本发明属于生物医学
技术领域：
，具体涉及一种环介导等温扩增检测肺炎支原体的试剂盒及方法。
背景技术：
：肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae，mp)是一种介于病毒和细菌之间的无细胞壁型微生物，也是引起儿童社区获得性肺炎的重要病原体，四季均有病例出现，但以夏秋季发病为主。mp感染多见于学龄期儿童，在因呼吸道感染住院患儿中约占19.1-26％。除了引起肺部感染外，mp还可引起多种肺外并发症，从而引起多器官功能的损害。mp导致的肺炎早期临床表现、影像学检查等常常缺乏特异性，难以通过临床症状和体征来进行诊断，且mp对β内酰胺酶类抗生素无效，需要使用大环内酯类抗生素进行治疗，mp感染还可能导致一些严重的临床综合征，因此准确而快速诊断mp的感染至关重要。mp的实验室检测方法包括mp培养、血清学检测和核酸扩增技术(naat)。培养法是诊断mp感染的可靠标准，mp的临床分离株对监测其流行病学趋势也至关重要，但mp生长缓慢，通常需要2周以上才能看到结果，且培养阳性率低，因此不适用于临床常规检测。血清学检测是目前临床应用最广泛mp检测方法，包括明胶颗粒凝集实验、酶联免疫吸附试验、血清冷凝集实验及补体结合实验等。人体感染mp会产生特异性igm、iga及igg类抗体，恢复期和急性期mp抗体滴度呈4倍或4倍以上增高或减低时，可确诊为mp感染，但临床上较难采集双份血清进行检测，单份血清结果往往不能真实地反映患儿感染情况。虽然血清igm类抗体出现早于igg抗体，但免疫力低下患儿或2岁以下的婴幼儿因免疫系统发育不全，感染mp后抗体不产生从而导致假阴性。随着分子生物学的快速发展，naat逐渐经成为早期快速诊断mp感染的重要方法，其具有灵敏度高、特异性强等优点，且不受感染时间限制，也不受患儿免疫功能的影响，对于mp感染的早期诊断有重要意义。naat主要包括pcr法、实时荧光pcr法、多重pcr及环介导等温扩增(lamp)等，pcr法需要昂贵的pcr循环仪器，且对操作人员技术水平要求较高，难以在基层医疗单位广泛应用。2000年报道了一种新的核酸扩增方法—环介导等温扩增(lamp)，其原理是使用具有链置换活性的dna聚合酶和一组专门设计的引物在恒温条件下快速高效地扩增靶dna。与传统的检测方法相比，lamp的4个引物是根据靶序列的6个不同区域设计的，具有高度特异性，一旦有引物不匹配将导致反应不会发生。另外，lamp检测比pcr灵敏度高10-100倍，可以检测10拷贝甚至更少的模板。更重要的是，lamp反应成本低廉，操作简单，仅需要水浴锅等简单设备就能完成反应。lamp扩增结果可以通过使用染料直接查看，从而缩短检测时间。目前市场上已有使用lamp方法检测mp的试剂盒，但其需要反应60min，且需要在检测完成后打开反应管加入荧光染料sybrgreen观察颜色变化，由于lamp灵敏性极高，开盖后难以避免出现气溶胶污染，还需要在紫外灯设备，因此需要一种更快速的全程闭管的lamp检测mp的方法，直接肉眼观察颜色变化，从而减少污染并满足基层医疗单位的检测需求。技术实现要素：本发明针对现有技术中肺炎支原体检测速度慢、成本高以及操作复杂的技术问题，目的在于提供一种环介导等温扩增检测肺炎支原体的试剂盒，以满足基层医疗单位的检测需求。本发明的环介导等温扩增检测肺炎支原体的试剂盒包括引物组，所述引物组由seqidno:1所示的上游外部引物f3、seqidno:2所示的下游外部引物b3、seqidno:3所示的上游内部引物fip和seqidno:4所示的下游内部引物bip组成。具体地，上游外部引物f3:5'-ctggccaatccacccaac-3'；下游外部引物b3:5'-actggaaagggcagtacca-3'；上游内部引物fip:5'-accattgtcctccgagtccgatgtcaggggacaccaaagtc-3'；下游内部引物bip:5'-gatctcgccaacgctcccataaatcgtccgccttgagtt-3'。所述试剂盒还包括环介导等温扩增反应试剂和指示剂。所述试剂盒还包括肺炎支原体阳性质控标准品和/或作为阴性对照的无核糖核酸酶的水。所述环介导等温扩增反应试剂包括bst2.0dna聚合酶(m0537s，纽英伦生物技术)和10mmdntp混合物(a610056，生工生物)。所述指示剂为伊万绿色荧光染料(evagreen荧光试剂)、钙黄绿素或羟基萘酚蓝指示剂(hnb)金属离子指示剂，优选hnb，浓度优选为120μm。可通过颜色变化观察反应终点。在反应产物中加入evagreen荧光试剂，在紫外灯下观察颜色变化，绿色荧光为阳性，无绿色荧光为阴性；或在反应结束后加入钙黄绿素和mncl2，肉眼观察颜色变化，绿色为阳性，橙色为阴性。hnb是一种金属离子指示剂，其颜色随溶液ph变化而改变，lamp反应过程中mg2+与lamp反应产物焦磷酸镁结合产生大量沉淀，溶液中mg2+浓度降低，ph发生变化，从而使hnb的颜色由紫色变为蓝色。hnb与evagreen荧光试剂相比，不会受引物二聚体影响而产生假阳性，且不会对反应体系形成干扰，可直接添加在反应体系中，反正结束后直接肉眼观察颜色变化，不需要打开反应管，降低了污染的可能。