种常见的条件致病菌。该菌存在于土壤、尘埃、水和少数人体肠道中，亦可暂时寄生于皮肤，主要寄生在肛门、生殖器部位、腋窝和外耳道等处。典型的菌株产生蓝绿色绿脓菌青素和黄绿色绿脓黄素两种色素，在正常情况下铜绿假单胞菌一般不致病，当机体抵抗力低下时可致病，还可引起病人死亡。系统性铜绿假单胞菌感染可招致败血症，患者有发热、黄疸、脾大，并可发生肺炎、泌尿系感染、脑膜炎。皮肤铜绿假单胞菌感染常发生在持续潮湿的损害部位，尤其在婴儿的脐周、烧伤的表面，在浸渍的趾蹼、外耳道及耳郭亦常发生。该菌为专性需氧菌，生长温度范围25～42℃，最适生长温度为25～30℃，临床分离培养的初步鉴别可利用该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点进行鉴别。研究表明假单胞菌引起的医院感染有增多和加重的趋势，在医院感染标本中分离率已位居第一。其中以铜绿假单胞菌为主。目前临床上对于铜绿假单胞菌分离鉴定主要依赖于传统的细菌培养和生化鉴定，该方法包括二次增菌，选择培养及后续的生化鉴定，耗时至少3天，虽然生化鉴定的结果可以依靠全自动微生物鉴定仪判读，但该方法的劣势耗时耗力依然存在，严重地拖延临床的诊断及治疗时间。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以pcr为基础的诊断技术(如普通pcr技术，荧光pcr技术)被用于铜绿假单胞菌的快速诊断，然而这些方法依赖于昂贵复杂的仪器设备及高成本的探针合成，且需要后续的电泳步骤及熟练的操作人员。一些基层实验室无法满足上述条件，因此限制了这些技术在基层的应用。此外，目前运用pcr方法和real-timepcr方法检测铜绿假单胞菌的技术，检测过程也要耗时2-4小时，也不利于快速检测和应急检测。因此，为了给予临床病人准确快速的诊断，找出特异的抗菌治疗方法，研发一个省时、省力和特异性较高的检测方法，能够快捷，敏感，特异的鉴定铜绿假单胞菌成为必要。
技术实现要素：
针对现有技术中的上述缺陷，本发明的主要目的在于提供一种铜绿假单胞菌的扩增引物组、应用及铜绿假单胞菌的检测方法，所述方法以多交叉恒温扩增(mcda)为基础，结合纳米生物检测技术，能够快捷，敏感，高特异性的鉴定铜绿假单胞菌。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种铜绿假单胞菌的扩增引物组，其特征在于：包括：如seqidno：1所示的交叉内引物cp1，如seqidno：2所示的交叉内引物cp2，如seqidno：3所示的置换引物f1，如seqidno：4所示的置换引物f2以及如seqidno：5-10所示的扩增引物d1、c1、r1、d2、c2和r2；所述扩增引物c1或c2的5’端标记生物素，得到c1*或c2*；所述扩增引物d1或d2的5’端标记半抗原，得到d1*或d2*。
作为进一步的优选，所述半抗原为异硫氰酸荧光素(fitc)。
作为进一步的优选，所述cp1包含c1区域的互补序列(cls)和p1，为5′-cls-p1；cp2包含c2区域的互补序列(c2s)和p2，为5′-c2s-p2。
所述扩增引物组用于多交叉恒温扩增铜绿假单胞菌的oprl基因。
一种检测铜绿假单胞菌的方法，包括以下步骤：
1)提取待检测铜绿假单胞菌样品的基因组；
2)提供所述铜绿假单胞菌的扩增引物组：cp1、cp2、f1、f2、d1、c1、r1、d2、c2、r2、c1*、c2*以及d1*、d2*；
3)在包括所述扩增引物组的多交叉恒温扩增反应体系下，使用待检测铜绿假单胞菌样品的基因组核酸作为模板进行恒温扩增，得到扩增产物；
4)使用金纳米生物传感器检测步骤3)的扩增产物。
作为进一步的优选，所述步骤3)恒温扩增可在60-69℃下进行。
