表达CXCL10和CCL21趋化因子靶向嵌合抗原受体T淋巴细胞的构建方法及应用与流程

本发明涉及肿瘤免疫治疗技术与基因工程改造技术领域，尤其涉及一种表达cxcl10和ccl21趋化因子靶向嵌合抗原受体t淋巴细胞的构建方法及应用。

背景技术

2017年初，国家癌症中心发布了中国最新癌症数据，每一项数据都用客观的事实告诉我们：中国正在面临着一场抗癌战争。每天约1万人诊断癌症，每分钟约7人确诊患癌。目前，最常见的癌症治疗方法是化疗、放疗、肿瘤手术，以及前列腺癌和乳腺癌的激素治疗。然而，其他类型的治疗方法也开始起作用了：这些疗法本身或与其他疗法结合在一起，有助于更有效地战胜癌症，理想情况下，这些疗法的副作用也更少。癌症治疗的创新旨在解决一系列的问题，这些问题通常会面临医疗服务提供者和患者的问题，包括积极的治疗，伴随不良的副作用，治疗后的肿瘤复发，手术，或两者兼而有之，以及对广泛使用的治疗有弹性的侵袭性癌症。car-t，嵌合抗原受体t细胞，是目前较为有效的恶性肿瘤的治疗方式之一，和其它免疫疗法类似，它的基本原理就是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞，但是不同的是，这是一种细胞疗法，而不是一种药。

嵌合抗原受体(car)是car-t的核心部件，赋予t细胞hla非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过car改造的t细胞相较于天然t细胞表面受体tcr能够识别更广泛的目标。car的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，taa)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scfv段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。car-t细胞在治疗血液癌症方面表现出非凡的功效，在实体肿瘤的治疗中，car-t细胞的浸润、积累和存活是清除肿瘤的关键，在这方面，car-t细胞免疫疗法可发展的空间还很大。

epcam属于单次跨膜i型糖蛋白，epcam基因位于人染色体2p21，基因长度14kbp，相对分子量40kda，其分子结构由胞外结构域、单次跨膜结构域和胞内结构3部分构成，其主要编码一种肿瘤相关抗原，多数表达与正常上皮细胞和上皮源性恶性肿瘤细胞。epcam参与调节细胞间粘附、迁移、增殖及信号传导。epcam的过表达导致wnt-β-连环蛋白信号通路这一经典的肿瘤信号通路的激活，通过wnt级联反应激活原癌基因e-myc和cyclina/e的表达，诱导细胞的增殖。多项研究证据表明，epcam在多种肿瘤组织中呈高水平表达，在肿瘤细胞的增殖中扮演着重要角色，因此epcam成为前列腺癌免疫靶向治疗的重要靶点。

人表皮生长因子受体2(her2)是具有酪氨酸激酶活性的表皮生长因子受体家族的一个成员。受体的聚合作用会导致受体酪氨酸残基的磷酸化，并启动多种信号通路导致细胞增殖和肿瘤发生。作为预后和预测生物标志物，大约15–30％的乳腺癌和10–30％的胃/食管癌会发生her2基因扩增或过表达。her2的过度表达也可见于其他肿瘤如卵巢、子宫内膜、膀胱、肺、结肠和头颈部。her2靶向治疗极大的改善了her2阳性乳腺癌、胃/食管癌患者的预后。

glypican-3(gpc3)蛋白为硫酸肝素糖蛋白家族成员之一，cpc3相对分子质量约为66×103，它富含一段包括14个半胱氨酸残疾的独特序列，在n末端有一种分泌型信号蛋白，c端通过与糖基磷脂酰肌醇共价结合而锚定于细胞膜上，且硫酸乙酰肝素链插入点的位置均由c端最末50个氨基酸决定，是该链靠近细胞膜。cpc3在在调控细胞生长和分化方面起重要作用，与肝癌的发生、发展密切相关，有报道称，肝癌组织中gpc3阳性率达到74.5％。所以gpc3在肝癌组织中特异性高表达的特性，可作为肝癌治疗的新靶点。

