本发明涉及生物技术领域，特别涉及从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法。
背景技术：
胶原蛋白是动物细胞合成的一种天然生物高分子，作为细胞外基质中的重要成分几乎存在于所有组织内，约占动物总蛋白的30%，胶原蛋白具有高度抗延伸能力，使得皮肤等结缔组织得以维持一定的结构并具有特殊的机械力学性质以实现支撑和保护细胞、组织和机体功能，对细胞和组织的结构与性能等方面十分关键。
鱼胶原蛋白多肽是一种功能食品或保健品原料，许多研究表明鱼胶原蛋白多肽中存在大量的生物活性组分，包括具有抗氧化、抑制ACE活性、抗溃疡、抑制关节炎、提高免疫力、增强骨密度以及预防骨质疏松等生物活性的多肽。
近几年来，随着人们生活水平的提高，人们对水产资源需求的多样性及实用性逐渐提高，从而促进我国水产加工业的飞速发展。但是，在水产加工业高速发展的同时会产生大量的鱼下脚料，例如鱼皮、鱼鳞、内脏、鱼头等，这些下脚料约占原料鱼的40-50%，其中约5%是鱼鳞，鱼鳞中含有人体所需的多种营养物质，除含有大量钙质，还含有大脑生长活动不可缺少的磷脂质、磷蛋白以及其它生命活动所需物质，如鱼鳞中含有丰富的胶原蛋白，占20-40%，将其作为新型的胶原蛋白资源，具有很高的开发和利用价值。
现有技术如授权公告号为CN 103045706 B的中国发明专利，公开了一种连续生产鱼鳞胶原肽螯合钙盐和鱼鳞胶原肽的方法，包括如下步骤：预处理鱼鳞、酶法提取鱼鳞胶原多肽和钙溶液、纯化鱼鳞胶原多肽和钙溶液、肽钙螯合技术制备鱼鳞胶原肽螯合钙盐溶液、分离鱼鳞胶原肽螯合钙盐溶液得到沉淀物和上清液、沉淀物水溶解干燥得鱼鳞胶原肽螯合钙盐粉成品、上清液浓缩去除乙醇再分离纯化得鱼鳞胶原肽溶液、鱼鳞胶原肽溶液干燥得到鱼鳞胶原肽粉成品。该方法生产的鱼鳞胶原肽螯合钙盐产品生物利用度高、安全性高，且肽钙双补，所生产的鱼鳞胶原肽产品平均相对分子量低、纯度高。但是，该该制备方法得到的胶原蛋多肽中含有苦味肽。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种蛋白酶用量少、酶解时间短，蛋白质降解效果好，胶原蛋白多肽得率和纯度高、较白、感官接受度较高，能减少苦味肽的生成和产物的损失的从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：
从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，将鱼鳞胶原蛋白中加入去离子水，经复合蛋白酶酶解，酶解过程中超滤得超滤液，超滤液经纳滤、凝胶层析，然后选择流动相为乙腈和酒石酸水溶液，经RP-HPLC纯化，冷冻干燥即得胶原蛋白多肽。该制备方法具有投入低、操作简单、蛋白质降解效果好、胶原蛋白多肽得率高、较白、感官接受度较高的优势，能够减少苦味肽的生成和产物的损失，易于工业化规模生产，具有良好的应用价值和市场潜力。
作为优选，酶解的具体步骤为：按底物浓度为8-10%向鱼鳞胶原蛋白中加入去离子水，调节pH至7.4-8.6，按加酶量为4-5.5%加入复合蛋白酶，然后在温度为30-40℃下酶解10-15h，酶解间隔1-2h用截留分子量为8-12kDa的超滤膜超滤10-20min，即得超滤液。酶解过程中用超滤除去小分子产物，避免了继续作为底物被酶解成小分子产物，而小分子产物是胶原蛋白苦味肽的来源，这样进一步减少了苦味肽的生成，从而减少了产物的损失，且能够降低酶解体系中产物的浓度，使得酶解反应速率能够继续保持，大大缩短酶解时间。
进一步优选，复合蛋白酶中胶原酶和风味蛋白酶的重量比为1:0.45-0.8。采用胶原酶和风味蛋白酶进行酶解，胶原酶在不破坏其他蛋白质的前提下，能专一地打开胶原蛋白特有的超螺旋结构，而风味蛋白酶能从不同的氨基酸位点进行酶切，从而产生大量的胶原蛋白肽，同时酶之间因具有协同增效作用而导致加强效应，相应产生的胶原蛋白肽片段功能会进一步增强，最终提高蛋白的酶解效率、酶解液中胶原蛋白肽的含量和活性。