作为进一步的优选，所述引物c1和cp1的浓度为30pmol，引物cp2的浓度为60pmol，引物f1和f2的浓度为10pmol，引物r1，r2，d1*和d2的浓度为30pmol，扩增引物c1*和c2的浓度为20pmol。
作为进一步的优选，所述多交叉恒温扩增(mcda)反应体系还包括10mm的betain，6mm的mgso4，1mm的dntp，12.5μl的10×bstdna聚合酶缓冲液，10u的链置换dna聚合酶，1μl的模板，补加去离子水至25μl。
作为进一步的优选，所述mcda反应体系的反应恒温在67℃下40min，85℃下5min终止反应。
作为进一步的优选，所述金纳米生物传感器包含样品垫，金标垫，纤维膜，吸水垫及背板；所述样品垫，金标垫，纤维膜及吸水垫依次组装在背板上，所述纤维膜上设置有检测线及控制线；将金纳米粒子偶联的链霉素亲和素(sa-g)，抗异硫氰酸荧光素抗体(anti-fitc)及生物素偶联的牛血清蛋白(b-bsa)分别包被在金标垫，检测线及控制线上。
本发明的有益效果是：本发明针对铜绿假单胞菌的特异基因oprl设计一套mcda扩增引物组：cp1、cp2、f1、f2、d1、c1、r1、d2、c2和r2；为了构建可检测产物，在引物c1或c2的5’端标记生物素(biotin)，在引物d1或d2的5’端标记半抗原，新标记的引物被命名为c1*或c2*以及d1*或d2*；上述两条交叉引物cp1和cp2是介导mcda扩增的主要引物；置换引物f1和f2置换在mcda反应中发挥置换作用，置换交叉引物cp1和cp2；六条扩增引物d1*，c1*，r1，d2*，c2*和r2能够加速mcda反应及增加mcda产物量。所述检测铜绿假单胞菌的方法针对铜绿假单胞菌特异基因oprl的扩增产物能被金纳米生物传感器可视化检测，所述方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于推广至各种特异核苷酸片段，及应用于该特异核苷酸片段对应的病原菌的临床检测。
附图说明
图1为铜绿假单胞菌oprl基因的mcda引物设计的位置和方向示意图。
图2a为mcda扩增原理示意图。
图2b为金纳米生物传感器检测示意图。
图3a-3c为mcda引物验证结果图谱。
图4a-4j为标准mcda-lfb最佳反应温度测试结果图谱。
图5a-5d为mcda-lfb检测铜绿假单胞菌的灵敏度结果图谱。
具体实施方式
本发明通过提供一种铜绿假单胞菌的扩增引物组、应用及铜绿假单胞菌的检测方法，解决了现有技术检测铜绿假单胞菌的缺陷。
为了解决上述缺陷，本发明实施例的主要思路是：
本发明实施例铜绿假单胞菌的扩增引物组，其特征在于：包括：如seqidno：1所示的交叉内引物cp1，如seqidno：2所示的交叉内引物cp2，如seqidno：3所示的置换引物f1，如seqidno：4所示的置换引物f2以及如seqidno：5-10所示的扩增引物d1、c1、r1、d2、c2和r2；所述扩增引物c1或c2的5’端标记生物素，得到c1*或c2*；所述扩增引物d1或d2的5’端标记半抗原，得到d1*或d2*。
本发明实施例检测铜绿假单胞菌的方法，包括以下步骤：
1)提取待检测铜绿假单胞菌样品的基因组；
2)提供所述铜绿假单胞菌的扩增引物组：cp1、cp2、f1、f2、d1、c1、r1、d2、c2、r2、c1*、c2*以及d1*、d2*；
3)在包括所述扩增引物组的多交叉恒温扩增反应体系下，使用待检测铜绿假单胞菌样品的基因组核酸作为模板进行恒温扩增，得到扩增产物；
4)使用金纳米生物传感器检测步骤3)的扩增产物。
本发明实施例多交叉恒温扩增(mcda)，较pcr技术而言，不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。因此，有利于实现快速扩增，便捷检测及现场诊断。
