本发明涉及医药技术领域，尤其涉及萘磺酰胺乙酰胺类化合物及其应用和药物组合物。
背景技术
氧化应激是指由机体产生的活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)所介导的氧化与抗氧化物质失衡，从而引起机体组织细胞产生氧化损伤。氧化应激不仅可以直接导致机体细胞坏死，也可以通过激活机体内的氧化还原信号途径导致细胞衰老、凋亡，甚至坏死。机体产生氧化损伤是导致许多疾病发病的基础，也是机体多种疾病发病所共有的机制之一。大量研究表明，在肿瘤、心脑血管疾病、ⅱ型糖尿病、白内障、老年痴呆等疾病的发病过程有明显的ros反应增强，同时氧化应激损伤指标(如血清中mda)水平显著升高。因此，使用高活性、多功能抗氧化剂，清除ros、减轻氧化应激反应成为治疗多种疾病的新思路。
核因子e2相关因子2(nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2，nrf2)是一个富含亮氨酸拉链结构的转录因子，属于cap-n-collar(cnc)转录因子家族成员，是细胞和机体对抗氧化应激损伤的中枢调控者，普遍表达于各种组织和细胞中。生理条件下，nrf2在细胞质中与kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(kelch-likeech-associatedprotein1，keap1)结合，处于非活性、易降解的状态，在内外界自由基和化学物质刺激时，nrf2与keap1解离，进入细胞核与抗氧化反应元件(antioxidantresponseelement，are)结合，启动are下游的ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白、蛋白酶体/分子伴侣等基因转录和表达以抵抗内外界的有害刺激。nrf2及其信号通路与肿瘤、糖尿病、神经系统疾病、慢性肾功能衰竭、哮喘、慢性阻塞性肺病、自身免疫性疾病等多种疾病病理生理和发病过程密切相关，已成为广受关注的药物靶点。
因此，鉴定并发现keap1-nrf2抑制剂，对研究氧化应激相关疾病的临床治疗具有十分重要的意义。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
具有通式(i)的萘磺酰胺乙酰胺类化合物，或其异构体、溶剂合物或其前体，或其药物上可接受的盐：
其中，r1是氢、酰胺基、低级烷基、低级烷氧基、低级链烯基、环烷基、三唑环、芳基、杂芳基、饱和或部分不饱和杂环、芳烷基或杂芳基烷基；
r2是氢、羟基、氨基、任选取代的胺基、低级烷基、卤素、类卤素、低级烷氧基、低级链烯基、硝基、羟基亚胺烷基、三唑环、邻间对位取代或二取代的芳基、邻间对位取代或二取代的杂芳基、邻间对位取代或二取代的饱和或部分不饱和杂环；
r3是氢、羟基、氨基、任选取代的胺基、低级烷基、卤素、类卤素、低级烷氧基、低级链烯基、硝基、羟基亚胺烷基、三唑环、邻间对位取代或二取代的芳基、邻间对位取代或二取代的杂芳基、邻间对位取代或二取代的饱和或部分不饱和杂环。
具有上述通式(i)的萘磺酰胺乙酰胺类化合物，或其异构体、溶剂合物或其前体，或其药物上可接受的盐作为治疗氧化应激所引起的疾病的应用。
具有上述通式(i)的萘磺酰胺乙酰胺类化合物，或其异构体、溶剂合物或其前体，或其药物上可接受的盐作为keap1-nrf2蛋白-蛋白相互作用的抑制剂的应用。
一种药物组合物，它是以具有上述通式(i)的萘磺酰胺乙酰胺类化合物，或其异构体、溶剂合物或其前体，或其药物上可接受的盐，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
一种药物组合物，包括具有上述通式(i)的萘磺酰胺乙酰胺类化合物及药学上可接受的辅料。
上述技术方案中，具有上述通式(i)的萘磺酰胺乙酰胺类化合物，或其异构体、溶剂合物或其前体，或其药物上可接受的盐能够萘磺酰胺乙酰胺类化合物能够抑制抑制keap1-nrf2解离，进而达到预防、缓解或治疗代谢性疾病、炎症性疾病、缺血性疾病、神经系统疾病和组织损伤等氧化应激相关疾病。
附图说明
图1为nxpz-2浓度与蛋白结合响应图。
图2为不同浓度下nxpz-2与蛋白作用的时间与蛋白结合响应图。
图3为化合物nxpz-biotin浓度与alphascreen信号的关系图。
图4为nxpz-2对小鼠自发活动的影响图。