所述外引物f3浓度为0.2μm、外引物b3浓度为0.2μm、内引物fip浓度为1.6μm、内引物bip浓度为1.6μm。上述检测肺炎支原体试剂盒，所述阳性质控标准品为肺炎支原体dna，其获得方法是培养肺炎支原体标准菌株，使用dna提取试剂盒提取肺炎支原体dna，从而得到阳性标准品。本发明的另一目的在于提供一种利用环介导等温扩增检测肺炎支原体的方法，该方法包括如下步骤：s1，提取样本dna；s2，将样本dna与引物组、环介导等温扩增反应试剂和指示剂混合得到混合物；s3，混合物置于64℃恒温水浴中反应15min，80℃反应20min灭活bst2.0dna聚合酶。s4，反应结束后观察颜色变化，以判断样本里是否具有肺炎支原体。在步骤s3中，混合物先短暂离心再置于64℃恒温水浴中反应15min。本发明的积极进步效果在于：本发明针对肺炎支原体p1基因的6个区域设计4条特异性引物，扩增产物具有高度的特异性。本发明在恒温条件下反应，不需要昂贵的温度循环仪器，仅需要水浴锅等恒温设备，大大降低了检测成本。本发明反应时间仅需要35min，提高了临床上对肺炎支原体感染的响应时间，更好的指导患者治疗。本发明仅需要观察颜色变化判断反应结果，不需要打开反应管，避免了交叉污染。本发明的试剂盒具有特异性强、灵敏度高等特点，检测肺炎支原体方便快捷、价格低廉，适用于基层医疗单位推广使用。附图说明图1为实施例1中环介导等温扩增检测肺炎支原体的试剂盒应用于临床样本时的检测结果照片；图2为本发明的中环介导等温扩增检测肺炎支原体试剂盒的灵敏性检测结果照片；图3为本发明的环介导等温扩增检测肺炎支原体试剂盒的特异性检测结果照片；其中，1为猪鼻支原体，2为金黄色葡萄球菌，3为肺炎链球菌，4为流感嗜血杆菌。具体实施方式实施例1环介导等温扩增检测肺炎支原体试剂盒的应用1)样本采集采集患儿鼻咽拭子标本，标本置于病原体采样液中保存。2)采用qiaampdnaminikit提取试剂盒(51306)提取样本dna：将标本全部置于2ml离心管中，13800rpm离心3min，吸去上清液丢弃，将沉淀吹打混匀，加入180μlbufferatl和20μlproteinasek，56℃水浴3h。加入200μlbufferal，70℃水浴10min，向离心管中加入200μl无水乙醇，充分混匀。将spincolumn置于collectiontube上，将混合溶液移至spincolumn中，8000rpm离心1min，弃滤液。将500μlbufferaw1加入spincolumn中，8000rpm离心1min，弃滤液。将500μlbufferaw2加入spincolumn中，13200rpm离心3min，弃滤液。将spincolumn置于collectiontube上，13200rpm离心1min。将spincolumn置于新的1.5mlcollectiontube上，在spincolumn膜中央处加入40μlddh2o，室温静置5min，8000rpm离心1min洗脱dna。3)lamp检测：将表1所示的newenglandbiolabsbst2.0dnapolymerase(m0537s)试剂盒的成分、生工生物10mmdntpmixture(a610056)和麦克林hnb指示剂(h810857)配置成lamp反应体系，具体组分的浓度见表1。表1lamp反应体系组成10×isothermalamplificationbuffer2.5μl100mmmgso41.5μl10μmf30.5μl10μmb30.5μl10μmfip4μl10μmbip4μl10mmdntp3.5μl8000u/mlbst2.0dna聚合酶1μl3mmhnb1μlddh2o4.5μl模板2μl总体积为25μl将反应管置于64℃恒温水浴锅中反应15min，80℃反应20min灭活bst2.0聚合酶。反应结束后观察颜色变化，lamp反应过程中mg2+与lamp反应产物焦磷酸镁结合产生大量沉淀，溶液中mg2+浓度降低，ph发生变化，从而使hnb的颜色由紫色变为蓝色，因此紫色为阴性，蓝色为阳性，结果见图1。实施例2环介导等温扩增检测肺炎支原体试剂盒灵敏度分析1)样本处理：采用qiaampdnaminikit提取试剂盒(51306)提取肺炎支原体标准菌株的dna作为模板，具体步骤：将菌液全部置于2ml离心管中，13800rpm离心3min，吸去上清液丢弃，将沉淀吹打混匀，加入180μlbufferatl和20μlproteinasek，56℃水浴3h。加入200μlbufferal，70℃水浴10min，向离心管中加入200μl无水乙醇，充分混匀。将spincolumn置于collectiontube上，将混合溶液移至spincolumn中，8000rpm离心1min，弃滤液。将500μlbufferaw1加入spincolumn中，8000rpm离心1min，弃滤液。将500μlbufferaw2加入spincolumn中，13200rpm离心3min，弃滤液。将spincolumn置于collectiontube上，13200rpm离心1min。