cxcl10属于cxc趋化因子超家族的非elr类,此类细胞因子能够趋化淋巴细胞或造血干细胞，抑制血管的生成。cxcl10又称干扰素诱导蛋白(ip10)，是在外源性和内源性炎性因子等刺激下，由成纤维细胞、内皮细胞、树突状细胞、脂肪细胞等多种细胞分泌、表达的细胞因子。目前，越来越多的研究证明，cxcl10能够发挥抗肿瘤作用，其机制主要通过三种途径实现：cxcl10能够直接抑制肿瘤细胞的增殖，能趋化免疫效应细胞至肿瘤发生部位，能抑制肿瘤血管生成。

ccl21是cc类趋化因子，又称为6ckine或刺激淋巴组织趋化因子，是ccr7的配体之一，ccl21对某些人t细胞株和外周血淋巴细胞具有高效的化学驱动作用，但对单核细胞和中性粒细胞没有趋化作用，提示它对淋巴细胞具有特异性。ccl21主要通过诱导淋巴细胞和dc细胞增殖以及抑制肿瘤血管生成来发挥抗肿瘤作用。

目前，car-t免疫治疗已在血液肿瘤中取得了卓著的成效，但在实体瘤的治疗中面临着肿瘤异质性与免疫抑制微环境的瓶颈，car-t细胞在实体瘤内浸润情况决定着car-t细胞的功效。

因此，为了改变免疫抑制微环境，招募其他免疫效应细胞到达肿瘤位置，发挥联合抗肿瘤细胞，急需一种表达cxcl10和ccl21趋化因子靶向嵌合抗原受体t淋巴细胞，来实现分泌cxcl10和ccl21，从而使机体免疫细胞被招募至肿瘤部位进行杀伤肿瘤。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种能表达cxcl10和ccl21趋化因子靶向嵌合抗原受体t淋巴细胞的构建方法及应用。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

一种表达cxcl10和ccl21趋化因子靶向嵌合抗原受体t淋巴细胞的构建方法，包括如下步骤：

(1)序列选取：

选取cxcl10和ccl21作为目标序列；其中，cxcl10的dna序列如seqidno:1所示，cxcl10的dna序列如seqidno:2所示；

(2)构建含嵌合抗原受体的pcdh载体：

构建以实体瘤特异性抗原为靶点的嵌合抗原受体结构，整个嵌合抗原受体结构由识别上述实体瘤特异性抗原分子的scfv片段、cd8跨膜区、4-1bb/cd137片段、cd3ζ片段依次顺序连接组成；

在上述嵌合抗原受体结构序列的两端加入酶切位点粘性末端，克隆进入pcdh载体中，得含嵌合抗原受体的pcdh载体；

(3)将cxcl10及ccl21的dna表达序列克隆进含嵌合抗原受体的pcdh载体中：

直接将cxcl10及ccl21表达序列进行合成后，克隆进入含嵌合抗原受体的pcdh载体，接着对其进行酶切，随后转染dh5α大肠杆菌，进行载体扩增并通过酶切与pcr测序鉴定，最终获得含cxcl10、ccl21dna表达序列及嵌合抗原受体的pcdh载体；

(4)慢病毒的包装：

先培养293t细胞，再使用opti-mem作为转染试剂，通过慢病毒包装体系中的质粒与步骤(3)得到的含cxcl10、ccl21dna表达序列及嵌合抗原受体的pcdh载体来共转染293t细胞；培养一段时间后，进行病毒的收集，并通过超速离心进行浓缩与纯化；