图5为nxpz-2对小鼠y迷宫实验影响图。
图6、图7为nxpz-2对小鼠跳台实验影响图。
图8、图9为nxpz-2对小鼠穿梭箱实验影响图。
图10、图11、图12、图13为nxpz-2对小鼠水迷宫影响图。
图14为nxpz-2对小鼠血清内游离的nrf2影响图。
图15为nxpz-2对小鼠受损海马的影响图。
图16、图17、图18为nxpz-2对小鼠心脏、肝脏、肾脏的影响图。
图19为nxpz-2对小鼠原代神经元细胞毒性的影响图。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，首次揭示新的能够抑制keap1-nrf2解离的萘磺酰胺乙酰胺类化合物或其异构体、溶剂合物、前体，或其药学上可接受的盐，通过抑制keap1-nrf2蛋白-蛋白相互作用，来治疗氧化应激所引起的疾病；其还可用于制备因氧化应激所引起的疾病的药物组合物。
术语：本文所用的术语“异构体”包括：几何异构体、对映异构体、非对映异构体(如顺反异构体，构象异构体)；本文所用的术语“溶剂合物”表示携带有溶剂分子的化合物，例如，所述的溶剂合物可以是水合物；本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中；本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质；本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的式(i)或(ii)化合物、异构体、溶剂合物、前体，或它们的药学上可接受的盐传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。
以下详细介绍本发明所揭露的技术方案：
具有通式(i)的萘磺酰胺乙酰胺类化合物，或其异构体、溶剂合物或其前体，或其药物上可接受的盐：
其中，r1是氢、酰胺基、低级烷基、低级烷氧基、低级链烯基、环烷基、三唑环、芳基、杂芳基、饱和或部分不饱和杂环、芳烷基或杂芳基烷基；
r2是氢、羟基、氨基、任选取代的胺基、低级烷基、卤素、类卤素、低级烷氧基、低级链烯基、硝基、羟基亚胺烷基、三唑环、邻间对位取代或二取代的芳基、邻间对位取代或二取代的杂芳基、邻间对位取代或二取代的饱和或部分不饱和杂环；
r3是氢、羟基、氨基、任选取代的胺基、低级烷基、卤素、类卤素、低级烷氧基、低级链烯基、硝基、羟基亚胺烷基、三唑环、邻间对位取代或二取代的芳基、邻间对位取代或二取代的杂芳基、邻间对位取代或二取代的饱和或部分不饱和杂环。
其中，所述萘磺酰胺乙酰胺类化合物选自以下化合物中的任意一种：
2-(n-(4-(4-氨基-n-(2-氨基-2-乙酰基)苯磺酰胺)-1-萘基)-4-甲氧基苯磺酰胺)乙酰胺、
2-(n-(4-(4-硝基-n-(2-氨基-2-乙酰基)苯磺酰胺)-1-萘基)-4-甲氧基苯磺酰胺)乙酰胺、
2-(n-(4-(4-氨基-n-(2-氨基-2-乙酰基)苯磺酰胺)-1-萘基)-4-甲氧基苯磺酰胺)乙酸、
2-(n-(4-(n-(2-氨基-2-乙酰基)-4-硝基苯磺酰胺)-1-萘基)-4-甲氧基苯磺酰胺)乙酸、
2-(n-(4-(4-甲氧基苯磺酰胺)-1-萘基)-4-硝基苯磺酰胺)乙酰胺、
2-(4-氨基-n-(4-甲氧基苯磺酰胺)-1-萘基)-苯磺酰胺)乙酰胺、
4-((4-(n-(2-氨基-2-乙酰基)-n-(4-(n-(2-氨基-2-乙酰基)-4-甲氧基苯磺酰胺)-1-萘基)苯磺酰胺-4-氧代丁酸
作为本发明的第二方面，所述的“药学上可接受的盐”是指化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、二磷酸、氢溴酸；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、乳酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、水杨酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、富马酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯，或其它常规的“前体药物”的形式。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。