在本发明实施例中，发明人以mcda为基础，结合纳米生物检测技术开发了一种应用于铜绿假单胞菌的多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感的核酸检测技术，其是一个省时、省力和特异性较高的检测方法，能够快捷，敏感，特异的鉴定铜绿假单胞菌。
下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1、本发明实施例中所涉及的试剂及设备如下：
抗异硫氰酸荧光素抗体(anti-fitc)，金纳米粒子偶联的链霉素亲和素(sa-g)及生物素偶联的牛血清蛋白(b-bsa)购于resenbio公司。背板，样品垫，金标垫，纤维膜及吸水垫购于jie-yi公司。loopampkit(eikenchemicalco.ltd.,tokyo,japan)购于日本荣研公司。dna提取试剂盒(qiaampdnaminikits；qiagen,hilden,germany)购于德国qiagen公司。pcr反应体系混合物mix(taqdna聚合酶，dntp和缓冲液)购于北京康为世纪生物科技有限公司。dl2000dnamarker购于宝生物工程(大连)有限公司。其余试剂均为市售分型纯产品。
本发明实验中使用的主要仪器：恒温实时浊度仪la-320c(eikenchemicalco.,ltd,japan)购于日本荣研公司。pcr仪为sensoquestlabcycler,德国sensoquest产品；电泳设备为北京君意东方电泳设备有限公司产品；凝胶成像系统为bio-radgeldoxxr,美国bio-rad产品。
2.引物设计
本发明实施例针对铜绿假单胞菌的特异基因oprl设计一套mcda扩增引物，引物设计示意图见图1。引物序列及修饰见表1。
表1引物序列及修饰
a:c1*,在5’端标记生物素(biotin)，用于mcda-lfb检测体系；d1*,在5’端标记异硫氰酸荧光素(fitc)，用于mcda-lfb检测体系。
b：nt，nucleotide核苷酸；mer，monomericunit单体单元。
3.mcda扩增
标准的mcda反应体系：交叉引物cp1和cp1的浓度为30pmol,交叉引物cp2的浓度为60pmol，置换引物f1和f2的浓度为10pmol，扩增引物r1，r2，d1*和d2的浓度为30pmol，扩增引物c1*和c2的浓度为20pmol，10mm的betain，6mm的mgso4，1mm的dntp，12.5μl的10×bstdna聚合酶缓冲液，10u的链置换dna聚合酶，1μl的模板，补加去离子水至25μl。整个反应恒温在67℃40min，85℃5min终止反应。
4.生物检测器(lfb)的设计及原理
lfb的设计：如图2b所示，lfb包含五个部分，样品垫，金标垫，纤维膜，吸水垫及背板。首先将样品垫，金标垫，纤维膜及吸水垫依次组装在背板上。然后将sa-g(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)，anti-fitc(抗异硫氰酸荧光素抗体)及b-bsa(生物素偶联的牛血清蛋白)分别包被在金标垫，检测线及控制线(cl)，待干燥后备用。
lfb的检测原理：将mcda产物0.2μl直接滴加到lfb的样品垫区域，然后将120μl的检测缓冲液加到样品垫区域，mcda产物在虹吸作用下，从下往上运动(从样品垫向吸水垫方向运动)。当mcda产物达到金标垫后，双标产物的一端(即生物素标记端)与sa-g(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)反应。当产物继续运动，双标产物的另一端(即异硫氰酸荧光素标记端)与检测线区域的抗体结合，将双标产物固定在检测线区域。随着产物在检测线区域的积累，通过另一端的sa-g(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)进行显色反应，从而对mcda产物进行可视化检测。此外，过剩的sa-g(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)可与cl(质控线)区域的b-bsa(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)，进行直接显色反应，判断lfb的功能是否正常。