(5)表达cxcl10和ccl21趋化因子靶向嵌合抗原受体t淋巴细胞的制备：

在获取供者的抗凝外周血后，离心去除血浆，获取血细胞，再通过ficoll试剂进行单个核细胞pbmc的分离后，再转移至cd3/cd28anti-body负载预处理的培养瓶使用含有il2的kbm581培养基进行培养；其中，在培养的第2-4天，加入步骤(4)制得的慢病毒进行感染，即可获得目标所需的表达cxcl10和ccl21趋化因子靶向嵌合抗原受体t淋巴细胞。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中通过ncbi官方网站上获取cxcl10和ccl21的dna序列作为目标序列。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中实体瘤特异性抗原具体为：表皮生长因子受体3型突变体egfrvⅲ、人表皮生长因子受体2her2、epcam上皮细胞粘附分子、白介素13受体α2il13ra、癌胚抗原cea、间皮素msln、成纤维细胞激活蛋白fap、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3gpc3、卵泡刺激素受体fshr、人前列腺特异性膜抗原psma、神经节苷脂gd2。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中在嵌合抗原受体结构序列的两端加入酶切位点粘性末端，其中，前段粘性末端为xbai酶的酶切位点，末端粘性末端为noti酶的酶切位点。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中通过noti与bamh1-f两种限制性内切酶进行酶切。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中慢病毒包装体系具体为商业化的pcdh的慢病毒载体系统，包含1个表达质粒与3个辅助质粒，其中的表达质粒即为步骤(2)中使用的原始pcdh载体；于步骤(4)中使用时，四个质粒的比例为gag：rev：vsv：含cxcl10、ccl21dna表达序列及嵌合抗原受体的pcdh载体＝10:5:2:5:4。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中培养一段时间指培养7天。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中使用含有il2的kbm581培养基进行培养的整个培养流程为14天，在培养的第4天，加入步骤(4)制得的慢病毒进行感染，病毒感染复数moi值为10。

作为本发明的优选方式之一，所述病毒感染复数moi值为10指：慢病毒：t细胞＝10:1。

一种使用上述方法得到的表达cxcl10和ccl21趋化因子靶向嵌合抗原受体t淋巴细胞在实体瘤免疫治疗方向上的应用。

本发明相比现有技术的优点在于：为了改变免疫抑制微环境，招募其他免疫效应细胞到达肿瘤位置，发挥联合抗肿瘤细胞，本发明以肿瘤特异性抗原为靶点，并辅助表达cxcl10和ccl21分子，既可以实现对肿瘤细胞的靶向作用，又可以抑制肿瘤血管生成，减少肿瘤组织的血液供应，最大程度杀伤实体瘤，实现了对实体瘤的免疫治疗新突破。

附图说明

图1是实施例1中pcdh-anti-her2scfv-cd8αhinge/tm-cd137-cd3ζ-t2a-cxcl10-ccl21质粒载体的载体图谱；

图2是实施例1中car-t细胞扩增增殖曲线图；

图3是实施例1中cclx10-ccl21-her2.car-t细胞分泌的cclx10及ccl21含量表示图；

图4是实施例1中单个核细胞pbmc、her2.car-t细胞以及cclx10-ccl21-her2.car-t细胞对靶细胞的杀伤效率比较图；

图5是实施例2中表pcdh-anti-epcamscfv-cd8αhinge/tm-cd137-cd3ζ-cclx10-ccl21质粒载体的载体图谱；

图6是实施例2中epcam-car病毒与cclx10-ccl21-epcam.car慢病毒制备的car-t细胞扩增增殖曲线图；

图7是实施例2中cclx10-ccl21-epcam.car-t细胞分泌的cclx10及ccl21含量表示图；

图8是实施例2中单个核细胞pbmc、epcam.car-t细胞以及cclx10-ccl21-epcam.car-t细胞对靶细胞的杀伤效率比较图；

图9是实施例3中pcdh-anti-gpc3scfv-cd8αhinge/tm-cd137-cd3ζ-cclx10-ccl21质粒载体的载体图谱；

图10是实施例3中gpc3-car病毒与cclx10-ccl21-gpc3.car慢病毒制备的car-t细胞扩增增殖曲线图；

图11是实施例3中cclx10-ccl21-gpc3.car-t细胞分泌的cclx10及ccl21含量表示图；

图12是实施例3中单个核细胞(pbmc)为对照组，gpc3.car-t细胞与cclx10-ccl21-gpc3.car-t细胞对靶细胞的杀伤效率比较图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例的一种表达cxcl10和ccl21的her2靶点的car-t细胞的构建方法，包括如下步骤：