将spincolumn置于新的1.5mlcollectiontube上，在spincolumn膜中央处加入40μlddh2o，室温静置5min，8000rpm离心1min洗脱dna。使用分光光度计测定dna浓度，通过分子量计算dna模板拷贝数为107copies/μl，10倍梯度稀释至101，每个梯度取2μl作为模板，拷贝数为107～101copies/μl。2)取10个0.5ml离心管，分别标记为107～101、阴性对照管；配置25μl反应体系，各管中依次加入以下成分，其浓度如下：反应混合液：10倍稀释的isothermalamplificationbuffer、6mmmgso4、1.4mmdntp、320u/mlbst2.0dna聚合酶、120μmhnb。引物：f30.2μm、b30.2μm、fip1.6μm、bip1.6μm。加样：离心管中分别加入108～101copies/μl的肺炎支原体dna及rnase-freewater2μl。lamp反应：短暂离心后将反应管置于64℃恒温水浴锅中反应15min，80℃反应20min灭活bst2.0聚合酶。反应结束后观察颜色变化，紫色为阴性，蓝色为阳性。检测结果如图2所示，可见该试剂盒检测的灵敏度为103copies/μl。实施例3环介导等温扩增检测肺炎支原体试剂盒实时特异性分析1)样本处理：采用qiaampdnaminikit提取试剂盒(51306)提取以下病原体的dna：猪鼻支原体、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌，具体步骤：将菌液全部置于2ml离心管中，13800rpm离心3min，吸去上清液丢弃，将沉淀吹打混匀，加入180μlbufferatl和20μlproteinasek，56℃水浴3h。加入200μlbufferal，70℃水浴10min，向离心管中加入200μl无水乙醇，充分混匀。将spincolumn置于collectiontube上，将混合溶液移至spincolumn中，8000rpm离心1min，弃滤液。将500μlbufferaw1加入spincolumn中，8000rpm离心1min，弃滤液。将500μlbufferaw2加入spincolumn中，13200rpm离心3min，弃滤液。将spincolumn置于collectiontube上，13200rpm离心1min。将spincolumn置于新的1.5mlcollectiontube上，在spincolumn膜中央处加入40μlddh2o，室温静置5min，8000rpm离心1min洗脱dna。将以上几种病原体dna及肺炎支原体dna分别作为反应模板。2)取6个0.5ml离心管，分别标记为猪鼻支原体、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、阴性对照管；配置25μl反应试剂，各管中依次加入以下成分，具体浓度如下：反应混合液：10倍稀释的isothermalamplificationbuffer、6mmmgso4、1.4mmdntp、320u/mlbst2.0dna聚合酶、120μmhnb。引物：f30.2μm、b30.2μm、fip1.6μm、bip1.6μm。加样：离心管中分别加入猪鼻支原体、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体的dna及rnase-freewater各2μl。lamp反应：短暂离心后将反应管置于64℃恒温水浴锅中反应15min，80℃反应20min灭活bst2.0聚合酶。反应结束后观察颜色变化，紫色为阴性，蓝色为阳性。检测结果如图3所示，该试剂盒检测只有肺炎支原体作为模板时产物呈蓝色，其余呼吸道病原体及阴性对照均呈紫色，表明本试剂盒具有较好的特异性。序列表<110>上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心<120>环介导等温扩增检测肺炎支原体的试剂盒及方法<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>18<212>dna<213>肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)<400>1ctggccaatccacccaac18<210>2<211>19<212>dna<213>肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)<400>2actggaaagggcagtacca19<210>3<211>41<212>dna<213>肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)<400>3accattgtcctccgagtccgatgtcaggggacaccaaagtc41<210>4<211>39<212>dna<213>肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)<400>4gatctcgccaacgctcccataaatcgtccgccttgagtt39当前第1页12