一种人脐带间充质干细胞种子库的构建方法及检测平台与流程

本发明涉及干细胞库技术领域，特别涉及一种人脐带间充质干细胞种子库的构建方法及检测平台。

背景技术：

脐带间充质干细胞(umbilicalcordmesenchymalstemcells，ucmscs)，是指存在于脐带华通氏胶(wharton’sjelly)和血管周围组织中的一种间充质干细胞，具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。来源于脐带的间充质干细胞因其取材方便，无道德伦理争议，可获取的细胞数量多、增殖能力强、免疫调节作用大，分泌细胞生长因子的总量也非常高，便于扩增和传代，在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景，是间充质干细胞的理想来源。

脐带间充质干细胞具有重要的临床用途：

①造血干细胞移植：增强造血功能,促使造血干细胞移植物的植入,治疗移植物抗宿主病(gvhd)。

②组织损伤的修复：骨、软骨、关节损伤、心脏损伤、肝脏损伤、脊髓损伤和神经系统疾病。

③自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、硬皮病、炎性肠炎等。

④作为基因治疗的载体。

干细胞种子库是一个采用可数字化、可工程化、可应急处理的深低温(-196℃)储存系统，是运输、制备、质量检测、保存干细胞种子以及相关资料和信息的场所。脐带间充质干细胞库的主要工作是将新生儿的脐带采集后经过检测、分离、培养、冷冻后储存起来，并在需要时可以将健康的间充质干细胞和相关资料供临床使用。

随着目前全球健康产业的兴起，细胞治疗成为医学界的主要研究课题，而这其中干细胞疗法是当今医学研究最前沿也是最热门的方向之一，发展迅猛。因此，建立并优化干细胞种子库变得尤为重要。但是现有的干细胞建库方法尚存在缺点，例如：分离步骤繁多，污染风险大，引入外源性动物蛋白，检测项目不全面，信息化建设不完善等。

申请号为：200510015492.2中国发明专利公开了一种人胎盘、脐带间充质干细胞库及其构建方法，本发明的构建步骤包括：(1)取人胎盘、脐带进行检测，用磷酸缓冲液冲洗涤后粉碎，加磷酸缓冲液稀释；(2)加入胶原酶消化40～70分钟；(3)加入磷酸缓冲液稀释；(4)加入胰酶消化10～30分钟，加入血清终止反应；(5)将步骤(2)及步骤(4)所获得的细胞混合，离心，弃去上清液，用磷酸缓冲液洗涤，再离心，弃去上清液，即获得间充质干细胞；(6)将间充质干细胞置液氮冷冻，按其abo/rh分型和hla分型进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出人胎盘、脐带间充质干细胞库。

申请号为：200910055219.0的中国发明专利公开了一种利用新生儿脐带为资源的脐带间充质干细胞库的构建方法，本发明由下述步骤组成：(1)取人脐带进行abo/rh血型检测、hla分型检测、微生物免疫检测、用缓冲液冲洗去除残留血液，剪碎，获得人脐带组织；(2)向步骤(1)所获得人脐带组织中加入1-3倍体积的0.05％-0.2％胶原酶消化，所述胶原酶消化温度为37℃，消化时间为2h，并获得消化后组织；(3)加入缓冲液稀释步骤(2)消化后组织，混匀、离心，离心力为600g，时间为15分钟；(4)弃上清，加入缓冲液重悬步骤(3)沉淀，过200目筛网，收集滤液，离心，离心力为450g，时间为10分钟，重复两次，即获得人脐带间充质干细胞；(5)将步骤(4)得到的人脐带间充质干细胞按2×104/cm2接种于塑料培养皿，用含10％fbs的lg-dmem培养基，置37℃、5％co2培养箱培养，2天后换液，弃去非贴壁细胞，以后每3天后换液，待细胞80％汇合，0.25％胰酶消化，按1∶3传代，扩增后得到大量间充质干细胞，并用冷冻保护剂预处理，分装放入冻存管，所述冷冻保护剂由10％dmso、10％右旋糖苷和80％lg-dmem组成。(6)将步骤(5)获得的人脐带间充质干细胞置液氮保存，按其abo/rh分型和hla分型进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出人脐带间充质干细胞库。