1、序列选取：

cxcl10和ccl21的核酸序列来自于genebank数据库(nm_001565.3和nm_002989.3)；其中，cxcl10的dna序列具体如seqidno:1所示，cxcl10的dna序列具体如seqidno:2所示。

2、pcdh-anti-her2scfv-cd8αhinge/tm-cd137-cd3ζ与pcdh-anti-her2scfv-cd8αhinge/tm-cd137-cd3ζ-t2a-cxcl10-ccl21载体的构建：

(1)her2.car基因(序列如seqidno:3所示)是采用二代car的组成方式，整个her2.car由识别her2分子的scfv片段、cd8跨膜区、4-1bb/cd137片段、cd3ζ片段依次顺序连接组成。

识别her2分子的scfv片段是anti-her2的抗体分子轻链与重链组成单链分子。

cd8αhingeregion/transmembrane(cd8αhinge/tm)，cd8α铰链区和跨膜区；其中，cd8α铰链区是一段柔性区域，含有大量脯氨酸；cd8α跨膜区主要将胞外区和胞内区锚定在细胞膜上。genebank数据库中查得cd8α铰链区和跨膜区序列nm_001768(1301..1507)。

cd137属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，表达于活化的t细胞上，是t细胞协同刺激因子，配体为4-1bbl，两者结合后可刺激t细胞的活化和增殖。

cd3ζ胞内区是将胞外接收的信号传递至胞内，并将活化信号传递到核内，激活t细胞的增殖。cd3ζ含有3个免疫受体酪氨酸激活基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif，itam)。

anti-her2scfv的具体序列基于山东兴瑞生物科技有限公司的专利(专利号：cn107488636a)，cd8αhinge/tm-cd137-cd3ζ具体序列来源于诺华制药有限公司的专利(专利号：wo2012079000)。

(2)在上述anti-her2scfv-cd8αhinge/tm-cd137-cd3ζ基因序列的两端加入酶切位点粘性末端(前段粘性末端为xbai酶的酶切位点，末端粘性末端为noti酶的酶切位)，整个序列由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成；接着，用xbaⅰ限制性内切酶和notⅰ限制性内切酶分别酶切合成的anti-her2scfv-cd8αhinge/tm-cd137-cd3ζ基因片段以及pcdh-ef1α-mcs空载体(sbicat#cd502a-1)，37℃酶切30min后，1％琼脂糖(上海生工cat#a600434)凝胶电泳鉴定酶切结果。

接着，使用t4连接酶(nebcat#n0202)连接酶切后的pcdh-cmv-mcs空载体与anti-her2scfv-cd8αhinge/tm-cd137-cd3ζ，16℃过夜连接，得pcdh-anti-her2scfv-cd8αhinge/tm-cd137-cd3ζ载体。

(3)直接将t2a-cxcl10-ccl21表达序列合成(由南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成)后，克隆进入pcdh-anti-her2scfv-cd8αhinge/tm-cd137-cd3ζ载体，接着通过noti与bamh1-f两种限制性内切酶酶切，随后转染dh5α大肠杆菌，进行载体扩增并通过酶切与pcr测序鉴定，最终获得pcdh-anti-her2scfv-cd8αhinge/tm-cd137-cd3ζ-t2a-cxcl10-ccl21质粒载体，载体图谱见图1；

t2apeptide间隔区，是一类编码约20个氨基酸左右的核酸序列，它能够阻止翻译过程中氨基酸形成共价键结构，但不影响翻译的持续进行；翻译结束后进行“顺式水解反应”；2apeptide的共有元件为d(v/i)exnpgp，x为任意氨基酸，水解的部位位于：gp之间，本发明中所用的t2apeptide间隔区氨基酸序列为：5’-gsgegrgslltcgdveenpgpr，核酸序列如seqidno:4所示。