所述的“化合物的前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成结构式(i)的一种化合物，或化学结构式(i)的一个化合物所组成的盐或溶液。
上述具有通式(i)的萘磺酰胺乙酰胺类化合物，或其异构体、溶剂合物或其前体，或其药物上可接受的盐的应用：本发明人发现，具有通式(i)的萘磺酰胺乙酰胺类化合物，或其异构体、溶剂合物或其前体，或其药物上可接受的盐能够用于治疗氧化应激所引起的疾病，例如，萘磺酰胺乙酰胺类化合物用于预防、缓解或治疗代谢性疾病、炎症性疾病、缺血性疾病、中枢神经系统疾病和组织损伤等氧化应激相关疾病。其中，所述的代谢性疾病、炎症性疾病、缺血性疾病、中枢神经系统疾病等氧化应激相关疾病包括：糖尿病及其并发症、高血压及其并发症、缺血性心肌病、动脉粥样硬化、脑卒中、慢性肾病、阿尔茨海默症、癫痫、抑郁症、帕金森病、生殖系统疾病；所述的组织损伤包括：脑组织损伤、血管损伤、胰腺损伤。
进一步的，上述萘磺酰胺乙酰胺类化合物通过抑制keap1-nrf2蛋白-蛋白相互作用，来抑制keap1-nrf2解离，进而实现氧化应激所引起的疾病的治疗，故萘磺酰胺乙酰胺类化合物也可用于制备keap1-nrf2蛋白-蛋白相互作用抑制剂，keap1-nrf2通路作为抗氧化应激关键通路，是介导细胞内解毒作用的关键元件。
基于上述应用，本发明还提供一种药物组合物，它是以具有通式(i)的萘磺酰胺乙酰胺类化合物，或其异构体、溶剂合物或其前体，或其药物上可接受的盐，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。该药物组合物可以预防、缓解或治疗代谢性疾病、炎症性疾病、缺血性疾病、中枢神经系统疾病和组织损伤。
一般地，所述治疗因氧化应激所引起的疾病的药物组合物含有按照重量比例为0.001-50％的所述具有通式(i)的萘磺酰胺乙酰胺类化合物，或其异构体、溶剂合物或其前体，或其药物上可接受的盐。所述药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物机体的剂型都是可以的。比如可选自：溶液、悬浮液、片剂、胶囊、粉末、颗粒或糖浆。根据本发明的化合物所治疗的疾病类型，本领域人员可以选择方便应用的剂型。例如，萘磺酰胺乙酰胺类化合物作为活性成分的有效施用剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。然而，通常当本发明的化合物每天以约0.005-500mg/kg动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以1-3次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
以下通过实验，来说明上述萘磺酰胺乙酰胺类化合物能够用于治疗氧化应激所引起的疾病，应理解，这些实验仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围：
以下介绍上述萘磺酰胺乙酰胺类化合物的合成，应理解，这些介绍仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围：
萘磺酰胺乙酰胺类化合物的合成，合成路线如下：
以下具体介绍合成路线中的各阶段化合物的过程：
化合物2的合成：
将1-氨基-4-硝基萘(7g,37.2mmol)溶于600ml二氯甲烷中，滴加三乙胺(15.47ml,112mmol)，加入4-二甲氨基吡啶(0.454g,3.72mmol)后，0℃下缓慢加入二碳酸二叔丁酯(9.41ml,40.9mmol)，滴加完毕反应液45℃下反应20小时。tlc(20％etoacinpe,rf＝0.5)监测显示反应完全。将混合物浓缩至200ml，再用水洗(200mlx3),饱和食盐水洗(200mlx3),再用na2so4干燥，所得产物用柱层析(10％etoacinpe)分离得到目标化合物2(8.4g,收率78％，黄色固体)。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ8.79(d,j＝8.7hz,1h),8.36(d,j＝8.7hz,1h),8.24(d,j＝9.0hz,1h),7.95(d,j＝8.4hz,1h),7.76(t,j＝7.8hz,1h),7.67(t,j＝7.8hz,1h),1.60(s,9h).