进一步优选，去离子水含有0.2-0.4M氯化钾和3-5mM羧甲基纤维素钠。氯化钾和羧甲基纤维素钠可使得酶解体系中金属离子和酸根离子通过与蛋白质的相互作用，使得胶原酶和风味蛋白酶能够保持其结构不被破坏，从而发挥酶解作用，且有利于蛋白酶与底物的结合并催化水解反应，提高酶解速率，而羧甲基纤维素钠的存在又能避免蛋白质分子间的接近，提高蛋白质在酶解体系中的分散均匀性，提高蛋白酶和底物的接触机会，进而提高酶解速率酶解效率、酶解液中多肽的含量和多肽的活性。
作为优选，纳滤的具体步骤为：将超滤液经1-1.2kDa的纳滤膜纳滤，控制压力在0.3-0.5MPa，获得1-1.2kDa以上的浓缩多肽液，即为胶原蛋白多肽粗提液。由于蛋白质的微生物酶解物成分比较复杂，既有未充分水解的蛋白质大分子，也有分子量大小不等的肽和游离的氨基酸，该步骤分离属于物理方式，没有引入化学试剂，较好的保存了胶原蛋白肽的原有特性，且对酶解液具有较好分离纯化效果。
作为优选，凝胶柱层析的具体步骤为：将浓缩多肽液溶于双蒸水配成浓度为45-55mg/mL的溶液，在2-5℃、10000-15000r/min下离心15-23min，去除不溶性杂质，上清液上样至柱子内进行层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高自由基清除活性的峰为凝胶柱层析酶解物。该方法根据酶解液在层析柱中的移动速度不同，大分子的组分先被洗脱下来，小分子的组分后被洗脱下来，从而达到分离纯化的目的，操作简便，且不需要抗氧化肽与其他物质结合，减少了纯化过程中抗氧化肽的损失，不影响目标组分化学性质，能保持抗氧化肽原有的活性不受破坏。
作为优选，RP-HPLC纯化的具体步骤为：将凝胶柱层析酶解物用双蒸水配成溶液，利用高效液相色谱进行分离，流动相为乙腈和酒石酸水溶液，将属于同一峰的收集液混合，除去乙腈和酒石酸，冻干，即得胶原蛋白多肽。色谱条件为：溶液的浓度为80-100μg/mL、进样量为4-6μL、色谱柱为Agilent C18（250mm×4.6mm，5μm）、柱温为25-35℃、洗脱速度为0.8-1.2mL/min。该方法具有分析速度快、分辨率高、灵敏度高、分离效果好的优势，能快速分离纯化目标物质，可提高胶原蛋白多肽的抗氧化活性，同时该纯化步骤所需样品量少，进样量以µL为数量级，可同时分离多种成分，能反复进样，且分离过程中样品不被破坏，易回收，获得的组分纯度较高，得到的胶原蛋白多肽具有较高的抗氧化活性，可被广泛应用于化妆品、保健食品和医药制品等领域中。
进一步优选，酒石酸水溶液浓度为0.08-0.12%，所述乙腈和酒石酸水溶液的体积比为20-70:1。
进一步优选，酒石酸中L-酒石酸和D-酒石酸的比例为86-93:1。胶原蛋白多肽带有正电荷，能与硅胶柱上残留的硅醇基相互作用，使得峰形拖尾严重，含特殊配比L-酒石酸和D-酒石酸的酒石酸的加入能够抑制固定相残留硅醇基作用，使得胶原蛋白多肽在流动相体系中能稳定存在，获得了良好的峰形，缩短分析时间，并与其他杂质分离情况良好，减少了时间和试剂的浪费；由于酒石酸可与金属离子形成络合物，减弱金属离子对阳离子交换剂固定相的吸附作用，因而使金属离子保留值减小，提高胶原蛋白多肽的得率和纯度。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明制备方法具有投入低、操作简单、蛋白质降解效果好、胶原蛋白多肽得率高、较白、感官接受度较高的优势，能够减少苦味肽的生成和产物的损失，易于工业化规模生产，具有良好的应用价值和市场潜力；2）本发明采用胶原酶和风味蛋白酶进行酶解，蛋白的酶解效率、酶解液中多肽的含量和多肽的活性均较高；3）该制备方法在酶解过程中用超滤除去小分子产物，能够减少了苦味肽的生成和产物的损失，且能够降低酶解体系中产物的浓度，使得酶解反应速率能够继续保持，大大缩短酶解时间；4）该RP-HPLC纯化用流动相使得胶原蛋白多肽在流动相体系中能稳定存在，获得了良好的峰形，缩短分析时间，并与其他杂质分离情况良好，使金属离子保留值减小，提高胶原蛋白多肽的得率和纯度。