3、慢病毒包装及滴度检测

(1)慢病毒包装

将慢病毒包装细胞系293t(美国模式菌种收集中心atcc：crl-11268)接种于含有dmem(takara公司)+10％fbs(excellbio公司)培养皿中，37℃，5％c02条件下过夜培养，贴壁率为70％-80％后进行转染。将pcdh-anti-her2scfv-cd8αhinge/tm-cd137-cd3ζ-t2a-cxcl10-ccl21质粒载体和pcdh-anti-her2scfv-cd8αhinge/tm-cd137-cd3ζ质粒载体(约10ug)分别与慢病毒包装质粒采用磷酸钙转染法共转染293t细胞，轻轻混匀，置37℃，5％c02培养箱中培养12h，加入7ml含10％fbs的dmem液体于细胞培养瓶，继续培养，72h后，收集上清。采用超速离心机12000g，4℃离心30min，去除细胞碎片，收获病毒后使0.45μm滤器(miiiipore公司)过滤，再进行浓缩，即获得浓缩过的重组cxcl10-ccl21-her2.car病毒液以及her2.car病毒液，-70℃低温箱中保存备用。

(2)荧光定量pcr检测病毒滴度

第一天，以1x10⁵/ml接种293t细胞于96孔培养板,100μl/孔，培养液含10％胎牛血清的dmem，37℃，5％co2培养。第二天，弃50μl/孔培养上清，补加40μl/孔新鲜上述培养液，加10μl/孔的病毒原液，5倍稀释，4个梯度，两个复孔，37℃,5％c02培养。感染48h后，荧光定量pcr仪检测拷贝数，计算滴度(u/ml)＝拷贝数x稀释倍数，控制病毒使用时的滴度为5x10⁷u/ml。

4、t细胞的培养和cxcl10-ccl21-her2.car病毒液以及her2.car慢病毒转染t细胞

(1)t细胞的复苏：液氮中取出pbmc细胞一支，迅速放入37℃水浴锅中迅速溶解，待细胞冰块只有黄豆大小时，将pbmc细胞转入已预热的rpmi1640培养基中，300g离心5min，去除上清液，kbm581无血清培养基将pbmc细胞重悬，加入至1ug/mlanti-cd3、2ug/mlanti-cd28预包被的培养瓶中，37℃5％co2培养。

(2)第4天，将t细胞转入retronectin预包被的慢病毒中，moi值为10(慢病毒：t细胞＝10:1)，37℃5％co2培养，即可获得cxcl10-ccl21-her2.cart细胞和her2.cart细胞。

5、car-t细胞体外增殖及维持能力：

在使用cclx10-ccl21-her2.car慢病毒感染t细胞后，分别在第2、4、6、8、10、12天的时间点进行car-t细胞数目分析，分析采用流式细胞术，以cd3分子作为门控，使用特异性识别anti-her2.scfv的抗体耦联荧光分子进行流式标记来计算car-t细胞数目。her2.car病毒与cclx10-ccl21-her2.car慢病毒制备的car-t细胞扩增增殖曲线如图2所示。

图2中her2.car-t细胞为her2.car慢病毒制备的car-t细胞，cclx10-ccl21-her2.car-t细胞为cclx10-ccl21-her2.car慢病毒制备的car-t细胞；由图2可知，cclx10及ccl21的表达序列对her2.car分子的表达以及car-t细胞的扩增无显著影响。

6、表达cclx10及ccl21效果评估：

先单独培养her2+mda-mb-231细胞(购自中国科学院上海生科院细胞资源中心)、her2car-t细胞、cclx10-ccl21-her2.car-t细胞，再分别收集各种细胞进行共培养，具体方法同上述杀伤功能检测。设置效靶比为10:1的实验孔，并设置对照组，在37℃5％co2培养箱中共培养10小时，收集200μl共培养上清液，进行elisa检测，检测项目包括cclx10及ccl21，检测结果见图3。由图3可知，cclx10及ccl21只在cclx10-ccl21-her2.car-t效应细胞中有大量分泌，而在其他三组实验中未表达。

7、细胞杀伤实验效果评估：

(1)别培养her2+mda-mb-231细胞及pbmc细胞；

(2)实验开始前4天，moi＝10的her2.car和cclx10-ccl21-her2.car的病毒感染pbmc细胞，培养72-96h后可安排开始实验；

(3)收集靶细胞(her2+mda-mb-231)5x105cells和效应细胞(cart细胞)3x106cells，800g，6min离心，弃上清；

(4)用1ml1xpbs溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，800g，6min离心，弃上清；