化合物3的合成：
化合物2(10g,34.7mmol)溶于100ml乙酸中，缓慢加入还原铁粉(7.75g,139mmol)，加毕，将混合物加热到50℃反应1小时。tlc(33％etoacinpe,rf＝0.4)监测显示反应完全。用nahco3(168g)调节ph约为9，混合物用乙酸乙酯(500mlx6)萃取，合并有机相，并用饱和食盐水洗涤，用na2so4干燥，所得产物用柱层析(0-30％etoacinpe)分离得到目标化合物3(8g,收率89％，黄色固体)。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.92-7.83(m,2h),7.56-7.46(m,3h),6.77(d,j＝7.8hz,1h),6.46(s,1h),1.53(s,9h).
化合物4的合成：
将化合物3(1g,3.87mmol)溶于5ml吡啶中，0℃下加入4-甲氧基苯磺酰氯(0.880g,4.26mmol)，混合物保持0℃反应3小时。tlc(etoac/pe＝1:5,rf＝0.25)监测显示反应完全。反应液中加入50ml水，析出固体，静置待固体沉底后，倒出液体，残留固体中加入乙酸乙酯(10ml)和石油醚(30ml)搅拌10分钟，过滤，得到的固体用石油醚清洗，获得目标化合物4(1.3g,收率78％，白色固体)。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.99(d,j＝7.8hz,1h),7.83(d,j＝8.1hz,1h),7.73(d,j＝8.1hz,1h),7.73(d,j＝7.8hz,2h),7.52-7.42(m,2h),7.12(d,j＝8.4hz,1h),6.95(s,1h),6.89(s,1h),6.84(d,j＝8.7hz,2h),3.81(s,3h),1.56(s,9h).
化合物5的合成：
将化合物4(1g,2.334mmol)溶于10ml二氯甲烷中，再加入三氟乙酸(2ml,26.8mmol)，反应液在室温搅拌2小时，tlc(etoac/pe＝2:1,rf＝0.2)监测显示反应完全。混合物用饱和nahco3(100ml)中和，再用dcm(100mlx2)萃取，有机相用水洗(100mlx2)，饱和食盐水洗涤(50ml)，再用无水na2so4干燥，过滤不溶物，浓缩得到目标化合物5(0.7g,2.132mmol,收率91％，白色固体)。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.88(d,j＝9.3hz,1h),7.77(d,j＝9.0hz,1h),7.63(d,j＝9.0hz,2h),7.46-7.41(m,2h),7.01(d,j＝7.8hz,1h),6.83(d,j＝8.7hz,2h),6.62(d,j＝7.8hz,1h),6.48(s,1h),3.81(s,3h).
化合物6的合成：
将化合物5(500mg,1.523mmol)溶于5ml吡啶中，0℃下加入对硝基苯磺酰氯(405mg,1.827mmol)，在0℃继续搅拌3小时，tlc(etoac/pe＝1:3,rf＝0.3)监测显示反应完全。混合液中加入50ml水，析出固体，静置至固体沉底，倒出上清液，残留固体中加入乙酸乙酯(10ml)和石油醚(30ml)搅拌10分钟，过滤，得到的固体用石油醚清洗，获得目标化合物6(0.34g,收率43.5％，白色固体)。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ8.22(d,j＝8.67,hz,2h),8.00–7.76(m,4h),7.57(d,j＝8.76hz,2h),7.35–7.27(m,2h),7.17(s,2h),6.90(d,j＝8.73hz,2h),3.79(s,3h).