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，将鱼鳞胶原蛋白中加入去离子水，经复合蛋白酶酶解，酶解过程中超滤得超滤液，超滤液经纳滤、凝胶层析，然后选择流动相为乙腈和酒石酸水溶液，经RP-HPLC纯化，冷冻干燥即得胶原蛋白多肽。该制备方法具有投入低、操作简单、蛋白质降解效果好、胶原蛋白多肽得率高、较白、感官接受度较高的优势，能够减少苦味肽的生成和产物的损失，易于工业化规模生产，具有良好的应用价值和市场潜力。
酶解的具体步骤为：按底物浓度为8%向鱼鳞胶原蛋白中加入去离子水，调节pH至8.6，按加酶量为4%加入复合蛋白酶，然后在温度为40℃下酶解10h，酶解间隔2h用截留分子量为8kDa的超滤膜超滤20min，即得超滤液。酶解过程中用超滤除去小分子产物，避免了继续作为底物被酶解成小分子产物，而小分子产物是胶原蛋白苦味肽的来源，这样进一步减少了苦味肽的生成，从而减少了产物的损失，且能够降低酶解体系中产物的浓度，使得酶解反应速率能够继续保持，大大缩短酶解时间。
上述复合蛋白酶中胶原酶和风味蛋白酶的重量比为1:0.45。采用胶原酶和风味蛋白酶进行酶解，胶原酶在不破坏其他蛋白质的前提下，能专一地打开胶原蛋白特有的超螺旋结构，而风味蛋白酶能从不同的氨基酸位点进行酶切，从而产生大量的胶原蛋白肽，同时酶之间因具有协同增效作用而导致加强效应，相应产生的胶原蛋白肽片段功能会进一步增强，最终提高蛋白的酶解效率、酶解液中胶原蛋白肽的含量和活性。
上述去离子水含有0.4M氯化钾和3mM羧甲基纤维素钠。氯化钾和羧甲基纤维素钠可使得酶解体系中金属离子和酸根离子通过与蛋白质的相互作用，使得胶原酶和风味蛋白酶能够保持其结构不被破坏，从而发挥酶解作用，且有利于蛋白酶与底物的结合并催化水解反应，提高酶解速率，而羧甲基纤维素钠的存在又能避免蛋白质分子间的接近，提高蛋白质在酶解体系中的分散均匀性，提高蛋白酶和底物的接触机会，进而提高酶解速率酶解效率、酶解液中多肽的含量和多肽的活性。
纳滤的具体步骤为：将超滤液经1.2kDa的纳滤膜纳滤，控制压力在0.5MPa，获得1.2kDa以上的浓缩多肽液，即为胶原蛋白多肽粗提液。由于蛋白质的微生物酶解物成分比较复杂，既有未充分水解的蛋白质大分子，也有分子量大小不等的肽和游离的氨基酸，该步骤分离属于物理方式，没有引入化学试剂，较好的保存了胶原蛋白肽的原有特性，且对酶解液具有较好分离纯化效果。
凝胶柱层析的具体步骤为：将浓缩多肽液溶于双蒸水配成浓度为45-mg/mL的溶液，在5℃、10000r/min下离心23min，去除不溶性杂质，上清液上样至柱子内进行层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高自由基清除活性的峰为凝胶柱层析酶解物。该方法根据酶解液在层析柱中的移动速度不同，大分子的组分先被洗脱下来，小分子的组分后被洗脱下来，从而达到分离纯化的目的，操作简便，且不需要抗氧化肽与其他物质结合，减少了纯化过程中抗氧化肽的损失，不影响目标组分化学性质，能保持抗氧化肽原有的活性不受破坏。
RP-HPLC纯化的具体步骤为：将凝胶柱层析酶解物用双蒸水配成溶液，利用高效液相色谱进行分离，流动相为乙腈和酒石酸水溶液，将属于同一峰的收集液混合，除去乙腈和酒石酸，冻干，即得胶原蛋白多肽。色谱条件为：溶液的浓度为80μg/mL、进样量为6μL、色谱柱为Agilent C18（250mm×4.6mm，5μm）、柱温为25℃、洗脱速度为1.2mL/min。该方法具有分析速度快、分辨率高、灵敏度高、分离效果好的优势，能快速分离纯化目标物质，可提高胶原蛋白多肽的抗氧化活性，同时该纯化步骤所需样品量少，进样量以µL为数量级，可同时分离多种成分，能反复进样，且分离过程中样品不被破坏，易回收，获得的组分纯度较高，得到的胶原蛋白多肽具有较高的抗氧化活性，可被广泛应用于化妆品、保健食品和医药制品等领域中。