实施例实验结果：
(1)通过mcda扩增构建可检测产物
mcda反应体系包括10条引物，识别靶序列的10个区域，包括2条交叉内引物，即cp1和cp2(crossprimer，cp)，2条置换引物，即f1和f2，6条扩增引物，即d1，c1，r1，d2，c2和r2。为了构建可检测产物，在引物c1或c2的5’端标记生物素(biotin)，在引物d1或d2的5’端标记半抗原如异硫氰酸荧光素(fitc)，新标记的引物被命名为c1*，c2*，d1*和d2*。cp1包含cls(c1区域的互补序列)和p1，即5′-cls-p1；cp2包含c2s(c2区域的互补序列)和p2，即5′-c2s-p2。两条交叉引物cp1和cp2是介导mcda扩增的主要引物；置换引物f1和f2置换在mcda反应中发挥置换作用，置换交叉引物cp1和cp2；六条扩增引物d1*，c1*，r1，d2*，c2*和r2能够加速mcda反应及增加mcda产物量，见图2a。
为了便于理解，cp2和c2*引物在扩增示意图中被略去。在既定的恒温条件下，双链dna在处于半解离和半结合的动态平衡状态中，任何一个引物向双链dna的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。首先在bstdna聚合酶的作用下，以cp1引物p1区段的3′末端为起点，与对应的dna互补序列配对，启动链置换dna合成。f1引物与c1s前端f1s序列互补，以3′末端为起点，通过链置换活性dna聚合酶的作用，首先置换出cp1引物合成的dna链，同时合成自身dna。最终f1引物合成而得的dna链与模板dna形成双链。然而由交叉引物cp1先合成的dna链被f1引物进行链置换产生一单链，该单链的d1s，c1s，r1s，p2s，f2s区域能够依次与扩增引物d1*，c1*，r1，交叉引物cp2及置换引物f2结合，并发挥链置换扩增作用(步骤1,2)。c1*引物扩增并置换d1*的扩增链，生成短片段c1s-d1产物，该产物能够与c1*和cp1引物结合，启动链置换扩增，进入循环扩增1(步骤3和循环1)。r1引物扩增并置换c1*的扩增链，生成短片段c1s-c1产物，该产物能够与c1*和cp1引物结合，启动链置换扩增，进入循环扩增1(步骤4和循环2)。在循环扩增2中，随着mcda扩增的进行，大量的双标产物被形成，c1*端标记生物素，d1*端标记异硫氰酸荧光素(图2a)。该双标的产物能被金纳米生物传感器检测，从而进行可视检测(图2b)。此外，由于cp2和c2*的扩增过程与cp1和c1*的扩增过程相似，在mcda扩增体系中，同样能够形成大量的双标的可检测产物。c2*端标记生物素，d2*端标记异硫氰酸荧光素。该双标的产物也能被金纳米生物传感器(lfb)检测，从而进行可视检测。因此，在利用mcda-lfb技术进行靶序列检测时，可利用c1*和d1*引物构建可检测产物，也可利用c2*和d2*引物构建可检测产物。
(2)验证mcda引物的可行性
mcda扩增之后，三种检测方法用于mcda扩增结果的判别(图3a-3c)，首先，在反应混合物中加入可视染料(如孔雀石绿(malachitegreen，mg)试剂)，阳性反应管从无色或浅蓝色变为蓝色，阴性反应保持无色或浅蓝色不变。其次，mcda产物可以通过琼脂糖电泳后检测扩增子，由于产物中包含了不同大小的扩增片段，因此阳性扩增产物的电泳图呈特异性阶梯状，阴性反应不出现任何条带。更为直接简单的方法为通过lfb对产物进行检测。
