一种吡咯-罗丹明酰腙衍生物及其制备方法和应用与流程

本发明属于有机合成技术领域，具体涉及一种吡咯-罗丹明酰腙衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

荧光传感器是监测阳离子，阴离子和小分子的强大工具，主要由于其具有高灵敏度，简便的操作以及实时和在线检测的优点。铜是所有生物体维持正常生存所必需的微量营养素，也是人体中第三丰富的过渡金属。过量的二价铜离子主要是通过溶酶体-胆汁途径排泄到胆汁中，引起人体神经退行性疾病，如威尔森氏病，门克斯病和阿尔茨海默氏病。此外，一些铜转运蛋白定位于溶酶体中以促进细胞对铜的吸收。鉴于二价铜离子在人体内的作用，开发可用于检测亚细胞中特别是溶酶体中的二价铜离子荧光探针非常重要。

此外，现有二价铜离子荧光探针多为单纯依赖荧光强度的“off-on”或“on-off”荧光探针，容易受到诸如设备效率、环境条件及探针浓度等因素的影响，限制了其进一步应用。相比之下，比率荧光探针信号参量为两个不同波长处的荧光发射强度的比值，能够消除上述因素影响而备受关注。但能够靶向溶酶体的二价铜离子比率荧光探针寥寥无几。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种吡咯-罗丹明酰腙衍生物及其制备方法和应用，该吡咯-罗丹明酰腙衍生物在作为荧光探针检测二价铜离子时具有较高的灵敏度和较强的选择性，并可用于癌细胞溶酶体中二价铜离子的比率荧光检测。

基于上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种吡咯-罗丹明酰腙衍生物，其结构式如下：

上述化合物的合成路线如下：

上述吡咯-罗丹明酰腙衍生物的制备方法，包括如下步骤：

s1：将n-(2-吗啉-4-乙基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1h-吡咯-3-甲酰胺加入有机溶剂中溶解，再加入罗丹明6g酰肼，得混合物；

s2：将s1所得混合物在常压下进行回流搅拌反应；

s3：反应结束后，冷却至室温，有固体析出，减压过滤，取滤渣；

s4：将s3所得滤渣进行洗涤，得到吡咯-罗丹明酰腙衍生物。

更进一步地，步骤s1中所述有机溶剂为乙醇。

更进一步地，所述乙醇为无水乙醇或体积浓度为95%的乙醇。

更进一步地，步骤s2中所述回流搅拌反应的时间为3h。

更进一步地，步骤s4中，用无水乙醇洗涤s3所得滤渣。

更进一步地，步骤s1中加入的将n-(2-吗啉-4-乙基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1h-吡咯-3-甲酰胺和罗丹明6g酰肼的摩尔比为1:1。

更进一步地，步骤s1中每0.3l有机溶剂中加入0.01mol的n-(2-吗啉-4-乙基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1h-吡咯-3-甲酰胺。

本发明还提供所述的吡咯-罗丹明酰腙衍生物作为荧光探针在测定水中二价铜离子的应用。在测定水中二价铜离子时，不仅定性，还可以定量检测出二价铜离子的浓度。

所述的吡咯-罗丹明酰腙衍生物作为荧光探针在测定水中二价铜离子的应用，步骤如下：将所述吡咯-罗丹明酰腙衍生物加入ch3cn和羟乙基哌嗪乙硫磺酸(hepes)缓冲溶液（ph=5.0）的混合介质中，配制成摩尔浓度为1×10^-5mol/l的荧光探针溶液，分别在含摩尔浓度为3×10^-5mol/l的ag⁺，al³⁺，ca²⁺，cd²⁺，co²⁺，cr³⁺，cu²⁺，fe³⁺，hg²⁺，k⁺，mg²⁺，mn²⁺，na⁺，ni²⁺，pb²⁺和zn²⁺的金属离子的溶液中加入等体积的上述荧光探针溶液，分别进行荧光光谱分析，其中，所述混合介质中ch3cn和hepes缓冲溶液的体积比为8︰2。

基于吡咯-罗丹明酰腙衍生物通常情况下能够与二价铜离子形成稳定的配合物，加入二价铜离子会出现比率荧光信号，故吡咯-罗丹明酰腙衍生物具有较好的二价铜离子识别性能。同时由于溶酶体定位基吗啉的引入，使得探针能够实现细胞溶酶体中二价铜离子的检测。即所述吡咯-罗丹明酰腙衍生物可用于制备定性检测细胞溶酶体中二价铜离子的检测剂。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明通过用缩合反应制备吡咯-罗丹明酰腙衍生物荧光探针，合成方法简单，原料易得，在多种常见金属离子中，对二价铜离子表现出较高的选择性比率荧光识别性能。探针溶液中加入二价铜离子，荧光颜色由青色变为绿色，具有比率荧光效应，可实现裸眼辨别检测，具有快速、简便、灵敏度高、选择性强的特点，以及广泛的潜在应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的荧光探针乙醇合物的晶体结构图；

图2为本发明实施例1制得的荧光探针的核磁共振氢谱图；

图3为本发明实施例1制得的荧光探针的质谱谱图；

图4为本发明实施例1制得的荧光探针(1×10^-5mol/l)的ch3cn/hepes(8/2,v/v)溶液（图4中的1）中加入不同金属离子(ag⁺，al³⁺，ca²⁺，cd²⁺，co²⁺，cr³⁺，cu²⁺，fe³⁺，hg²⁺，k⁺，mg²⁺，mn²⁺，na⁺，ni²⁺，pb²⁺，zn²⁺，3×10^-5mol/l)的荧光光谱图；

