发明领域
本发明涉及液体酶制剂，特别涉及液体的且稳定的制剂，其包含交联酶和/或酶修饰乳蛋白质。本发明特别涉及液体的且稳定的转谷氨酰胺酶制剂。此外，本发明涉及用于制备液体酶制剂的方法。
发明背景
包含交联酶和/或酶修饰乳蛋白，如漆酶、酪氨酸酶、过氧化物酶、巯基氧化酶或葡萄糖氧化酶的酶制剂是均可以通过商业途径在粉末制剂和液体制剂中获得。然而，转谷氨酰胺酶和蛋白谷氨酰胺酶产品目前在市场上仅为粉末形式。粉末酶产品的使用并不被完全接受，这是由于所有生产工厂中存在粉尘形成。因粉尘引起的健康危害尤其已经在工人中引起了担忧。
来自茂原链轮丝菌(streptoverticilliummobaraense)菌株的转谷氨酰胺酶及其制备方法已经公开于欧洲专利号0379606b1中。此外，使用从利迪链霉菌(streptomyceslydicus)菌株分离的基因产生转谷氨酰胺酶的方法公开于欧洲专利号0777726b1中。
与配制酶(如液体形式的转谷氨酰胺酶)相关的问题之一是制剂稳定性的缺乏。此外，与本液体酶制剂相关的缺点之一是它们含有至少一种防腐剂。
发明简述
本发明的目标因此是提供包含转谷氨酰胺酶和/或另一乳蛋白交联和/或修饰酶，如漆酶、酪氨酸酶、过氧化物酶、巯基氧化酶、葡萄糖氧化酶或蛋白谷氨酰胺酶的液体酶制剂，其是稳定的且可以在室温或冰箱和/或冷库温度下储存商业制剂所需的时间期限。
本发明的另一目标是提供包含转谷氨酰胺酶的液体制剂，其是稳定的且可以在室温或冰箱和/或冷库温度下储存商业制剂所需的时间期限。
本发明的其他目标是提供用于制备稳定的液体酶制剂的方法，所述酶制剂包含转谷氨酰胺酶和/或另一乳蛋白交联和/或修饰酶。
本发明的甚至其他目标是提供用于制备稳定的液体制剂的方法，所述液体制剂包含转谷氨酰胺酶。
通过独立权利要求中给出的制剂和方法完成本发明的目标。本发明的优选实施方案描述于从属权利要求中。
本发明的其他目标、细节和优点将从以下详细说明和实施例中变得显而易见。
发明详述
乳蛋白交联和/或修饰酶，如转谷氨酰胺酶、漆酶、酪氨酸酶、过氧化物酶、巯基氧化酶和蛋白谷氨酰胺酶催化乳蛋白的修饰。这些酶的作用之间，进一步与葡萄糖氧化酶的作用之间看起来存在协同作用。不受任何理论的束缚，葡萄糖氧化酶和/或过氧化物酶看起来催化这样的反应，其中通过过氧化氢的形成释放氧气。氧气然后可以催化(氧化)酪氨酸酶的交联。
乳蛋白交联和/或修饰酶，如转谷氨酰胺酶、漆酶、酪氨酸酶、过氧化物酶、巯基氧化酶和蛋白谷氨酰胺酶任选地与葡萄糖氧化酶一起用于加工鱼、肉和蛋产品、浆料和pates、水果、浆果和蔬菜、豆制品、谷物制品、面包和烘焙产品的制造。
以下乳蛋白交联和/或修饰酶在乳制品或其他食品范畴内的食品加工中是全部相关的。
转谷氨酰胺酶是催化蛋白质分子中存在的谷氨酰胺与赖氨酸氨基酸残基之间产生共价键的酶家族(ec2.3.2.13)。当形成键时，会释放氨。
来源于真菌和细菌，如真菌白腐菌(trameteshirsute)的漆酶(ec1.10.3.2)催化碳水化合物与蛋白质之间的交联(氧化芳族化合物和半胱氨酸)，其在食品加工中具有应用，例如用于减少变应原性。
酪氨酸酶(ec1.14.18.1)是催化酚类，如酪氨酸氧化的酶，其在食品加工中具有应用，例如用于减少变应原性。