可视颜色变化法：mcda在合成dna的同时产生大量的焦磷酸根离子，该离子能够夺取与钙黄绿素结合的锰离子，使钙黄绿素恢复游离状态而发荧光。该发光混合物能够与反应中产生的镁离子结合，使荧光得到增强。可以通过荧光目视检测颜色变化判读结果，阳性反应管从无色或浅蓝色变为蓝色，阴性反应保持无色或浅蓝色不变，见图3a。a1表示阳性扩增(反应管中加入10pg的铜绿假单胞菌模板，作为阳性对照)，a2表示阴性扩增(反应管中加入10pg的肺炎克雷伯菌模板，作用阴性对照)，a3表示阴性扩增(反应管中加入10pg的表皮葡萄球菌模板，作用阴性对照)，a4表示空白对照反应(1微升的双蒸水代替10pg的模板，作为空白对照)。只有阳性对照出现阳性扩增，说明针对oprl设计的检测铜绿假单胞菌的mcda引物可用。
电泳检测法：将图3a的产物进行电泳检测，由于mcda的扩增产物包含了许多大小不一的短片段及一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的dna片段混合物，电泳后在凝胶上显现不同大小区带组成的阶梯式图谱，见图3b。通过电泳检测法判读mcda扩增结果，阳性反应出现了预期的结果，而阴性反应和空白对照未出现任何扩增条带，进一步验证了本研究所设计的mcda引物可行，用于靶序列扩增检测。
lfb检测：将图3a的产物进行lfb检测。由于针对铜绿假单胞菌检测的mcda引物标记的半抗原为fitc(异硫氰酸荧光素)，因此，当tl和cl出现红色条带时表示为铜绿假单胞菌检测阳性。通过lfb检测法判读mcda扩增结果，阳性反应出现了预期的结果，而阴性反应和空白对照仅出现cl红色条带，验证了本研究所设计的lfb，mcda-lfb技术及mcda引物可行，能够用于目的靶序列的检测(图3c)。
(3)测定mcda技术的最佳反应温度
在标准反应体系条件下，加入针对铜绿假单胞菌dna模板及所设计的对应的mcda引物，其模板浓度为10pg/ul。反应在不同的恒温条件下进行(60-69℃)，结果运用实时浊度仪进行检测，可得到针对oprl检测铜绿假单胞菌的mcda引物的扩增动态曲线图(图4a-4j)。如图4a-4j所示，在不同的温度下均可见到稳健的扩增曲线。根据扩增曲线峰出现的最早时间，推荐67℃作为适宜于本次专利涉及的mcda引物扩增的最佳反应温度。
(4)mcda-lfb检测铜绿假单胞菌的灵敏度
运用连续稀释好的铜绿假单胞菌基因组dna进行标准的mcda扩增反应后，4种检测方法用于mcda扩增结果判别。
首先，在反应混合物中加入可视染料(如孔雀石绿(malachitegreen，mg)试剂)，阳性反应管的颜色从无色变为蓝色，阴性反应管则保持原来的无色。检测显示：p.aeruginosa-mcda的检测范围可低至10ng～10fg，阳性扩增管变为蓝色，(5a1-5a5)。而当反应体系中无铜绿假单胞菌基因组模板时，反应不出现颜色变化，仍然为无色，表示阴性结果(5a6-5a8)。图5a运用可视法读取mcda扩增结果；5a1到5a5表示铜绿假单胞菌的模板量为10ng,10pg,1pg,100fg,10fg；5a6，5a7,5a8分别表示肺炎克雷伯菌(10pg)，表皮葡萄球菌(10pg)，空白对照(1微升双蒸水)。
其次，mcda产物可以通过琼脂糖电泳后检测扩增子，由于产物中包含了不同大小的扩增片段，因此阳性扩增产物的电泳图呈特异性阶梯状，阴性反应不出现任何条带。检测显示：p.aeruginosa-mcda的检测范围可低至10ng～10fg，阳性反应出现阶梯条带，(5b1-5b5)。而当反应体系中无铜绿假单胞菌基因组模板时，不出现特异的阶梯条带，表示阴性结果(5b6-5b8)。图5b运用电泳法读取mcda扩增结果；5b1到5b5表示铜绿假单胞菌的模板量为10ng,10pg,1pg,100fg,10fg；5b6，5b7,5b8分别表示肺炎克雷伯菌(10pg)，表皮葡萄球菌(10pg)，空白对照(1微升双蒸水)。
