本发明涉及一种新型靶向-增强线粒体药物(mito-vb3)及其制备方法和应用，属于有机荧光探针技术领域。
背景技术：
烟酸(nicotinamide)，又称为维生素b3(vb3)，是人体必需13种维生素之一，烟酸进入体内后可以在酶的作用下生成辅酶i(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，nad+)、辅酶ii(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，nadp+)。在生理条件下，辅酶i主要存储于细胞质和线粒体内。它们作为生物催化反应必不可少的生物分子，参与多种生理反应，如细胞三羧酸循环(tca)、脂肪β氧化等，在糖、脂肪、氨基酸等营养物质的代谢利用过程中具有重要意义。同时辅酶i也可以作为信号分子影响下游蛋白的活化(如sirt,parp蛋白)。有文献报道证明vb3可以缓解神经退行性疾病，这一机理主要是通过提高细胞内nad+/nadh的含量，并增强线粒体呼吸链复合体的功能而实现。
帕金森是一种多发于中老年人的神经系统退行性病变，其主要病理特征为黑质多巴胺能神经元的进行性死亡。发病机理主要与蛋白质异常聚集、线粒体功能障碍、氧化应激紊乱等相关。线粒体作为生命体内中的重要角色，是众多生理反应的发生场所，其功能紊乱会使膜电位发生变化，渗透压降低，促使三羧酸循环在内的生理反应不能正常进行，导致细胞供能不足，最终走向死亡。因此研发出一种可以定位于线粒体，又能够增强线粒体功能的新型药物亟不可待。
技术实现要素：
本发明解决的技术问题是：提出一种基于天然小分子维生素b3(vb3)的药物，使之可以定位于线粒体，并能在细胞内发挥生物活性的新型靶向-增强线粒体功能药物的制备及应用。
为了解决上述技术问题，本发明提出的技术方案是：一种新型靶向-增强线粒体功能药物mito-vb3，作为一种靶向线粒体的药物，其结构式如下图(i)所示：
为了解决上述技术问题，本发明提出的另一技术方案是：所述的新型靶向-增强线粒体功能药物mito-vb3的制备方法，包括如下步骤：将vb3衍生物与1.4-二溴丁烷反应，得到化合物1，化合物1在lioh作用下生成promito-vb3；promito-vb3与三苯基膦依次加入到甲苯中，在高温条件下，搅拌3小时，除去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到目标产物mito-vb3线粒体功能药物，反应式如下：
优选的，所述vb3衍生化合物和三苯基膦的摩尔比为1:1。
优选的，所述的vb3衍生物的制备方法如下：
(1)将vb3溶解在n,n-二甲基甲酰胺dmf中，然后加入碳酸铯cs2co3和1.4-二溴丁烷，然后在室温下搅拌6h，反应混合物被过滤，有机层萃取旋干，经硅胶柱层析提纯得到promito-vb3；
(2)在室温中下，将氢氧化锂lioh溶于纯水中，然后将氢氧化锂水溶液滴加入四氢呋喃和甲醇溶液中，搅拌2小时，然后加入盐酸调到ph6，用乙酸乙酯萃取，有几层被旋干，然后经硅胶柱层析提纯得到mito-vb3。
优选的，所述步骤(1)中vb3与1.4-二溴丁烷的摩尔比为1:2.5。
优选的，所述步骤(2)中化合物2与氢氧化锂的摩尔比为1:2。
优选的，所述的药物mito-vb3在制备预防帕金森药物中的应用。
本发明的有益效果：
该新型药物可以在辅酶i合成酶的作用下，高效的产生辅酶i，以供机体发生必须的生理反应。该新型药物是基于天然小分子vb3，对其进行靶向线粒体的修饰，并能在线粒体内发挥其应有的药物活性。
本发明的新型药物mito-vb3具有较好的线粒体靶向性、化学稳定性、生物兼容性等。通过细胞活性、atp、线粒体膜电位变化及western-blot等实验检测，表明mito-vb3有较好的细胞通透性，且对鱼藤酮诱导的多巴胺能细胞系pd模型有保护作用，主要用的活细胞为sh-sy5y细胞株。
本发明的新型药物mito-vb3在可应用于缓解parkin基因敲除的果蝇pd模型的爬行行为及增强线粒体形态。
