用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的引物组、试剂、试剂盒及检测方法和应用与流程

本发明涉及基因工程
技术领域：
，尤其是涉及一种用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的引物组、试剂、试剂盒及检测方法和应用。
背景技术：
硝酸甘油(gtn,glyceryltrinitrate,nitroglycerin)用于治疗心绞痛和心力衰竭己有130年的历史，舌下含服硝酸甘油片是抗冠心病心绞痛急性发作的常规首选药方，但其临床有效性常因人而异。有的人因它而及时挽救了生命，而有的人服用之后，效果却不甚明显。以往国内外医学界一直认为硝酸甘油对部分病人疗效不佳是因其“耐药性”所致，但研究结果证实并非如此。近来的研究表明基因突变是影响硝酸甘油药物疗效的决定性因素。乙醛脱氢酶2基因(aldh2)是线粒体aldh的主要编码基因，定位于12号染色体。aldh2具有脱氢酶活性，对人体内乙醛的氧化发挥主要的作用(即与体内代谢酒精的能力直接相关)，我们饮酒后产生的乙醛主要是由aldh2参与氧化代谢的。除了上述的脱氢酶活性以外，aldh2还有醋酶活性，可以催化硝酸甘油水解产生1,2-二硝基甘油和亚硝酸盐。迄今为止，研究者在人类aldh2基因的序列上发现了84个单核普酸多态(singlenucleotidepolymorphisms,snps)位点，但研究主要集中在rs671位点上，即aldh2基因第12外显子中的一个snp，导致赖氨酸替代了原有的谷氨酸(g1u504lys)。g1u504lys是aldh2基因上最重要的一个snp位点，该位点与aldh2蛋白的空间结构有关，因此影响该酶的活性。在人群中，aldh2酶的基因以3种形式出现，具有正常催化乙醛活性的野生纯合型g/g，即aldh2*1*1；催化活性下降的突变杂合子型g/a(只有aldh2蛋白正常水平的6.25％)，即aldh2*1*2；失去催化活性的突变纯合子型a/a，即aldh2*2*2。研究成果表明，人体内线粒体乙醛脱氢酶2(aldh2)是硝酸甘油的有效代谢一氧化氮形成的关键。如果病人体内的线粒体乙醛脱氢酶2的基因lys-504发生突变，就会影响线粒体乙醛脱氢酶2的醋酶活性，使硝酸甘油在体内的生物转化过程受阻，致一氧化氮减少甚至无法产生一氧化氮，也就难以有效发挥作用。因此，对需要含服硝酸甘油药物的病人进行aldh2基因的snp检测尤为重要。目前硝酸甘油代谢敏感型基因aldh2分型检测常用方法为taqman探针-qpcr法，该方法是利用位点特异性taqman探针来完成基因分型检测。然而，taqman探针-qpcr方法具有开发成本高、周期长等缺点，使得基于该方法的临床基因检测成本较高，限制了基因检测技术的临床推广。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的引物组，以缓解现有技术中存在的taqman探针-qpcr检测乙醛脱氢酶2基因分型具有开发成本高、周期长的技术问题。本发明的第二个目的在于提供一种用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的试剂。本发明的第三个目的在于提供一种用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的试剂盒。本发明的第四个目的在于提供一种乙醛脱氢酶2基因分型的检测方法，该方法工艺简单，操作方便，检测成本低，同时能够满足临床检测所需要的准确度、精密度及检出率等要求。本发明的第五个目的在于提供上述引物组或试剂或试剂盒在检测个体对硝酸甘油药物敏感性中的应用。本发明提供了一种用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的引物组，所述引物组包括共用上游引物、等位基因特异引物和中间序列特异引物；所述共用上游引物为aldh2-f，具有如seqidno.1所示的核苷酸序列；所述等位基因特异引物包括aldh2-g-r和aldh2-a-r，所述aldh2-g-r具有如seqidno.2所示的核苷酸序列，所述aldh2-a-r具有如seqidno.3所示的核苷酸序列；所述中间序列特异引物为aldh2-mid，具有如seqidno.4所示的核苷酸序列。进一步的，所述等位基因特异引物aldh2-g-r和aldh2-a-r，分别含有通用引物序列和与通用探针反向互补的序列；优选地，所述aldh2-g-r含有与fam通用探针反向互补的序列，fam信号代表g基因型，所述aldh2-g-r含有与hex通用探针反向互补的序列，hex信号代表a基因型。本发明还提供了一种用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的试剂，所述试剂包括上述的引物组。