过氧化物酶(ec1.11.1.7)是催化芳族化合物氧化的酶家族，其在食品加工中具有应用，例如用于减少变应原性。
巯基氧化酶(ec1.8.3.3)催化二硫键的形成、谷胱甘肽的氧化。
蛋白谷氨酰胺酶催化蛋白质结合的谷氨酰胺的脱酰胺作用，并将谷氨酰胺转化成谷氨酸。
葡萄糖氧化酶催化蛋白质交联的形成和戊聚糖的氧化胶凝。
乳蛋白交联和/或修饰酶，如转谷氨酰胺酶、漆酶、酪氨酸酶、过氧化物酶、巯基氧化酶和蛋白谷氨酰胺酶用于乳制品工业，以稳定基于乳的产品结构。除了乳制品工业，这些酶用于加工鱼、肉和蛋产品、浆料和pates、水果、浆果和蔬菜、豆制品、谷物制品、面包和烘焙产品的制造。因此，液体酶制剂适合于例如乳制品、加工鱼、肉、蛋、浆料和pates、水果、浆果和蔬菜、大豆、谷物、面包和烘焙产品的制造。尤其在工业规模的制造中，液体酶制剂的使用比粉末制剂的使用会更实际且更有利。
转谷氨酰胺酶在5.2-8的ph范围内是最活跃的。当液化的转谷氨酰胺酶储存在ph5.2或ph8时，该酶快速丧失其活性。在室温或冰箱温度下在ph5.2储存转谷氨酰胺酶7天后，仅剩余一半的活性。
本发明基于这样的发现，当转谷氨酰胺酶、酪氨酸酶或蛋白谷氨酰胺酶储存在多元醇(如甘油或山梨糖醇)和水的悬浮液中ph范围在4.4-5.1之间时，其活性在室温下的储存过程中适度保持，而在冰箱和/或冷库温度下的储存过程中保持极好。此外，本发明基于这样的发现，当转谷氨酰胺酶与蛋白谷氨酰胺酶一起储存在多元醇和水的ph4.6的悬浮液中时，酶的活性在室温下的储存过程中保持适度，而在冰箱和/或冷库温度下的储存过程中保持极好。此外，本发明基于这样的发现，当转谷氨酰胺酶与蛋白谷氨酰胺酶和酪氨酸酶一起储存在甘油和水的ph4.6的悬浮液中时，酶的活性在室温下的储存过程中保持适度，而在冰箱和/或冷库温度下的储存过程中保持极好。此外，本发明的液体制剂在室温和冰箱和/或冷库温度下的储存过程中在微生物学上也是稳定的。此外，意外地发现，本发明的液体酶制剂在冰箱和/或冷库温度下在制剂中没有任何防腐剂的情况下维持其酶活性和微生物学纯度(没有微生物生长)。
在一个实施方案中，多元醇-水悬浮液中的液体酶制剂具有范围在4.4-5.1内的ph值。在本发明的另一实施方案中，酶制剂的ph在4.4-4.8的范围内。在本发明的一个实施方案中，酶制剂的ph是4.4。在本发明的另一实施方案中，酶制剂的ph是4.6。在本发明的其他实施方案中，酶制剂的ph是4.8。在本发明的甚至其他实施方案中，酶制剂的ph是5.1。
多元醇，如甘油、山梨糖醇、木糖醇和/或甘露醇可以用于本发明的液体酶制剂中。多元醇的混合物，如甘油和其他多元醇的混合物也是可行的。
适合于配制本发明酶制剂的多元醇与水的悬浮液或两种或多种多元醇与水的混合物可以含有25％高至100％，优选50％高至100％(w/w％)的多元醇，如甘油、山梨糖醇、木糖醇和/或甘露醇。在本发明的一个实施方案中，酶溶解在25％多元醇/75％水(w/w)悬浮液中。在本发明的另一实施方案中，酶溶解在50％多元醇/50％水(w/w)悬浮液中。在本发明的其他实施方案中，酶溶解在75％多元醇/25％水(w/w)悬浮液中。