上述方法存在一些缺点和不足：分离培养步骤较为繁琐，操作耗材耗时；对细胞检测覆盖性不足；试剂中含有外源性蛋白对间充质干细胞的安全性产生影响；信息化建设不够完善。

技术实现要素：

本发明针对上述现有技术中存在的问题，提出一种人脐带间充质干细胞种子库的构建方法及检测平台，简化了分离步骤，减少了耗能耗材，提高了细胞收集效率，适用于规模化建库及生产应用。

为解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明提供一种人脐带间充质干细胞种子库的构建方法，其包括以下步骤：

s11：取人脐带进行安全性检测；

s12：对人脐带进行分离纯化，得到人脐带间充质干细胞；

所述步骤s12具体包括：

s121：对人脐带进行消毒后，用冲洗液进行冲洗；

s122：剪取冲洗后的人脐带的根部预设长度，去除血管和淤血后，用冲洗液进行冲洗；

s123：将步骤s122得到的人脐带标本放置于培养瓶中，剪成预设大小的小块，加入培养基，混匀后进行离心，弃去上清，然后再进行离心，去除冲洗液残留；

s124：将步骤s123中离心沉淀的组织块与培养基混匀后移入培养箱中进行培养；

s13：对所述人脐带间充质干细胞进行扩增；

s14：对所述人脐带间充质干细胞进行冻存。

较佳地，所述步骤s124中的培养基为细胞无血清培养基。

较佳地，所述步骤s124中在培养过程中对培养基进行一次或多次更换，细胞培养效果更好，培养速度更快。

较佳地，所述步骤s121中的冲洗液为d-hank′s平衡盐溶液；和/或，所述步骤s122中的冲洗液为d-hank′s平衡盐溶液。以往细胞培养中所用的缓冲溶液主要是磷酸缓冲液(pbs)，而d-hank′s平衡盐溶液中盐成分较pbs复杂,无机盐浓度接近大部分动植物细胞的水平，可在分离、培养过程中减少对细胞的损伤。

较佳地，所述步骤s14具体包括：待所述人脐带间充质干细胞的融合率达到预设要求时，吸取预设容量的原培养液加入离心管留样，送至微生物免疫进行支原体检测，吸取预设容量的原培养液，送至微生物免疫进行细菌检测，离心前吸取两份预设容量的细胞悬液样本，一份使用流式细胞仪检测特征表面标记鉴定所得细胞为间充质干细胞，另一份送至微生物免疫进行tp53抑癌基因检测以及内毒素检测；离心后将沉淀细胞与细胞无血清冻存液混匀后移入冻存管进行冻存。

较佳地，所述步骤s14中的离心后将沉淀细胞与细胞无血清冻存液混匀后移入冻存管进行冻存之前还包括：离心后收集一部分沉淀细胞来绘制成长曲线，来判断细胞活力。

较佳地，所述步骤s11中的安全性检测包括：hla分型检测、abo/rh血型检测、hiv免疫检测、乙肝表面抗原检测、丙肝表面抗原检测、梅毒抗体检测以及巨细胞病毒抗体检测中的一种或多种。

较佳地，所述步骤s14之后还包括：

s15：对所述人脐带间充质干细胞进行分化；

具体为：将所述人脐带间充质干细胞分化为成骨细胞、肝样细胞以及脂肪细胞中的一种或多种。

较佳地，所述步骤s14之后还包括：

s16：建立检测平台，对人脐带间充质干细胞种子库的构建进行信息化建设与管理。

较佳地，所述步骤s16包括：

s161：将所述步骤s11至步骤s14的信息及数据录入所述检测平台中，建立可供检索的操作记录和细胞信息档案；

s162：对所述检测平台的环境及步骤s11至步骤s14中的设备数据进行监测，并在出现异常时进行报警；

s163：定期对所述检测平台进行审核，使所述检测平台符合相关的基本标准和技术规范。

本发明还提供一种检测平台，用于对上述的人脐带间充质干细胞种子库的构建方法进行检测，包括：脐带供者个人信息单元、采集接收记录单元、标本送检记录单元、检测结果报告单元、分离记录单元、试剂批号单元、分离交接确认单元、培养记录单元、冻存入库信息单元以及各流程操作人员记录单元；其中，上述各单元之间一一对应。