2-(n-(4-(4-硝基-n-(2-氨基-2-乙酰基)苯磺酰胺)-1-萘基)-4-甲氧基苯磺酰胺)乙酰胺(nxpz-1)的合成：
将化合物6(250mg,0.487mmol)，碳酸钾(202mg,1.460mmol)溶于2mldmf中，缓慢加入2-溴乙酰胺(168mg,1.217mmol)。加毕，反应液在室温继续搅拌2小时，tlc(meoh/dcm＝1:10,rf＝0.5)监测显示反应完全。混合液中加入50ml水，析出固体，过滤，所得固体分别用水和石油醚洗涤，干燥后得到目标化合物nxpz-1(300mg,0.478mmol,收率98％)。
2-(n-(4-(4-氨基-n-(2-氨基-2-乙酰基)苯磺酰胺)-1-萘基)-4-甲氧基苯磺酰胺)乙酰胺(nxpz-2)的合成：
将nxpz-1(2.5g,3.89mmol)溶于2ml甲醇中，加入5％钯碳(0.828g,0.389mmol)，氢气氛下室温还原15小时，tlc(dcm/meoh＝10:1,rf＝0.5)监测显示反应完全。硅藻土过滤反应物，浓缩滤液，所得固体中加入少许甲醇，室温搅拌1小时后冷却至0℃析出新固体，过滤，用少量冷甲醇洗涤获得目标化合物nxpz-2(1.8g,2.94mmol,收率76％，白色固体)。1hnmr(600mhz,meod):δ8.25–8.06(m,2h),7.59–7.56(m,2h),7.51–7.47(m,2h),7.35–7.28(m,2h),7.15–7.10(m,1h),7.04–7.03(m,2h),6.98–6.96(d,j＝8.76hz,1h),6.67–6.58(m,2h),4.46–4.24(m,4h),3.86(d,j＝27.55hz,3h).13cnmr(150mhz,meod):δ173.02,172.71,165.13,155.03,139.29,138.44,134.71,134.37,131.60,131.50,131.31,130.96,130.65,128.45,128.22,127.96,127.91,127.75,126.03,125.46,124.37,124.11,115.22,114.17,114.11,56.39,56.25,55.73,55.55.ms(esi+)m/z:1195.07[2m+h]+.
2-(n-(4-(4-氨基-n-(2-氨基-2-乙酰基)苯磺酰胺)-1-萘基)-4-甲氧基苯磺酰胺)乙酸(nxpz-3)的合成：
合成方法同nxpz-2。1hnmr(600mhz,meod):δ8.25–8.03(m,2h),7.59–7.55(m,2h),7.51–7.47(m,2h),7.35–7.28(m,2h),7.04–7.00(m,2h),6.98–6.94(m,2h),6.67–6.57(m,2h),4.54–4.24(m,4h),3.86(m,3h).ms(esi+)m/z:1218.79[2m+na]+
2-(n-(4-(n-(2-氨基-2-乙酰基)-4-硝基苯磺酰胺)-1-萘基)-4-甲氧基苯磺酰胺)乙酸(nxpz-4)的合成：
合成方法同nxpz-2。1hnmr(600mhz,meod):δ8.12–8.06(m,2h),8.01–7.94(m,2h),7.92–7.87(m,2h),7.65–7.48(m,4h),7.25–6.96(m,4h),4.75–4.64(m,2h),4.40-4.36(m,2h),3.81(m,3h).ms(esi+)m/z:1256.94[2m+h]+
2-(n-(4-(4-甲氧基苯磺酰胺)-1-萘基)-4-硝基苯磺酰胺)乙酰胺(nxpz-5)的合成：
合成方法同nxpz-2。1hnmr(300mhz,meod):δ8.30–8.24(m,2h),8.08–7.97(m,1h),7.88–7.86(m,3h),7.62–7.57(m,2h),7.45–7.36(m,2h),7.20–7.11(m,2h),6.99–6.92(m,2h),4.40–4.22(m,2h),3.82(d,j＝29.17hz,3h).13cnmr(600mhz,meod):δ172.70,172.29,165.08,164.67,151.74,151.56,146.89,145.77,136.95,135.57,135.17,134.18,134.07,133.70,132.63,131.97,131.47,130.88,130.76,130.49,129.71,129.23,128.63,128.17,127.96,127.79,127.68,125.74,125.25,124.99,124.89,124.60,124.28,123.96,123.22,115.18,56.27,56.20,55.54,55.42.ms(+esi)m/z:1163.03[2m+na]+
2-(4-氨基-n-(4-甲氧基苯磺酰胺)-1-萘基)-苯磺酰胺)乙酰胺(nxpz-6)的合成：