适合于配制本发明酶制剂的甘油与水的悬浮液可以含有25％高至100％，优选50％高至100％的甘油。在本发明的一个实施方案中，酶溶解在25％甘油/75％水悬浮液中。在本发明的另一实施方案中，酶溶解在50％甘油/50％水悬浮液中。在本发明的其他实施方案中，酶溶解在75％甘油/25％水悬浮液中。此外，适合于配制本发明酶制剂的山梨糖醇与水的悬浮液可以含有25％高至100％，优选50％高至100％的山梨糖醇。在本发明的一个实施方案中，酶溶解在25％山梨糖醇/75％水悬浮液中。在本发明的另一实施方案中，酶溶解在50％山梨糖醇/50％水悬浮液中。在本发明的其他实施方案中，酶溶解在75％山梨糖醇/25％水悬浮液中。
可以利用批准食品使用的酸，如乳酸、gdl(葡萄糖酸δ内酯)、柠檬酸、乙酸、草酸、苹果酸、泛酸、丙酸和/或盐酸，或其酸或盐形式的任何混合物/组合将悬浮液的ph调整至想要的范围。在本发明的一个实施方案中，乳酸用于ph的调整。
本发明的液体酶制剂还可以任选地含有防腐剂，如苯甲酸钠。在一个实施方案中，本发明的液体酶制剂不含有任何额外的防腐剂，即所述制剂不含防腐剂。在另一实施方案中，本发明的液体酶制剂含有额外的防腐剂。在其他实施方案中，本发明的液体酶制剂含有苯甲酸钠作为防腐剂。在甚至其他实施方案中，本发明的液体酶制剂含有0.1-1％的量，优选0.7％的量的苯甲酸钠作为防腐剂。
本发明的液体酶制剂在室温下维持其活性约两周，在冰箱中至少约1.5-6个月，在冷库中最少5个月高至24个月。
在本发明的一个实施方案中，液体制剂包含一种乳蛋白交联和/或修饰酶。在本发明的另一实施方案中，液体制剂包含两种或多种乳蛋白交联和/或修饰酶。在一个实施方案中，本发明制剂中的乳蛋白交联和/或修饰酶是转谷氨酰胺酶。在另一实施方案中，本发明制剂中的乳蛋白交联和/或修饰酶是酪氨酸酶。在另一实施方案中，本发明制剂中的乳蛋白交联和/或修饰酶是蛋白谷氨酰胺酶。在另一实施方案中，本发明制剂中的乳蛋白交联和/或修饰酶是转谷氨酰胺酶和蛋白谷氨酰胺酶。在另一实施方案中，本发明制剂中的乳蛋白交联和/或修饰酶是转谷氨酰胺酶和酪氨酸酶。在另一实施方案中，本发明制剂中的乳蛋白交联和/或修饰酶是转谷氨酰胺酶和漆酶。在其他实施方案中，本发明制剂中的乳蛋白交联和/或修饰酶是转谷氨酰胺酶、蛋白谷氨酰胺酶和漆酶。在甚至其他实施方案中，本发明制剂中的乳蛋白交联和/或修饰酶是转谷氨酰胺酶、蛋白谷氨酰胺酶和酪氨酸酶。
本发明还涉及用于制备液体酶制剂的方法，其中向具有4.4-5.1范围内的ph值的多元醇-水悬浮液中加入乳蛋白交联和/或修饰酶。在本发明的一个实施方案中，将多元醇-水悬浮液的ph调整到4.4-5.1范围内的值。在本发明的一个实施方案中，将多元醇-水悬浮液的ph调整到4.4-4.8范围内的值。在本发明的一个实施方案中，将酶制剂的ph调整到ph4.4。在本发明的另一实施方案中，将多元醇-水悬浮液的ph调整到ph4.6。在本发明的其他实施方案中，将多元醇-水悬浮液的ph调整到ph4.8。在本发明的甚至其他方案中，将酶制剂的ph调整到ph5.1。
适合于本发明方法的多元醇和水的悬浮液可含有25％高至100％(w-％)的多元醇。在本发明的一个实施方案中，酶溶解在25％多元醇-水悬浮液中。在本发明的另一实施方案中，酶溶解在50％多元醇-水悬浮液中。在本发明的其他实施方案中，酶溶解在75％多元醇-水悬浮液中。在本发明的一个实施方案中，多元醇是甘油。在本发明的另一实施方案中，多元醇是山梨糖醇。