相较于现有技术，本发明具有以下优点：

(1)本发明的人脐带间充质干细胞种子库及检测平台的构建方法，通过快速碎化组织、离心后加液培养这种方法制备间充质干细胞，与以往常用的酶消化法和植块贴壁法相比，省去了繁琐耗时的操作步骤，降低了耗材和能耗成本，缩短了组织曝露时长，降低了污染的风险，更充分激活间充质干细胞自我修复能力，提高了制备效率和细胞纯度；

(2)本发明的人脐带间充质干细胞种子库及检测平台的构建方法，在细胞培养和冻存时均使用无胎牛血清的培养基和/或非动物来源胰酶，避免间充质干细胞因含动物源性蛋白而在临床试验和临床注射时引起免疫反应，提高了细胞的安全性；

(3)本发明的人脐带间充质干细胞种子库及检测平台的构建方法，细胞培养中使用d-hank′s平衡盐溶液，以往细胞培养中所用的缓冲溶液主要是磷酸缓冲液(pbs)，而d-hank′s平衡盐溶液中盐成分较pbs复杂,无机盐浓度接近大部分动植物细胞的水平，可在分离、培养过程中减少对细胞的损伤；

(4)本发明的人脐带间充质干细胞种子库及检测平台的构建方法，检测平台以安全为重心专门设置了过程检和终产品检，在以往对细胞进行的一些基本病原微生物免疫检测的基础上，对每一批种子细胞进行三系分化培养、tp53抑癌基因检测和内毒素检测，并在间充质干细胞种子库冻存前、临床试验前进行支原体、细菌(如：需氧菌、厌氧菌)的快速检测，确保所存细胞的健康性和安全性；

(5)本发明的人脐带间充质干细胞种子库及检测平台的构建方法，加入了与之相匹配的信息化建设和管理方法，建立了网络数据库和信息管理系统的工作平台，实现信息和资源的有效流通，降低了成本，减少了差错率，提高了平台工作效率；

(6)本发明的人脐带间充质干细胞种子库及检测平台的构建方法，包含监控平台的构建方法，建立平台环境和设备的数据监控系统，可及时发现并排除故障和隐患，提高平台应急处理能力，确保平台在安全稳定的环境下运行，进而确保细胞和试剂不受影响。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

下面结合附图对本发明的实施方式作进一步说明：

图1为本发明的一实施例的人脐带间充质干细胞种子库的构建方法的流程图；

图2为本发明的一实施例的人脐带间充质干细胞种子库的构建方法的原代培养第7天的细胞形态观察图；

图3为本发明的一实施例的人脐带间充质干细胞种子库的构建方法的原代培养第10天的细胞形态观察图；

图4为本发明的一实施例的人脐带间充质干细胞种子库的构建方法的传代培养前的细胞形态观察图；

图5为本发明的一实施例的人脐带间充质干细胞种子库的构建方法的冻存前的细胞形态观察图；

图6为本发明的一实施例的人脐带间充质干细胞种子库的构建方法的冻存前对人脐带间充质干细胞进行cd45检测；

图7为本发明的一实施例的人脐带间充质干细胞种子库的构建方法的冻存前对人脐带间充质干细胞进行cd73检测；

图8为本发明的一实施例的人脐带间充质干细胞种子库的构建方法的冻存前对人脐带间充质干细胞进行cd90检测；

图9为本发明的一实施例的人脐带间充质干细胞种子库的构建方法的冻存前对人脐带间充质干细胞进行cd105检测；

图10为本发明的一实施例的人脐带间充质干细胞种子库的构建方法的冻存前对人脐带间充质干细胞进行hla-dr检测；

图11为本发明的一实施例的人脐带间充质干细胞种子库的构建方法的传代后的细胞生长曲线图；

图12为本发明的一实施例的人脐带间充质干细胞种子库的构建方法的人脐带间充质干细胞分化为成骨细胞后的染色细胞图；

图13为本发明的一实施例的人脐带间充质干细胞种子库的构建方法的人脐带间充质干细胞分化为肝样细胞后的染色细胞图；

图14为本发明的一实施例的人脐带间充质干细胞种子库的构建方法的人脐带间充质干细胞分化为脂肪细胞后的染色细胞图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：