上述酒石酸水溶液浓度为0.08%，乙腈和酒石酸水溶液的体积比为70:1。
上述酒石酸中L-酒石酸和D-酒石酸的比例为86:1。胶原蛋白多肽带有正电荷，能与硅胶柱上残留的硅醇基相互作用，使得峰形拖尾严重，含特殊配比L-酒石酸和D-酒石酸的酒石酸的加入能够抑制固定相残留硅醇基作用，使得胶原蛋白多肽在流动相体系中能稳定存在，获得了良好的峰形，缩短分析时间，并与其他杂质分离情况良好，减少了时间和试剂的浪费；由于酒石酸可与金属离子形成络合物，减弱金属离子对阳离子交换剂固定相的吸附作用，因而使金属离子保留值减小，提高胶原蛋白多肽的得率和纯度。
实施例2：
从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，具体步骤为：
1）酶解：按底物浓度为9%向鱼鳞胶原蛋白中加入去离子水，调节pH至8.0，按加酶量为4.8%加入复合蛋白酶，然后在温度为35℃下酶解12h，酶解间隔1.5h用截留分子量为10kDa的超滤膜超滤15min，即得超滤液；上述复合蛋白酶中胶原酶和风味蛋白酶的重量比为1:0.6，去离子水含有0.3M氯化钾和4mM羧甲基纤维素钠；
2）纳滤：将超滤液经1.1kDa的纳滤膜纳滤，控制压力在0.4MPa，获得1.1kDa以上的浓缩多肽液，即为胶原蛋白多肽粗提液；
3）凝胶柱层析：将浓缩多肽液溶于双蒸水配成浓度为50mg/mL的溶液，在4℃、12000r/min下离心20min，去除不溶性杂质，上清液上样至柱子内进行层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高自由基清除活性的峰为凝胶柱层析酶解物；
4）RP-HPLC纯化：将凝胶柱层析酶解物用双蒸水配成溶液，利用高效液相色谱进行分离，流动相为乙腈和酒石酸水溶液，将属于同一峰的收集液混合，除去乙腈和酒石酸，冻干，即得胶原蛋白多肽；上述色谱条件为：溶液的浓度为90μg/mL、进样量为5μL、色谱柱为Agilent C18（250mm×4.6mm，5μm）、柱温为30℃、洗脱速度为1.0mL/min；酒石酸水溶液浓度为0.1%，乙腈和酒石酸水溶液的体积比为50:1，酒石酸中L-酒石酸和D-酒石酸的比例为90:1。
实施例3：
从鱼鳞中提取胶原蛋白多肽的方法，具体步骤为：
1）酶解：按底物浓度为10%向鱼鳞胶原蛋白中加入去离子水，调节pH至7.4，按加酶量为5.5%加入复合蛋白酶，然后在温度为30℃下酶解15h，酶解间隔1h用截留分子量为12kDa的超滤膜超滤10min，即得超滤液；上述复合蛋白酶中胶原酶和风味蛋白酶的重量比为1:0.8，去离子水含有0.2M氯化钾和5mM羧甲基纤维素钠；
2）纳滤：将超滤液经1kDa的纳滤膜纳滤，控制压力在0.3MPa，获得1kDa以上的浓缩多肽液，即为胶原蛋白多肽粗提液；
3）凝胶柱层析：将浓缩多肽液溶于双蒸水配成浓度为55mg/mL的溶液，在2℃、15000r/min下离心15min，去除不溶性杂质，上清液上样至柱子内进行层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高自由基清除活性的峰为凝胶柱层析酶解物；
4）RP-HPLC纯化：将凝胶柱层析酶解物用双蒸水配成溶液，利用高效液相色谱进行分离，流动相为乙腈和酒石酸水溶液，将属于同一峰的收集液混合，除去乙腈和酒石酸，冻干，即得胶原蛋白多肽；上述色谱条件为：溶液的浓度为100μg/mL、进样量为4μL、色谱柱为Agilent C18（250mm×4.6mm，5μm）、柱温为35℃、洗脱速度为0.8mL/min；酒石酸水溶液浓度为0.12%，乙腈和酒石酸水溶液的体积比为20:1，酒石酸中L-酒石酸和D-酒石酸的比例为93:1。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。