在本方法中，可以利用允许食品使用(食品级，gras)的酸，如乳酸、gdl、柠檬酸、乙酸、草酸、苹果酸、泛酸、丙酸和/或盐酸或其酸或盐形式的任何混合物/组合将悬浮液的ph调整至想要的范围。在一个实施方案中，乳酸用于本发明方法中的ph调整。
在本发明的方法中，液体酶制剂中还可任选包括防腐剂，如苯甲酸钠。在一个实施方案中，本发明的方法不包括添加防腐剂。在另一实施方案中，本发明的方法包括添加防腐剂。在其他实施方案中，本发明的方法包括添加苯甲酸钠作为防腐剂。在甚至其他实施方案中，本发明的方法包括添加0.1-1％的量，优选0.7％的量的苯甲酸钠作为防腐剂。
在一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
a)利用食品级的酸将多元醇-水悬浮液的ph调整至4.4-5.1的范围内的值
b)向悬浮液中加入乳蛋白交联和/或修饰酶
c)任选地加入防腐剂。
在另一实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
a)向多元醇-水悬浮液中加入乳蛋白交联和/或修饰酶
b)利用食品级的酸将悬浮液的ph调整至4.4-5.1的范围内的值
c)任选地加入防腐剂。
在本发明的一个实施方案中，向悬浮液中加入一种乳蛋白交联和/或修饰酶。在本发明的另一实施方案中，向悬浮液中加入两种或多种乳蛋白交联和/或修饰酶。在一个实施方案中，乳蛋白交联和/或修饰酶是转谷氨酰胺酶。在另一实施方案中，乳蛋白交联和/或修饰酶是酪氨酸酶。在另一实施方案中，乳蛋白交联和/或修饰酶是蛋白谷氨酰胺酶。在另一实施方案中，乳蛋白交联和/或修饰酶是转谷氨酰胺酶和蛋白谷氨酰胺酶。在另一实施方案中，乳蛋白交联和/或修饰酶是转谷氨酰胺酶和酪氨酸酶。在另一实施方案中，乳蛋白交联和/或修饰酶是转谷氨酰胺酶和漆酶。在其他实施方案中，乳蛋白交联和/或修饰酶是转谷氨酰胺酶、蛋白谷氨酰胺酶和漆酶。在甚至其他实施方案中，乳蛋白交联和/或修饰酶是转谷氨酰胺酶、蛋白谷氨酰胺酶和酪氨酸酶。
将通过以下实施例更详细地描述本发明。所述实施例无论如何不解释为以任何方式限制权利要求。
实施例
比较实施例1
在4℃下ph5.2的甘油-水悬浮液中的转谷氨酰胺酶制剂
以274nkat/g的活性将来自茂原链轮丝菌菌株的具有16.300nkat/g活性的转谷氨酰胺酶(
在第7天，仅剩余50％的转谷氨酰胺酶活性。在7天防腐测试中没有检测到微生物生长。
比较实施例2
在4℃下ph5.2的水中的转谷氨酰胺酶制剂
以274nkat/g的活性将转谷氨酰胺酶
监测酶活性50天。此外，监测制剂的微生物纯度。
在第50天，仅剩余43％的转谷氨酰胺酶活性。在50天防腐测试中没有检测到微生物生长。
实施例1
在4℃下ph4.6的甘油-水悬浮液中的转谷氨酰胺酶制剂
以274nkat/g的活性将转谷氨酰胺酶
监测酶活性7天。此外，监测制剂的微生物纯度。
在第7天，剩余100％的转谷氨酰胺酶活性。在7天防腐测试中没有检测到微生物生长。
实施例2
在4℃下ph4.6的甘油-水悬浮液中的转谷氨酰胺酶制剂
以326nkat/g的活性将转谷氨酰胺酶