(5)重复步骤(3)一次；

(6)用700ul培养基(1640培养基+10％fbs)重悬效应细胞，用2ml培养基(1640培养基+10％fbs)重悬靶细胞；

(7)设置效靶比为10:1的实验孔，并设置对照组，每组3个复孔；

(8)250xg，5min平板离心；

(9)37℃5％co2培养箱中培养4小时；

(10)250xg，5min平板离心；

(11)取每个孔的50ul上清到新96孔板中，并且每孔加入50ul底物溶液(避光操作)；

(12)避光孵育25分钟；

(13)每孔加入50ul终止液；

(14)酶标仪检测490nm吸光度；

(15)将3个复孔取平均值；将所有实验孔、靶细胞孔和效应细胞孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值；将靶细胞最大值的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值；

(16)将步骤15中获得的经过校正的值带入下面公式，计算每个效靶比所产生的细胞毒性百分比。杀伤效率＝(实验孔-效应细胞孔-靶细胞孔)/(靶细胞最大孔-靶细胞孔)x100％。结果如图4所示，单个核细胞(pbmc)为对照组，her2.car-t细胞与cclx10-ccl21-her2.car-t细胞对靶细胞的杀伤效果相似，说明表达cclx10及ccl21并没有显著影响效应细胞的杀伤能力。

实施例2

本实施例的一种表达cxcl10和ccl21的cclx10-ccl21-epcam.car-t细胞的构建方法：

cclx10-ccl21-epcam.car-t细胞的构建方法和流程与实施例1中cclx10-ccl21-her2.car-t细胞基本相同，主要不同之处在于：以实体瘤特异性抗原为靶点的嵌合抗原受体结构中的“实体瘤特异性抗原靶点”由实施例1中的“her2靶点”替换为“epcam靶点”。本实施例中epcam靶点的scfv片段序列基于四川大学的抗-epcam抗体的专利(专利号：cn107602703a)所公布的抗体序列(具体序列如seqidno:5所示)。

pcdh-anti-epcamscfv-cd8αhinge/tm-cd137-cd3ζ、pcdh-anti-epcamscfv-cd8αhinge/tm-cd137-cd3ζ-cclx10-ccl21中的cd8跨膜区、4-1bb/cd137片段、cd3ζ以及cclx10、ccl21的序列同实施例1的序列；pcdh-anti-epcamscfv-cd8αhinge/tm-cd137-cd3ζ及pcdh-anti-epcamscfv-cd8αhinge/tm-cd137-cd3ζ-cclx10-ccl21质粒载体的合成、构建(载体图谱见图5)、验证方法和流程、epcam.car与cclx10-ccl21-epcam.car的慢病毒包装、纯化与滴度测定方法、epcam.car-t与cclx10-ccl21-epcam.car-t细胞的制备方法与实施例1相同。

cclx10-ccl21-epcam.car-t细胞的相关性能实验如下：

1、car-t细胞体外增殖及维持能力：

在使用cclx10-ccl21-epcam.car慢病毒感染t细胞后，分别在第2、4、6、8、10、12天的时间点进行car-t细胞数目分析，分析采用流式细胞术，以cd3分子作为门控，使用特异性识别anti-epcam.scfv的抗体耦联荧光分子进行流式标记来计算car-t细胞数目。epcam-car病毒与cclx10-ccl21-epcam.car慢病毒制备的car-t细胞扩增增殖曲线如图6所示，图6中epcam.car-t细胞为epcam-car慢病毒制备的car-t细胞，cclx10-ccl21-epcam.car-t细胞为cclx10-ccl21-epcam.car慢病毒制备的car-t细胞，从图6可以看出，cclx10及ccl21的表达序列对cd19-car分子的表达以及car-t细胞的扩增无显著影响。