本发明还提供了一种用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组或试剂。进一步的，所述试剂盒还包括2*pcrmix、2*up-qpcrmix、primermix、qprimermix、ddh2o和阳性标准品。进一步的，所述primermix包括浓度分别为2μm的aldh2-f、aldh2-g-r和aldh2-a-r，溶剂为灭菌双蒸水；所述qprimermix包括浓度为8μm的aldh2-mid，溶剂为灭菌双蒸水。本发明还提供了一种乙醛脱氢酶2基因分型的检测方法，应用上述的引物组或试剂或试剂盒。进一步的，以待测样本的dna为模板，利用所述引物组进行实时荧光定量pcr反应，根据检测到的荧光信号判定乙醛脱氢酶2的基因型。进一步的，还包括将所述待测样本中含有特异位点的dna进行富集的步骤；优选地，通过pcr的方法对所述待测样本中含有特异位点的dna进行富集；优选地，利用aldh2-f、aldh2-g-r和aldh2-a-r作为引物进行所述pcr反应。另外，本发明还提供了上述的引物组或试剂或试剂盒在检测个体对硝酸甘油药物敏感性中的应用。本发明提供的用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的引物组，包括共用上游引物、等位基因特异引物和中间序列特异引物。本发明利用通用探针技术开发的针对aldh2rs671位点的基因分型引物组，具有开发成本低，研发周期短，准确性高等特点，能够满足临床检测所需要的准确度、精密度及检出率等要求。并且，该引物组具有特异性强，准确度高，dna测定范围广(1ng-100ng/10μl体系)的优点有利于推动针对该位点的硝酸甘油个体化用药基因的临床检测。本发明提供的乙醛脱氢酶2基因分型的检测方法，应用了本发明提供的引物组或试剂或试剂盒。该方法工艺简单，操作方便，检测成本低，大样本检出率达到98.8％，检测周期小于3h。因此，采用本发明提供的检测方法能够经济、准确，快速地分析aldh2rs671位点的基因型，这对于硝酸甘油个体化用药基因检测的临床推广具有重要意义。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明实施例1提供的阳性参照样本基因分型散点图；图2a为本发明实施例2提供的gg型阳性参照样本基因分型曲线；图2b为本发明实施例2提供的ga型阳性参照样本基因分型曲线；图2c为本发明实施例2提供的aa型阳性参照样本基因分型曲线；图2d为本发明实施例2提供的ntc样本基因分型曲线；图3a为本发明实施例3提供的样本号为1-28的基因分型散点图；图3b为本发明实施例3提供的样本号为29-56的基因分型散点图；图3c为本发明实施例3提供的样本号为57-84的基因分型散点图；图4为本发明实施例4提供的病例样本的基因分型散点图。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明提供了一种用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的引物组，包括：共用上游引物、等位基因特异引物和中间序列特异引物；所述共用上游引物为aldh2-f，具有如seqidno.1所示的核苷酸序列；所述等位基因特异引物包括aldh2-g-r和aldh2-a-r，所述aldh2-g-r具有如seqidno.2所示的核苷酸序列，所述aldh2-a-r具有如seqidno.3所示的核苷酸序列；所述中间序列特异引物为aldh2-mid，具有如seqidno.4所示的核苷酸序列。其中，本文所述的等位基因特异引物，该引物分为三部分，5’端为15个碱基左右的与通用引物相同的序列，中间为20个碱基左右的与通用探针反向互补的序列，3’端为与模板dna结合的特异引物序列；共用上游引物，该引物同于一般pcr引物，是与模板dna结合的特异引物序列，与等位基因特异引物搭配，完成富集pcr反应；通用探针，该通用探针基于taqman探针原理，一端为荧光基团，另一端为淬灭基团，其序列与等位基因特异引物的一段序列反向互补，以使得在实时荧光定量pcr阶段由中间序列特异引物引发水解而产生荧光；中间序列特异引物，是与等位基因特异引物和共用上游引物之间模板特异结合的引物，位置离等位基因特异引物的3’端在1～500个碱基之间，该引物在实时荧光定量pcr阶段反应中起到特异扩增并引发探针水解的作用；通用引物，是一段15个碱基左右的固定序列的引物，与等位基因特异引物的5’端序列相同，作为实时荧光定量pcr阶段的引物与中间序列特异引物配合完成实时荧光定量pcr反应。本发明利用通用探针技术开发的针对aldh2rs671位点的基因分型引物组，具有开发成本低，研发周期短，准确性高等特点，能够满足临床检测所需要的准确度、精密度及检出率等要求。并且，该引物组具有特异性强，准确度高，dna测定范围广(1ng-100ng/10μl体系)的优点有利于推动针对该位点的硝酸甘油个体化用药基因的临床检测。