监测酶活性50天。此外，监测制剂的微生物纯度。
在第50天，保留100％的转谷氨酰胺酶活性。在50天防腐测试中没有检测到微生物生长。
实施例3
在4℃下ph4.6的甘油-水悬浮液中的转谷氨酰胺酶制剂
通过将ajinomoto的转谷氨酰胺酶制剂
监测酶活性50天。此外，监测制剂的微生物纯度。
在第50天，剩余100％的转谷氨酰胺酶活性。在50天防腐测试中没有检测到微生物生长。
实施例4
在4℃下ph4.4的甘油-水悬浮液中的转谷氨酰胺酶制剂
通过将具有274nkat/g活性的转谷氨酰胺酶
监测酶活性50天。此外，监测制剂的微生物纯度。
在第50天，剩余100％的转谷氨酰胺酶活性。在50天防腐测试中没有检测到微生物生长。
实施例5
在4℃下ph4.8的甘油-水悬浮液中的转谷氨酰胺酶制剂
通过将具有274nkat/g活性的转谷氨酰胺酶
监测酶活性50天。此外，监测制剂的微生物纯度。
在第50天，剩余100％的转谷氨酰胺酶活性。在50天防腐测试中没有检测到微生物生长。
实施例6
在4℃下ph5.1的甘油-水悬浮液中的转谷氨酰胺酶制剂
通过将具有274nkat/g活性的转谷氨酰胺酶
监测酶活性50天。此外，监测制剂的微生物纯度。
在第50天，剩余100％的转谷氨酰胺酶活性。在50天防腐测试中没有检测到微生物生长。
实施例7
在4℃下ph4.6的甘油-水悬浮液中的转谷氨酰胺酶制剂sapronatg(yimingbiologicalproductsco,china)
通过将来自茂原链轮丝菌菌株的转谷氨酰胺酶yimingsapronatg溶解在ph用乳酸调整至ph4.6的50％甘油-水(w/w)悬浮液中制备液体转谷氨酰胺酶制剂。
监测酶活性50天。此外，监测制剂的微生物纯度。
在第50天，剩余100％的转谷氨酰胺酶活性。在50天防腐测试中没有检测到微生物生长。
实施例8
在4℃下ph4.6的甘油-水悬浮液中的转谷氨酰胺酶制剂reactyncl1000tg(campusspa,italy)
通过将转谷氨酰胺酶campusreactyncl1000tg溶解在ph用乳酸调整至ph4.6的50％甘油-水(w/w)悬浮液中制备液体转谷氨酰胺酶制剂。
监测酶活性50天。此外，监测制剂的微生物纯度。
在第50天，剩余100％的转谷氨酰胺酶活性。在50天防腐测试中没有检测到微生物生长。
实施例9
在4℃下ph4.6的甘油-水悬浮液中的转谷氨酰胺酶制tg-pg(ajinomoto)
通过将酶制剂tg-pg(ajinomoto)溶解在用乳酸调整而具有ph4.6的50％甘油-水(w/w)悬浮液中制备液体制剂。制剂tg-pg(ajinomoto)含有来自茂原链轮丝菌菌株的转谷氨酰胺酶和来自解朊金黄杆菌(chryseobacteriumproteolyticum)的蛋白谷氨酰胺酶。
液体制剂的转谷氨酰胺酶活性是100u/g,并且液体制剂的蛋白谷氨酰胺酶活性是100u/g。
监测酶活性50天。此外，监测制剂的微生物纯度。
在第50天，剩余100％的转谷氨酰胺酶活性和100％的蛋白谷氨酰胺酶活性。在50天防腐测试中没有检测到微生物生长。
实施例10
在4℃下ph4.6的75％甘油/25％水悬浮液中的转谷氨酰胺酶制剂
以326nkat/g的活性将转谷氨酰胺酶