结合图1，本实施例对本发明的人脐带间充质干细胞种子库的构建方法进行详细描述，如图1所示，其包括以下步骤：

s11：取人脐带进行安全性检测；

一实施例中，步骤s11具体包括：

(1)采集：无菌采集人脐带，消毒，抽取少量脐带静脉血用作病原学检测，将脐带放入无菌一次性脐带采集瓶；

(2)运输：将人脐带瓶放入专门的冷链储存箱，在不经过x线照射、远离辐射源的情况下，通过具备实时温度监控设备(使储存箱温度始终保持在2～8℃)、位置定位系统的运输冷链，并选择最佳运输路径在24小时内及时安全地送达干细胞库；

(3)检测：将脐带母血样本进行全面严格的检测，包括hla分型检测、abo/rh血型检测、hiv免疫检测、乙肝表面抗原(hbsag)检测、丙肝表面抗原检测、梅毒抗体检测、巨细胞病毒(cmv)抗体检测等，确定其安全性。

s12：对人脐带进行分离纯化，得到人脐带间充质干细胞；

步骤s12具体包括：

s121：对人脐带进行消毒后，用冲洗液进行冲洗；

一实施例中，用冲洗液进行冲洗具体为：用d-hank′s平衡盐溶液冲洗2次。

s122：剪取冲洗后的人脐带的根部预设长度，去除血管和淤血后，用冲洗液进行冲洗；

一实施例中，步骤s122具体为：在肾形盘中用无菌手术剪剪取脐带根部2-3cm，用止血钳去除血管和淤血后，用d-hank′s液漂洗。

s123：将步骤s122得到的人脐带标本放置于培养瓶中，剪成预设大小的小块，加入培养基，混匀后进行离心，弃去上清，然后再进行离心，去除冲洗液残留；

一实施例中，步骤s123具体为：将步骤s122得到的人脐带标本放置于nunct75细胞培养瓶中，用刀片网筛剪迅速冲压碎化成大小约2mm³的小块，加入d-mem/f12培养基，混匀后离心5～10min，离心机转速1000rpm，弃去上清，再重复上述步骤1次，去除洗涤液残留。

s124：将步骤s123中离心沉淀的组织块与培养基混匀后移入培养箱中进行培养；

一实施例中，将步骤s123中离心沉淀的组织块与间充质干细胞无血清培养基在培养瓶中充分混匀后置于37.5℃、4％co2孵箱中培养。

较佳实施例中，步骤s124中在培养过程中对培养基进行一次或多次更换。一实施例中，进行两次更换，具体为：培养到第7天时，去除原有培养液，补加培养液，显微镜下观察细胞生长状态，如图2所示，放入孵箱继续培养；培养到第10天时，再次更换培养基，显微镜下观察细胞生长状态，如图3所示，转移至37℃、4％co2孵箱继续培养。

s13：对人脐带间充质干细胞进行扩增；

一实施例中，步骤s13具体为：培养到第11～13天时，显微镜下观察到培养瓶中间充质干细胞形成密集集落，如图4所示，集落数量达到10个左右时，按每个t75培养瓶中3.0×10⁶细胞数进行传代，弃去原有培养基和组织块，使用d-hank′s液洗涤培养面2次，弃去洗涤液，用accutase^tm细胞消化液使贴壁细胞脱落，收集细胞悬液进行离心(1000rpm，5min)，弃上清液，将细胞接种至新的培养瓶内，置于孵箱继续培养。

s14：对人脐带间充质干细胞进行冻存；

一实施例中，步骤s14具体为：细胞传代后3天左右，显微镜下观察细胞融合率达到75％以上时，如图5所示，吸取预设容量(如：5ml)的原培养液加入离心管留样，送至微生物免疫进行支原体检测，再吸取预设容量(如：14ml)的原培养液分别注入bpa(需氧菌)和bpn(厌氧菌)瓶内(每瓶7ml)，送至微生物免疫进行细菌检测，弃其余培养液，重复传代步骤，离心前吸取2ml×2细胞悬液样本，一份使用流式细胞仪检测特征表面标记鉴定所得细胞为间充质干细胞(如图6-图10所示，分别为cd45、cd73、cd90、cd105以及hla-dr检测，图中可看出细胞标志物阳性率符合正常间充质干细胞表达水平)，另一份送至微生物免疫进行tp53抑癌基因检测和内毒素检测。离心后将沉淀细胞与细胞无血清冻存液轻柔混匀后移入冻存管，置于-80℃冰箱内暂存，编录冻存位置后移入液氮中长期保存。