在一些优选的实施方式中，所述等位基因特异引物aldh2-g-r和aldh2-a-r，分别含有通用引物序列和与通用探针反向互补的序列；优选地，所述aldh2-g-r含有与fam通用探针反向互补的序列，fam信号代表g基因型，所述aldh2-g-r含有与hex通用探针反向互补的序列，hex信号代表a基因型。本发明还提供了一种用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的试剂，所述试剂包括上述的引物组。本发明提供的试剂除上述引物组外，典型但非限制性的还可以包括缓冲液或稀释液。该试剂具有上述引物组的全部有益效果。本发明还提供了一种用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组或试剂。本发明提供的试剂盒在一些优选的实施方式中，还可以包括2*pcrmix、2*up-qpcrmix、primermix、qprimermix、ddh2o和阳性标准品。该试剂盒具有上述引物组或试剂的全部有益效果。在一个具体的实施方式中，阳性标准品为基因型分别为gg、ga与aa的三种dna样本，且dna纯度均在1.7～1.8之间，浓度均为10ng/μl。在一些优选的实施方式中，所述primermix包括浓度分别为2μm的aldh2-f、aldh2-g-r和aldh2-a-r，溶剂为灭菌双蒸水；所述qprimermix包括浓度为8μm的aldh2-mid，溶剂为灭菌双蒸水。本发明还提供了一种乙醛脱氢酶2基因分型的检测方法，应用上述的引物组或试剂或试剂盒。该方法工艺简单，操作方便，检测成本低，大样本检出率达到98.8％，检测周期小于3h。因此，采用本发明提供的检测方法能够经济、准确，快速地分析aldh2rs671位点的基因型，这对于硝酸甘油个体化用药基因检测的临床推广具有重要意义。在一些优选的实施方式中，以待测样本的dna为模板，利用所述引物组进行实时荧光定量pcr反应，根据检测到的荧光信号判定乙醛脱氢酶2的基因分型。另外，本发明还提供了上述的引物组或试剂或试剂盒在检测个体对硝酸甘油药物敏感性中的应用。在一些优选的实施方式中，还包括将所述待测样本中含有特异位点的dna进行富集的步骤。对待测样本中含有特异位点的dna进行富集，能够保证待测样本中含有大量特异位点的dna，提高实时荧光定量pcr检测的灵敏性，并且在保证检测结果准确的基础上，增强荧光型号的强度，从而提高荧光信号的可判读性。优选地，通过pcr的方法对所述待测样本中含有特异位点的dna进行富集。优选地，利用aldh2-f、aldh2-g-r和aldh2-a-r作为引物进行所述pcr反应。在一个具体的实施方式中，富集pcr反应体系如下：试剂用量(μl/10μl体系)2*pcrmix5ddh2o3primermix1样本dna1富集pcr反应条件如下：在一个具体的实施方式中，实时荧光定量pcr反应体系如下：试剂用量(μl/10μl体系)2*pcrmix5ddh2o3qprimermix1待测产物1实时荧光定量pcr反应条件如下：其中，样本dna为待检测者的全血dna，待测产物为富集pcr反应的产物。下面结合实施例对本发明进行进一步的说明。除特殊说明外，本发明实施例中所使用的0.2mlpcr管及0.2ml八连排管采购自axygen；全血dna提取试剂盒由北京天根生化科技有限公司提供；2*pcrmix由宝生物工程(大连)有限公司提供；2*up-qpcrmix(通用探针分型试剂)由青岛海德源生物技术有限公司提供；primermix及qprimermix为发明人自行设计，由北京擎科新业生物技术有限公司合成。实施例1阳性参照样本基因分型分析经过一代测序结果分析，本实施例随机选取了基因型分别为gg、ga与aa的三种dna样本作为阳性参照，dna纯度均在1.7～1.8之间，浓度均为10ng/μl，应用本发明提供的试剂盒，采用如下检测方法检测阳性参照样本aldh2rs671位点基因型：(a)、特异位点pcr：根据样本类型，设置无模板对照组(ntc)和阳性参照组。根据试剂盒说明，2*pcrmix融化混匀后进行体系配置，反应体系加入2*pcrmix5μl，ddh2o3μl，primermix1μl(引物终浓度200pm)，阳性参照dna样本1μl。ntc组dna样本为纯水，阳性参照组dna样本为基因型gg、ga、aa的三种dna。所有样本的重复管数为3管，以保证实验结果的检出率和准确率。将混合好的体系，进行pcr反应，产物为第二步分型检测qpcr提供dna模板。pcr反应条件为：95℃2min，[95℃10s、65℃20s、72℃20s]12cycles，72℃1min，12℃保持。