在4℃的温度下监测酶活性50天。此外，监测制剂的微生物纯度。
在第50天，剩余100％的转谷氨酰胺酶活性。在防腐测试中没有检测到微生物生长。
实施例11
在4℃下ph4.6的25％甘油/75％水悬浮液中的转谷氨酰胺酶制剂
以326nkat/g的活性将转谷氨酰胺酶
在4℃的温度下监测酶活性50天。此外，监测制剂的微生物纯度。
在第50天，剩余72％的转谷氨酰胺酶活性。在防腐测试中没有检测到微生物生长。
实施例12
在22℃下ph4.4-4.8的甘油-水悬浮液中的转谷氨酰胺酶制剂
通过将具有2789nkat/g活性的转谷氨酰胺酶
在22℃的温度下监测制剂的酶活性13周。此外，监测制剂的微生物纯度。
两周存储后，制剂中酶的活性开始下降。在防腐测试中没有检测到微生物生长。
实施例13
在4℃下ph4.4-4.8的甘油-水悬浮液中的转谷氨酰胺酶制剂
通过将具有2789nkat/g活性的转谷氨酰胺酶
在4℃的温度下监测制剂的酶活性26周。此外，监测制剂的微生物纯度。
26周存储后，剩余89％的酶活性。在防腐测试中没有检测到微生物生长。
实施例14
在-20℃下ph4.4-4.8的甘油-水悬浮液中的转谷氨酰胺酶制剂
通过将具有2789nkat/g活性的转谷氨酰胺酶
在-20℃的温度下监测制剂的酶活性26周。此外，监测制剂的微生物纯度。
26周存储后，剩余97％的酶活性。在防腐测试中没有检测到微生物生长。
实施例15
在4℃下ph4.6的甘油-水悬浮液中的酪氨酸酶制剂
以100u/g活性将酪氨酸酶溶解在其ph用乳酸调整至ph4.6的50％甘油-水(w/w)悬浮液。
监测酶活性50天。此外，监测制剂的微生物纯度。
50天存储后，剩余97％的酪氨酸酶活性。在防腐测试中没有检测到微生物生长。
实施例16
在4℃下ph4.6的甘油-水悬浮液中的蛋白谷氨酰胺酶制剂
将具有100u/g活性的蛋白谷氨酰胺酶溶解在其ph用乳酸调整至ph4.6的50％甘油-水(w/w)悬浮液。
监测酶活性50天。此外，监测制剂的微生物纯度。
50天存储后，剩余96％的蛋白谷氨酰胺酶活性。在防腐测试中没有检测到微生物生长。
实施例17
在4℃下ph4.6的山梨糖醇-水悬浮液中的转谷氨酰胺酶制剂
通过将具有274nkat/g活性的转谷氨酰胺酶
监测酶活性50天。此外，监测制剂的微生物纯度。
在第50天，剩余100％的转谷氨酰胺酶活性。在50天防腐测试中没有检测到微生物生长。
实施例18
在4℃下ph4.6的甘油-水悬浮液中的含有tg-pg(ajinomoto)和酪氨酸酶的液体酶制剂
通过将酶制剂tg-pg(ajinomoto)和酪氨酸酶溶解在用乳酸调整而具有ph4.6的50％甘油-水(w/w)悬浮液中制备液体制剂。液体制剂的转谷氨酰胺酶活性是100u/g，液体制剂的蛋白谷氨酰胺酶活性是100u/g，并且液体制剂的酪氨酸酶活性是100u/g。
监测酶活性50天。此外，监测制剂的微生物纯度。
在第50天，剩余100％的转谷氨酰胺酶活性、100％的蛋白谷氨酰胺酶活性和98％的酪氨酸酶活性。在防腐测试中没有检测到微生物生长。
随着技术的进步，将对本领域技术人员显而易见的是，可以多种方式实践本概念。本发明及其实施方案不局限于上述实施例，但在权利要求范围内可以变化。