合成方法同nxpz-2。1hnmr(600mhz,meod)δ8.17–7.94(m,2h),7.60–7.53(m,2h),7.44–7.29(m,4h),7.16–6.92(m,4h),6.64–6.56(m,2h),4.39–4.23(m,2h),3.84(d,j＝42.61hz,3h).13cnmr(150mhz,meod)δ173.12,172.87,165.06,154.35,135.80,135.52,134.08,131.78,131.49,131.36,130.74,130.42,130.34,128.46,127.99,127.72,127.65,127.36,126.71,125.86,125.42,124.50,124.13,123.41,122.82,115.15,114.11,56.29,56.18,56.79,55.64.ms(+esi)m/z:563.30[m+na]+
生物素标记的nxpz分子探针制备：
合成nxpz分子探针，合成路线如下：
4-((4-(n-(2-氨基-2-乙酰基)-n-(4-(n-(2-氨基-2-乙酰基)-4-甲氧基苯磺酰胺)-1-萘基)苯磺酰胺-4-氧代丁酸(nxpz-7)的合成：
将nxpz-2(100mg,0.167mmol)溶于10ml甲苯中，加入无二酸酐(38.2mg,0.335mmol)，混合物在氮气保护下110℃反应5小时，tlc(dcm/meoh+1％acoh,rf＝0.2)显示大部分原料反应生成新物质。将反应液冷却至室温，将其浓缩后用制备板分离(展开剂：dcm/meoh＝10:1+1％acoh)得到化合物7(80mg,0.112mmol,收率67.2％，白色固体)。1hnmr(600mhz,meod):δ10.11(d,j＝51.37hz,1h),7.69–7.55(m,2h),7.24-7.14(m,2h),6.92-6.89(m,6h),6.73–6.68(m,2h),6.47–6.12(m,6h),3.67–3.46(m,4h),3.20(d,j＝34.98hz,3h),1.84–1.75(m,4h),1.62–1.53(m,2h).
化合物8的合成：将化合物7(20mg,0.028mmol)溶于2ml四氢呋喃中，加入pybop(16.08mg,0.031mmol),n-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺(4.95mg,0.031mmol)和三乙胺(3.90μl,0.028mmol)，混合液室温搅拌8小时后，浓缩反应液，用制备板分离(展开剂：dcm/meoh＝10:1)得到化合物8(19mg,0.022mmol,收率79％，白色固体)。1hnmr(600mhz,meod):δ8.15–8.08(m,2h),7.81–7.69(m,2h),7.62–7.56(m,4h),7.49–7.7.45(m,2h),7.16–7.13(m,1h),7.09–7.04(m,2h),6.98–6.96(m,1h),4.49–4.32(m,4h),3.87(d,j＝31.27hz,3h),3.25–3.13(m,4h),2.49–2.43(m,2h),2.31–2.27(m,2h),2.00–1.94(m,4h),1.41(s,9h).
nxpz-biotin的合成：将化合物8(15.00mg,0.018mmol)溶于3ml二氯甲烷中，加入三氟乙酸(0.131ml,1.757mmol)，室温搅拌2小时，tlc(dcm/meoh＝5/1,rf＝0.4)显示反应完全，浓缩得到粗产品直接用于下一步。将粗品溶于2mldmf中，加入diea(0.014ml,0.086mmol)和(+)生物素-n-琥珀酰亚胺基酯(8.83mg,0.026mmol，cas：35013-72-0)，室温搅拌15小时后，加水(15ml)用乙酸乙酯(10ml)萃取，水相再用乙酸乙酯(5ml)萃取三次，合并有机相后用饱和食盐水(5mlx2)洗涤，用无水na2so4干燥，过滤不溶物，浓缩得到粗品，用柱层析(dcm/meoh＝10:1)分离得到目标化合物nxpz-biotin(8mg,8.16μmol,收率47.3％，淡黄色固体)。1hnmr(600mhz,meod):δ8.18–8.11(m,2h),7.82–7.79(m,1h),7.72–7.70(m,1h),7.64–7.49(m,6h),7.15–7.13(m,1h),7.08–7.06(m,2h),7.00–6.97(m,1h),4.46–4.33(m,6h),3.88(d,j＝31.93hz,3h),3.19–3.16(m,2h),3.01–2.98(m,1h),2.92–2.88(m,1h),2.70–2.65(m,1h),2.49–2.43(m,2h),2.33–2.20(m,4h),2.05–1.95(m,4h),1.75–1.56(m,4h),1.43–1.40(m,2h).hrmsm/z:980.3098[m+h]+。hplc纯度(仪器：agilent1260；分离株：hypersilods2column，elitehplc,4.6*250mm,5μm；流动相：甲醇；流速：0.6ml/min):97.46％，rt＝24.964min，uv254nm.