其三，mcda产物，运用lfb检测显示：p.aeruginosa-mcda-lfb的检测范围可低至10ng～10fg，lfb在tl和cl区域出现红色线(5c)。而当反应体系中无铜绿假单胞菌基因组模板时，lfb仅在cl区域出现红色线，表示阴性结果(5c6-5c8)。图5c运用lfb可视化读取mcda扩增结果；5c1到5c5表示铜绿假单胞菌的模板量为10ng,10pg,1pg,100fg,10fg；5c6，5c7,5c8分别表示肺炎克雷伯菌(10pg)，表皮葡萄球菌(10pg)，空白对照(1微升双蒸水)。
其四，实时浊度仪用于分析mcda扩增(图5d)。连续稀释好的铜绿假单胞菌基因组dna进行标准的mcda扩增反应同时，运用实时浊度仪实时监测扩增情况，结果显示：p.aeruginosa-mcda的检测范围可低至10ng～10fg，阳性扩增浊度曲线被观察到(5d1-5d5)。而当反应体系中无铜绿假单胞菌基因组模板时，不出现阳性扩增浊度曲线，表示阴性结果(5d6-5d8)。图5d运用实时浊度仪可视化读取mcda扩增结果；5d1到5d5表示铜绿假单胞菌的模板量为10ng,10pg,1pg,100fg,10fg；5d6，5d7,5d8分别表示表示肺炎克雷伯菌(10pg)，表皮葡萄球菌(10pg)，空白对照(1微升双蒸水)。
(5)测定mcda-lfb技术的特异性
以常见的致病菌及条件致病菌dna(铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、无乳链球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌等)为模板评价mcda-lfb技术的特异性。(菌株信息及检测结果详见表2)。mcda-lfb技术能准确的鉴别铜绿假单胞菌，说明mcda-lfb方法的特异性良好。
本发明实施例实验中所用菌株如表2所示，或从商业途径获得。
表2菌株来源及特异性检测结果
上述本申请实施例中的技术方案，至少具有如下的技术效果或优点：
本发明实施例针对铜绿假单胞菌的特异基因oprl设计一套mcda扩增引物：cp1、cp2、f1、f2、d1、c1、r1、d2、c2和r2；为了构建可检测产物，在引物c1或c2的5’端标记生物素(biotin)，在引物d1或d2的5’端标记半抗原，新标记的引物被命名为c1*，c2*，d1*和d2*；上述两条交叉引物cp1和cp2是介导mcda扩增的主要引物；置换引物f1和f2置换在mcda反应中发挥置换作用，置换交叉引物cp1和cp2；六条扩增引物d1*，c1*，r1，d2*，c2*和r2能够加速mcda反应及增加mcda产物量。所述检测铜绿假单胞菌的方法针对铜绿假单胞菌特异基因oprl的扩增产物能被金纳米生物传感器可视化检测，所述方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于推广至各种特异核苷酸片段，及应用于该特异核苷酸片段对应的病原菌的临床检测。
以上内容已经用一般性说明及具体的实施结果对本发明做了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所作的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>北京大学首钢医院
<120>一种铜绿假单胞菌的扩增引物组、应用及铜绿假单胞菌的检测方法
<130>2018
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