(b)、分型检测qpcr：根据步骤(a)所设置的分组类别及管数，融化混匀2*up-qpcrmix，并分装至八连排管中，每管5μl，加入ddh2o3μl，qprimermix1μl(引物终浓度800pm)，加入步骤(a)的pcr产物，每管1μl，总反应体系10μl，然后在qpcr仪上进行反应，并采集基因型特定信号。qpcr反应条件为，95℃2min，[95℃10s、65℃20s、(72℃20s采集信号)]35cycles。(c)、结果分析：本试剂盒中，fam信号代表g基因型，hex信号代表a基因型，根据步骤(b)所得信号类别和强度，以及ntc的信号，进行结果分析，分型结果散点图见图1。其中，gg型三个信号点在fam轴分布，aa型三个信号点在hex轴分布，ga型三个信号点在中间区域分布，实现了良好的分型结果。三种基因型及ntc实时荧光曲线见图2a、2b、2c和2d，如图可知，gg型只有fam信号产生，ga型fam与hex信号均有，且强度相似，aa型则只有hex信号产生，ntc无信号产生，结果与实验预期一致，说明该方法能够准确得出aldh2rs671位点阳性参照样本的基因型，为未知样本的分型检测提供了可靠的方法基础。实施例2大样本基因分型分析随机选择84个被测者，提取全血dna，并检测浓度和纯度，采用采用如下检测方法检测待测样本aldh2rs671位点基因型：(a)、全血dna提取：被测者外周抗凝血400μl，用全血dna提取试剂盒进行提取，浓度在1～100ng/μl，od260/280在1.7～1.9之间。(b)、特异位点pcr：根据样本类型，设置无模板对照组(ntc)、阳性参照组及实验组。根据试剂盒说明，2*pcrmix融化混匀后进行体系配置，反应体系加入2*pcrmix5μl，ddh2o3μl，primermix1μl(引物终浓度200pm)，dna样本1μl。ntc组dna样本为纯水，阳性参照组dna样本为基因型gg、ga、aa的三种dna，实验组dna样本被测者dna，若被测者dna浓度大于100ng，可用纯水稀释到10～100ng/μl再使用。所有样本的重复管数为3管，以保证实验结果的检出率和准确率。将混合好的体系，进行pcr反应，产物为第二步分型检测qpcr提供dna模板。pcr反应条件为：95℃2min，[95℃10s、65℃20s、72℃20s]12cycles，72℃1min，12℃保持。(c)、分型检测qpcr：根据步骤(b)所设置的分组类别及管数，融化混匀2*up-qpcrmix，并分装至八连排管中，每管5μl，加入ddh2o3μl，qprimermix1μl，加入步骤(b)的pcr产物，每管1μl(引物终浓度800pm)，总反应体系10μl，然后在qpcr仪上进行反应，并采集基因型特定信号。qpcr反应条件为，95℃2min，[95℃10s、65℃20s、(72℃20s采集信号)]35cycles。(d)、结果分析：本试剂盒中，fam信号代表g基因型，hex信号代表a基因型，根据步骤(b)所得信号类别和强度，以及阳性参照与ntc的信号，进行结果分析，分型结果散点图见图3a、3b和3c。其中，ntc组无信号，信号处在左下角，gg、ga、aa三种阳性参照品信号正常，84个被测者，除一个未检出信号外，其余分型结果良好，检出率为98.8％，跟一代测序(sanger测序)结果比对，该方法所得结果的准确率为100％，具体见表1。表1试剂盒实验结果与sanger测序结果样本号实验结果sanger样本号实验结果sanger样本号实验结果sanger样本号实验结果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实施例3病例样本的分型检测提取心绞痛病人全血dna一例，浓度为72ng/μl，纯度(od260/280)为1.86，采用本发明实施例2提供的检测方法检测该病人的aldh2rs671位点基因型。实验结果如图4所示，ntc组无荧光信号，信号处在左下角，gg、ga、aa三种阳性参照品信号正常，病人样本分型结果良好，结果为gg型。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。sequencelisting<110>青岛大学<120>用于检测乙醛脱氢酶2基因分型的引物组、试剂、试剂盒及检测方法和应用<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<400>1cctgggagtgtaacccataac21<210>2<211>54<212>dna<213>人工序列<400>2cctgtcctcggcacgcagggaaggtggtaggtgccacactcacagttttcacttc55<210>3<211>56<212>dna<213>人工序列<400>3cctgtcctcggcacggtgatttggtgggaggagcccacactcacagttttcacttta57<210>4<211>14<212>dna<213>人工序列<400>4ggagtggccgggag14当前第1页12