biacore实验测试分子水平活性
使用biacoretmt200型(gehealthcare)仪器开展表面等离子共振实验。将keap1蛋白偶联到cm5芯片上，偶联方法为：先用空白芯片静电吸附测试预富集能力，再用edc、nhs处理以活化芯片表面，然后进样配体，偶联600s，最终采用ethanolamine封闭芯片表面。化合物用pbs2倍稀释，起始浓度为1μm。采用kinetics/affinity程序进样，样品以流速30μl/min；进样时间120s；解离时间120s。得到的数据用采用biacoret200evaluationsoftware进行分析获得kd值，如下表1。化合物nxpz-2的biacore实验测试分子水平活性如图1、2所示。图中可以看出，nxpz-2的添加浓度大于100nm时，达到全抑制作用。
表1
alphascreen分子水平活性验证
在nxpz-2上引入生物素，获得nxpz-biotin探针，其中生物素用于识别供体磁珠；将keap1上引入his-tag标记，用于识别受体磁珠。运用化学发光alphascreen测试小分子与keap1的结合能力，如图3所示，his-keap1设置为1000nm时，nxpz-biotin的结合ec50为120nm；his-keap1设置为500nm时，nxpz-biotin的结合ec50为170nm。
以下将萘磺酰胺乙酰胺类化合物注射至小鼠体上，进行药物测试，请同时参看图4至图17，其中图4至图17中的control代表对照组，灌胃给予生理盐水；model代表模型组，灌胃给予生理盐水；donepezil代表阳性药物多奈哌齐组，灌胃给药1mg/kg；low代表nxpz-2低剂量组，灌胃给药52.5mg/kg；middle代表nxpz-2中剂量组，灌胃给药105mg/kg；high代表nxpz-2高剂量组，灌胃给药210mg/kg。
旷场(open-fieldtest)实验
采用双侧海马立体定位注射aβ1-42寡聚体，建立阿尔兹海默症(alzheimerdisease，ad)小鼠模型。两周后，分别灌胃给与低、中、高剂量的化合物nxpz-2(52.5，105，210mg/kg)，并设置阳性对照组(多奈哌齐，donepezil，1mg/kg)和溶剂对照组。两周后，测试行为学，观察化合物nxpz-2对小鼠认知功能的改善作用。将小鼠置于旷场实验箱正中格，同时进行摄像，记录5分钟内小鼠的活动总距离。测试结果如图4结果显示，各组小鼠5分钟内自由活动的距离无统计学差异，说明化合物并不改变小鼠的自发活动能力。
y迷宫实验
如图5，将小鼠置于y型迷宫的任一臂，观察记录8分钟内小鼠进入各个臂的顺序，计算依次交替进入三个臂的比例，评价其空间识别记忆能力。由图5看出给药后，小鼠交替进入三个臂的比例增加(**p<0.01vscontrol,#p<0.05,##p<0.01vsmodel)，并且呈剂量依赖增加，说明化合物能够改善ad小鼠的空间识别记忆能力。
跳台实验
如图6、7，在方形空间中心设置一个高的站台，底部铺以电棒可以通电。将小鼠置于站台上，记录小鼠第一次跳下站台的潜伏期及5分钟内跳下站台的总次数，评价其被动回避伤害性刺激的能力。实验共进行两天，第一天为适应学习期，第二天为测试期。测试结果如图6、图7显示，由图6看出给药后，潜伏期延迟(*p<0.05vscontrol,#p<0.05vsmodel)，由图7看出，随着药物剂量的增大小鼠跳下站台的总次数即错误次数减少(**p<0.01vscontrol,#p<0.05,##p<0.01vsmodel)，说明化合物能够改善ad小鼠的学习记忆能力。
穿梭箱实验