附图说明
下面结合附图对本发明的作进一步说明。
图1是实施案例1制备的a)promito-vb3氢谱、(b)mito-vb3药物氢谱
图2是实施案例1制备的(a)promito-vb3碳谱、(b)mito-vb3药物碳谱
图3是实施案例1制备的mito-vb3药物质谱
图4是实施案例1制备的mito-vb3药物对sh-sy5y细胞的毒性作用图
图5是实施案例1制备的mito-vb3对于鱼藤酮诱导的多巴胺能细胞系pd模型保护作用图
图6是实施案例1制备的mito-vb3(50um)对于鱼藤酮诱导的多巴胺能细胞系pd模型western-blot图
图7是本发明的新型靶向-增强线粒体功能药物mito-vb3的药物作用的机理示意图
具体实施方式
实施例1
mito-vb3线粒体功能药物的制备方法具体如下：
(1)将1gvb3溶解于10毫升n.n-二甲基甲酰胺dmf中，然后加入9.3g的碳酸铯cs2co3和3.1g的1.4-二溴丁烷，然后在室温下搅拌6h，反应混合物被过滤，用乙酸乙酯(ea)和饱和氯化铵萃取三次，有机层旋干，经硅胶柱层析提纯得到化合物1；1hnmr(500mhz,cdcl3):δ8.79(s,1h),8.44(s,1h),7.74(dd,j1＝2.7hz,j2＝1.7hz,1h),4.37(t,j＝6.2hz,2h),4.08(t,j＝6.0hz,2h),2.04(m,4h),1.92(m,4h).13cnmr(126mhz,cdcl3):δ165.07,154.91,142.51,142.05,126.67,121.17,67.66,64.64,33.18,33.03,29.24,29.16,27.63,27.24。
(2)在室温下，将0.117g的氢氧化锂lioh溶于5ml纯水中，然后将1g化合物1溶于5ml甲醇和10ml四氢呋喃(meoh/thf＝1：2)的混合溶液中，再将氢氧化锂水溶液缓慢滴加入混合溶液中，搅拌3小时，然后加入1m盐酸调到ph6，用乙酸乙酯萃取，有机层被旋干，然后经硅胶柱层析提纯得到化合物2；1hnmr(500mhz,dmso):δ8.67(s,1h),8.50(s,1h),7.74(dd,j1＝2.7hz,j2＝1.7hz,1h),4.14(t,j＝6.2hz,2h),3.61(t,j＝6.6hz,2h),1.97(t,j＝5.7hz,2h),1.86(t,j＝5.3hz,2h).13cnmr(126mhz,dmso):δ166.33,155.09,142.83,142.52,127.68,121.37,67.46,35.18,29.34,27.63。
(3)将0.5g化合物2和0.478g的三苯基膦依次加入到5ml的甲苯中，在110℃的条件下，搅拌回流12小时，除去溶剂，用少量的二氯甲烷溶解，加入乙醚后有白色固体析出，将白色固体溶解，经硅胶柱层析提纯得到目标产物mito-vb3线粒体功能药物。1hnmr(500mhz,dmso):δ8.67(s,1h),8.50(s,1h),7.74(dd,j1＝2.7hz,j2＝1.7hz,1h),7.36(s,9h),7.21(t,j＝6.7hz,6h),4.12(t,j＝6.2hz,2h),3.59(t,j＝6.6hz,2h),1.94(t,j＝5.7hz,2h),1.83(t,j＝5.3hz,2h).13cnmr(126mhz,dmso):δ166.65,155.07,142.63,142.49,133.63,129.24,127.67,121.08,67.77,35.19,29.33,27.62。
实施例2
mito-vb3线粒体功能药物的制备方法具体如下：
(1)将0.5gvb3溶解于5毫升n.n-二甲基甲酰胺dmf中，然后加入4.65g的碳酸铯cs2co3和1.55g的1.4-二溴丁烷，然后在室温下搅拌6h，反应混合物被过滤，用乙酸乙酯(ea)和饱和氯化铵萃取三次，有机层旋干，经硅胶柱层析提纯得到化合物1。