2、表达cclx10及ccl21效果评估：

ls174-t结肠腺癌细胞(购自中国科学院上海生科院细胞资源中心)作为靶细胞，先单独培养ls174-t细胞、epcamcar-t细胞、cclx10-ccl21-epcam.car-t细胞，再分别收集各种细胞进行共培养，具体方法同上述杀伤功能检测。设置效靶比为10:1的实验孔，并设置对照组，在37℃5％co2培养箱中共培养10小时，收集200μl共培养上清液，进行elisa检测，检测项目包括cclx10及ccl21。从图7中可以看出，cclx10及ccl21只在cclx10-ccl21-epcam.car-t效应细胞中有大量分泌，而在其他三组实验中未表达。

4、细胞杀伤实验效果评估：

(1)分别培养ls174-t细胞及pbmc细胞；

(2)实验开始前4天，moi＝10的epcam.car和cclx10-ccl21-epcam.car的病毒感染pbmc细胞，培养72-96h后可安排开始实验；

(3)收集靶细胞(ls174-t)5x10⁵cells和效应细胞(cart细胞)3x10⁶cells，800g，6min离心，弃上清；

(4)用1ml1xpbs溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，800g，6min离心，弃上清；

(5)重复步骤3一次；

(6)用700ul培养基(1640培养基+10％fbs)重悬效应细胞，用2ml培养基(1640培养基+10％fbs)重悬靶细胞；

(7)设置效靶比为10:1的实验孔，并设置对照组，每组3个复孔；

(8)250xg，5min平板离心；

(9)37℃5％co2培养箱中培养4小时；

(10)250xg，5min平板离心；

(11)取每个孔的50ul上清到新96孔板中，并且每孔加入50ul底物溶液(避光操作)；

(12)避光孵育25分钟；

(13)每孔加入50ul终止液；

(14)酶标仪检测490nm吸光度；

(15)将3个复孔取平均值；将所有实验孔、靶细胞孔和效应细胞孔的吸

光值减去培养基背景吸光值的均值；将靶细胞最大值的吸光值减去体积校

正对照吸光值的均值。

(16)将步骤(15)中获得的经过校正的值带入下面公式，计算每个效靶比所产生的细胞毒性百分比。杀伤效率＝(实验孔-效应细胞孔-靶细胞孔)/(靶细胞最大孔-靶细胞孔)x100％。结果如图8所示，单个核细胞(pbmc)为对照组，epcam.car-t细胞与cclx10-ccl21-epcam.car-t细胞对靶细胞的杀伤效果相似，说明表达cclx10及ccl21并没有显著影响效应细胞的杀伤能力。

实施例3

本实施例的一种表达cxcl10和ccl21的cclx10-ccl21-gpc3.car-t细胞的构建方法：

cclx10-ccl21-gpc3.car-t细胞的构建方法和流程与实施例1中cclx10-ccl21-her2.car-t细胞相同基本相同，主要不同之处在于：以实体瘤特异性抗原为靶点的嵌合抗原受体结构中的“实体瘤特异性抗原靶点”由实施例1中的“her2靶点”替换为“gpc3靶点”。本实施例gpc3靶点的scfv片段序列参照专利文献us7919086b2中对应的gpc3抗体的对应的vlfragment核酸序列(具体序列如seqidno:6所示)。

pcdh-anti-gpc3scfv-cd8αhinge/tm-cd137-cd3ζ及pcdh-anti-gpc3scfv-cd8αhinge/tm-cd137-cd3ζ-cclx10-ccl21中的cd8跨膜区、4-1bb/cd137片段、cd3ζ以及cclx10、ccl21的序列同实施例1的序列；pcdh-anti-gpc3scfv-cd8αhinge/tm-cd137-cd3ζ、pcdh-anti-gpc3scfv-cd8αhinge/tm-cd137-cd3ζ-cclx10-ccl21质粒载体的合成、构建(具体构成如下图9)、验证方法和流程、gpc3.car与cclx10-ccl21-gpc3.car的慢病毒包装、纯化与滴度测定方法、gpc3.car-t与cclx10-ccl21-gpc3.car-t细胞的制备方法与实施例1相同。