如图8、9，穿梭箱底部为不锈钢栅，使用电流加非条件刺激，电击动物足底。顶部配置有噪声发生器以及光源，用来产生条件刺激。条件刺激数秒钟后电击。若在铃声刺激安全间隔期内小鼠逃向安全区则为主动回避反应；如果在条件刺激安全间隔期内小鼠未逃向安全区，则通以交流电击后逃向安全区的为被动回避反应阳性，否则为主动、被动回避反应阴性，以此为一个循环周期。经过反复训练后，只给条件刺激，小鼠即逃到对侧安全区以逃避电击，即形成了条件反射或称主动回避反应，计算机自动控制系统可记录相关的动物行动参数。每天进行20个循环的测试，连续五天，记录主动回避次数及被动回避次数，评价小鼠通过学习能主动回避有害刺激的能力，反应小鼠的学习记忆能力。如图8、图9，在测试期内，各组小鼠的主动回避次数每天都在增加，被动回避次数减少。并且给药后，ad小鼠的主动回避次数呈剂量依赖地增加，而被动回避次数减少。说明化合物能够提高ad小鼠的学习记忆能力。
morris水迷宫
将小鼠置于恒温(18-22℃)游泳池内，第一至五天进行定位航行试验，其中，第一、二天，平台有旗子作为指示，三至五天，撤去旗子。每天将小鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中若干次，记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间(潜伏期)。第六天进行空间探索试验，即在定位航行试验后撤去平台，然后任选一个入水点将小鼠放入水池中，记录其在3分钟内的游泳轨迹，考察小鼠对原平台的记忆情况。如图10、图11，各组小鼠在第1-2天的可见定位航行试验和第3-5天的隐藏定位航行试验中的潜伏期均依次缩短，给药组与模型组有显著差异。如图12、图13，在空间探索试验中，给药组小鼠穿越原平台所在象限的次数和停留时间均显著增多(**p<0.01vscontrol,#p<0.05,##p<0.01vsmodel)，说明化合物可改善ad小鼠的学习记忆能力。
血清nrf2水平
行为学实验结束后，测试各组小鼠血清中nrf2的水平。如图14结果表明，ad模型小鼠血清nrf2水平最低，给药后，小鼠血清nrf2水平呈剂量依赖性增高(**p<0.01vscontrol,##p<0.01vsmodel)，说明化合物能够促进keap1-nrf2解离，增加血清中游离的nrf2含量，从而发挥抗氧化应激的作用。
组织he染色
收集小鼠主要的组织器官，包括脑、心脏、肝脏、肾脏，进行he染色，观察给药对各个组织器官的影响。如图15，ad模型小鼠海马区域的神经细胞数量明显减少，细胞肿胀，核结构模糊，结构轮廓模糊，大小形态不规则，排列稀疏。给药后，海马数量和形态均不同程度恢复，锥体细胞数量增多，无明显肿胀，结构完整，细胞排列整齐、致密，说明化合物nxpz-2能够改善受损的海马形态。如图16、17、18，各组小鼠心脏、肝脏、肾脏并未发生病理改变，说明在实验给药剂量下，该化合物对动物安全无毒。
原代神经元细胞毒性试验
取16-18天孕鼠，分离胎鼠的大脑皮层，培养原代神经元细胞，第7天给与不同浓度的化合物nxpz-2，24小时后利用cck-8试剂盒检测细胞活力。如图19，200m及以下的浓度对细胞活力均无影响，说明该化合物在本实验的给药剂量下，对神经元细胞无毒。
以上实验结果表明，萘磺酰胺乙酰胺类化合物能够靶向作用于keap1-nrf2蛋白-蛋白相互作用，使得nrf2解离入核，诱导ii相解毒酶，发挥抗阿尔茨海默症(老年痴呆症)作用，从而治疗keap1-nrf2过度相互作用相关疾病；能够用于制备抗糖尿病及其并发症、高血压及其并发症、缺血性心肌病、动脉粥样硬化、脑卒中、慢性肾病、阿尔茨海默症、癫痫、抑郁症、帕金森病、生殖系统疾病以及脑组织损伤、血管损伤、胰腺损伤等氧化应激相关疾病的治疗药物。