较佳实施例中，步骤s14中的离心后将沉淀细胞与细胞无血清冻存液轻柔混匀后移入冻存管之前还包括：离心后收集小部分沉淀细胞按2×104细胞/孔接种于24孔细胞培养板内，用于绘制生长曲线，判定细胞活力。如图11所示，每隔24h收集24孔板内3个孔的细胞，用0.4％台盼蓝染色后计数活细胞，绘制生长曲线，斜率较大部分为细胞指数生长期，当细胞到达饱和密度后停止生长，然后进入衰亡期。

较佳实施例中，步骤s14之后还包括：

s15：对人脐带间充质干细胞进行分化；

一实施例中，步骤s15具体为：培养获得的脐带来源间充质干细胞可向成骨细胞、肝样细胞与脂肪细胞分化，成骨诱导后细胞中有不透光钙结节形成且钙结节茜素红染色阳性，如图12所示；成肝诱导后细胞胞质内糖元pas染色阳性，如图13所示；成脂诱导后细胞中可见大的脂肪滴，用0.3％油红(oilred-o)染色，显微镜下可见阳性细胞，如图14所示。

较佳实施例中，步骤s14或步骤s15之后还包括：

s16：建立检测平台，对人脐带间充质干细胞种子库的构建进行信息化建设与管理。

一实施例中，步骤s16具体包括：

(1)建立系统电子数据库，通过专用的围产期干细胞业务管理系统，将脐带供者个人信息、采集接收记录、标本送检记录、检测结果报告、分离记录、试剂批号、分离交接确认、培养记录、冻存入库信息、各流程操作人员记录等及时录入其中，将各环节有机串联，建立可供快速检索操作记录和细胞信息档案的大数据库；

(2)平台环境和设备的数据监测，包括实验室温湿度、冰箱和液氮罐温度的实时监控，均配有远程报警系统和现场声光报警系统；

(3)定期对平台进行内部审核，建立年审机制，使本平台符合各级卫生健康委员会制定的相关基本标准和技术规范，确保平台持续地保持安全性、有效性和专业性。

下面对上述实施例中溶液及培养基进行介绍：

(1)d-hank′s平衡盐溶液：每升含有nacl8.000g，kcl0.400g，na2po4·12h2o0.150g，kh2po40.060g，nahco30.350g。以往细胞培养中所用的缓冲溶液主要是磷酸缓冲液(pbs)，而d-hank′s平衡盐溶液中盐成分较pbs复杂,无机盐浓度接近大部分动植物细胞的水平，可在分离、培养过程中减少对细胞的损伤。

(2)d-mem/f12动物细胞培养基：粉剂规格15.6g/包，每包可配制1升溶液，每升含有hepes3.58g，nahco32.438g。

(3)间充质干细胞无血清培养基：培养基包含必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质、血清替代物以及其他补给成分。

(4)accutase^tm细胞消化液：accutasetm是包含有蛋白水解酶和胶原酶活性的一种细胞消化液，是胰酶/edta消化液的完美替换产品，不含任何动物或者细菌来源组分，实现粘附细胞的分离后不需清洗或中和反应；

(5)细胞无血清冻存液：主要成分为dmso和甲基纤维素，无动物血清无蛋白配方，消除污染隐患，且不影响细胞的生长和分化潜能及其它高级应用。

实施例2：

本实施例对本发明的检测平台进行详细描述，其包括：脐带供者个人信息单元、采集接收记录单元、标本送检记录单元、检测结果报告单元、分离记录单元、试剂批号单元、分离交接确认单元、培养记录单元、冻存入库信息单元以及各流程操作人员记录单元；其中，上述各单元之间一一对应。将上述实施例中的人脐带间充质干细胞种子库构建过程中的信息及时录入检测平台，将各环节有机串联，建立可供快速检索操作记录和细胞信息档案的大数据库。

本实施例的检测平台加入了与人脐带间充质干细胞种子库的构建过程相匹配的信息化建设和管理方法，建立了网络数据库和信息管理系统的工作平台，实现信息和资源的有效流通，降低了成本，减少了差错率，提高了平台工作效率。

此处公开的仅为本发明的优选实施例，本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，并不是对本发明的限定。任何本领域技术人员在说明书范围内所做的修改和变化，均应落在本发明所保护的范围内。