cclx10-ccl21-gpc3.car-t细胞的相关性能实验如下：

1、car-t细胞体外增殖及维持能力：

在使用cclx10-ccl21-gpc3.car慢病毒感染t细胞后，分别在第2、4、6、8、10、12天的时间点进行car-t细胞数目分析，分析采用流式细胞术，以cd3分子作为门控，使用特异性识别anti-gpc3.scfv的抗体耦联荧光分子进行流式标记来计算car-t细胞数目。gpc3-car病毒与cclx10-ccl21-gpc3.car慢病毒制备的car-t细胞扩增增殖曲线如图10所示，图10中gpc3.car-t细胞为gpc3.car慢病毒制备的car-t细胞，cclx10-ccl21-gpc3.car-t细胞为cclx10-ccl21-gpc3.car慢病毒制备的car-t细胞，从图10可以看出，cclx10及ccl21的表达序列对gpc3.car分子的表达以及car-t细胞的扩增无显著影响。

2、表达cclx10及ccl21效果评估：

先单独培养靶细胞hepg2细胞(购自中国科学院上海生科院细胞资源中心)、gpc3.car-t细胞、cclx10-ccl21-gpc3.car-t细胞，再分别收集各种细胞进行共培养，具体方法同上述杀伤功能检测。设置效靶比为10:1的实验孔，并设置对照组，在37℃5％co2培养箱中共培养10小时，收集200μl共培养上清液，进行elisa检测，检测项目包括cclx10及ccl21。从图11中可以看出，cclx10及ccl21只在cclx10-ccl21-gpc3.car-t效应细胞中有大量分泌，而在其他三组实验中未表达。

3、细胞杀伤实验效果评估：

(1)分别培养hepg2细胞及pbmc细胞；

(2)实验开始前4d，moi＝10的gpc3-car和cclx10-ccl21-gpc3.car的病毒感染pbmc细胞，培养72-96h后可安排开始实验；

(3)收集靶细胞(hepg2)5x105cells和效应细胞(car-t细胞)3x106cells，800g，6min离心，弃上清；

(4)用1ml1xpbs溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，800g，6min离心，弃上清；

(5)重复步骤3一次；

(6)用700ul培养基(1640培养基+10％fbs)重悬效应细胞，用2ml培养基(1640培养基+10％fbs)重悬靶细胞；

(7)设置效靶比为10:1的实验孔，并设置对照组，每组3个复孔；

(8)250xg，5min平板离心；

(9)37℃5％co2培养箱中培养4小时；

(10)250xg，5min平板离心；

(11)取每个孔的50ul上清到新96孔板中，并且每孔加入50ul底物溶液(避光操作)；

(12)避光孵育25分钟；

(13)每孔加入50ul终止液；

(14)酶标仪检测490nm吸光度；

(15)将3个复孔取平均值；将所有实验孔、靶细胞孔和效应细胞孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值；将靶细胞最大值的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值。

(16)将步骤(15)中获得的经过校正的值带入下面公式，计算每个效靶比所产生的细胞毒性百分比；杀伤效率＝(实验孔-效应细胞孔-靶细胞孔)/(靶细胞最大孔-靶细胞孔)x100％。结果如图12所示，单个核细胞(pbmc)为对照组，gpc3.car-t细胞与cclx10-ccl21-gpc3.car-t细胞对靶细胞的杀伤效果相似，说明表达cclx10及ccl21并没有显著影响效应细胞的杀伤能力。

使用上述实施例方法得到的表达cxcl10和ccl21趋化因子靶向嵌合抗原受体t淋巴细胞，可以辅助表达cxcl10和ccl21分子，既可以实现对肿瘤细胞的靶向作用，又可以抑制肿瘤血管生成，减少肿瘤组织的血液供应，最大程度杀伤实体瘤，实现了对实体瘤的免疫治疗新突破。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>安徽古一生物科技有限公司

<120>表达cxcl10和ccl21趋化因子靶向嵌合抗原受体t淋巴细胞的构建方法及应用

<130>2018

<160>6

<170>patentinversion3.3

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