(2)在室温下，将0.234g的氢氧化锂lioh溶于10ml纯水中，然后将2g化合物1溶于10ml甲醇和20ml四氢呋喃(meoh/thf＝1：2)的混合溶液中，再将氢氧化锂水溶液缓慢滴加入混合溶液中，搅拌3小时，然后加入1m盐酸调到ph6，用乙酸乙酯ea萃取，有机层被旋干，然后经硅胶柱层析提纯得到化合物2；
(3)将1.5g化合物2和1.434g的三苯基膦依次加入到15ml的甲苯中，在110℃的条件下，搅拌回流12小时，除去溶剂，用少量的二氯甲烷dcm溶解，加入乙醚后有白色固体析出，将白色固体溶解，经硅胶柱层析提纯得到目标产物mito-vb3线粒体功能药物。
实施例3
mito-vb3线粒体功能药物的制备方法具体如下：
(1)将0.7gvb3溶解于7毫升n.n-二甲基甲酰胺dmf中，然后加入6.51g的碳酸铯cs2co3和2.17g的1.4-二溴丁烷，然后在室温下搅拌6h，反应混合物被过滤，用乙酸乙酯(ea)和饱和氯化铵萃取三次，有机层旋干，经硅胶柱层析提纯得到化合物1。
(2)在室温下，将0.152g的氢氧化锂lioh溶于6.5ml纯水中，然后将1.3g化合物1溶于6.5ml甲醇和13ml四氢呋喃(meoh/thf＝1：2)的混合溶液中，再将氢氧化锂水溶液缓慢滴加入混合溶液中，搅拌3小时，然后加入1m盐酸调到ph6，用乙酸乙酯ea萃取，有机层被旋干，然后经硅胶柱层析提纯得到化合物2；
(3)将1g化合物2和0.956g的三苯基膦依次加入到10ml的甲苯中，在110℃的条件下，搅拌回流12小时，除去溶剂，用少量的二氯甲烷dcm溶解，加入乙醚后有白色固体析出，将白色固体溶解，经硅胶柱层析提纯得到目标产物mito-vb3线粒体功能药物。
实施例4
mito-vb3线粒体功能药物的制备方法具体如下
(1)将5gvb3溶解于50毫升n.n-二甲基甲酰胺dmf中，然后加入46.5g的碳酸铯cs2co3和15.5g的1.4-二溴丁烷，然后在室温下搅拌6h，反应混合物被过滤，用乙酸乙酯(ea)和饱和氯化铵萃取三次，有机层旋干，经硅胶柱层析提纯得到化合物1。
(2)在室温下，将0.936g的氢氧化锂lioh溶于40ml纯水中，然后将8g化合物1溶于40ml甲醇和80ml四氢呋喃(meoh/thf＝1：2)的混合溶液中，再将氢氧化锂水溶液缓慢滴加入混合溶液中，搅拌3小时，然后加入1m盐酸调到ph6，用乙酸乙酯ea萃取，有机层被旋干，然后经硅胶柱层析提纯得到化合物2；
(3)将3g化合物2和2.868g的三苯基膦依次加入到30ml的甲苯中，在110℃的条件下，搅拌回流12小时，除去溶剂，用少量的二氯甲烷dcm溶解，加入乙醚后有白色固体析出，将白色固体溶解，经硅胶柱层析提纯得到目标产物mito-vb3线粒体功能药物。
实施例5
mito-vb3线粒体功能药物的制备和应用：
1、mito-vb3药物对多巴胺能细胞系(sh-sy5y)细胞的毒性作用图
不同浓度的mito-vb3处理sh-sy5y细胞24h后，用xtt检测其毒性作用发现在浓度加到100um时，对细胞并没有产生毒害作用。而在0-1um处细胞存在应激反应，从而存活率要大于ctrl组。
2、mito-vb3对于鱼藤酮诱导的多巴胺能细胞系(sh-sy5y)宏观保护作用
在相同条件下对比mito-vb3和vb3的保护效果发现，在低浓度下，mito-vb3的保护效果要强于vb3，而当浓度上升到10um时，vb3对于rot刺激24h后的sh-sy5y的保护效果更佳。
3、mito-vb3对于鱼藤酮诱导的多巴胺能细胞系pd模型微观保护作用(westernblot)
sirt1蛋白是一种乙酰化蛋白，它必须的在nad+的介导下才能发挥效果，研究发现nad+的量增多，sirt1蛋白的表达量上升。而vb3是nad+的前体物质，进入细胞后，在酶的作用下，生成nad+并发挥作用.
实验发现再加入mito-vb3后sirt1的表达量增多，且比vb3更灵敏。
本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。