图5为本发明实施例1制得的荧光探针的ch3cn/hepes(8/2,v/v)溶液(1×10^-5mol/l)滴定不同浓度cu²⁺的荧光光谱图；

图6在hela细胞中，荧光探针与二价铜离子及商用溶酶体定位染料lysotrackerred的荧光成像图；hela细胞用1×10^-5mol/l荧光探针及商用溶酶体定位染料lysotrackerred培育30分钟后加入2×10^-5mol/l二价铜离子，继续培育30分钟后使用olympusfv500-ix70激光共聚焦显微镜进行荧光成像；

荧光探针+lysotrackerred共染：a为蓝色通道荧光成像图；b为绿色通道荧光成像图；c为lysotrackerred红色通道荧光成像图；d为蓝色通道，绿色通道和红色通道叠加图；e为明场图；f为明场图和荧光图叠加图；荧光探针+cu²⁺+lysotrackerred共染：g为蓝色通道荧光成像图；h绿色通道荧光成像图；i为lysotrackerred红色通道荧光成像图；j为蓝色通道，绿色通道和红色通道叠加图；k为明场图；l为明场图和荧光图叠加图；m为荧光探针横跨hela细胞线性区域的蓝色通道强度与lystrasered红色通道强度的重叠图；n为荧光探针与二价铜离子作用后横跨hela细胞线性区域的绿色通道强度与lystrasered红色通道强度的重叠图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

实施例1

吡咯-罗丹明酰腙衍生物的合成：

将n-(2-吗啉-4-乙基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1h-吡咯-3-甲酰胺(279mg，1mmol)加入到含罗丹明6g酰肼(428mg，1mmol)的无水乙醇(30ml)中，加热回流3小时，然后将其冷却至室温，冷却至室温后，减压抽滤，用无水乙醇洗涤滤饼，然后在空气中干燥，得到白色固体，即为目标产物，收率72%。

采用单晶衍射确定了吡咯-罗丹明酰腙衍生物乙醇合物的晶体结构，具体见图1。

对制得的吡咯-罗丹明酰腙衍生物进行核磁共振分析，具体核磁图谱见图2，图2分析结果如下：

¹hnmr(400mhz，dmso-d6)，δ(ppm)：11.09(s，1h，nh-吡咯)，8.00(s，1h，ch=n)，7.85-7.87(dd，1h，ar-h)，7.52-7.55(m，2h，ar-h)，7.10-7.13(t，1h，ar-h)，6.96-6.98(t，1h，ar-h)，6.30(s，2h，ar-h)，6.15(s，2h，ar-h)，5.10-5.13(t，2h，2nh)，4.36-4.38(t，1h，nh)，3.54-3.56(t，4h，2ch2)，3.22-3.27(dd，3h，ch3)，2.33-2.39(m，6h，2ch2+ch2)，2.23(s，3h，ch3)，1.88(s，3h，ch3)，1.84(s，6h，2ch3)，1.17-1.21(t，6h，2ch3)；

对制得的吡咯-罗丹明酰腙衍生物进行了质谱分析，，具体质谱谱图见图3，由图3可知：m/z=345.6877([m+2h]²⁺);690.3656([m+h]⁺)。

实施例2

吡咯-罗丹明酰腙衍生物对二价铜离子的光学性质测定

将上述实施例1制得的吡咯-罗丹明酰腙衍生物作为荧光探针在ch3cn/hepes(体积比8︰2)介质中配制成摩尔浓度为1×10^-5mol/l的溶液，分别在含摩尔浓度为3×10^-5mol/l的ag⁺，al³⁺，ca²⁺，cd²⁺，co²⁺，cr³⁺，cu²⁺，fe³⁺，hg²⁺，k⁺，mg²⁺，mn²⁺，na⁺，ni²⁺，pb²和zn²⁺等金属离子的水溶液中加入等体积上述荧光探针溶液，采用荧光光谱仪对其分别进行荧光光谱分析（激发波长为360nm，实时检测），所得的荧光光谱图见图4。通过图4可以看出，本发明实施例1制得的吡咯-罗丹明酰腙衍生物作为荧光探针与二价铜离子的作用后，荧光发射峰位置和强度均发生明显改变。365nm紫外灯激发下，探针与二价铜离子作用，由青色荧光变为黄色荧光，具有比率荧光效应，可实现裸眼辨别检测。而本发明实施例1制得的吡咯-罗丹明酰腙衍生物对其它金属离子如ag⁺，al³⁺，ca²⁺，cd²⁺，co²⁺，cr³⁺，cu²⁺，fe³⁺，hg²⁺，k⁺，mg²⁺，mn²⁺，na⁺，ni²⁺，pb²和zn²⁺等无明显荧光发射峰位置变化。

摩尔浓度为1×10^-5mol/l的吡咯-罗丹明酰腙衍生物作为荧光传感器的ch3cn/hepes(8/2,v/v)溶液中分别加入等体积浓度为0mol/l，0.5×10^-6mol/l，1×10^-6mol/l，1.5×10^-6mo/l，2×10^-6mol/l，2.5×10^-6mol/l，3×10^-6mol/l，3.5×10^-6mol/l，4×10^-6mol/l，5×10^-6mol/l，6×10^-6mol/l，7.5×10^-6mo/l，8×10^-6mol/l，9×10^-6mol/l，9.5×10^-6mol/l，1.05×10^-5mol/l，1.2×10^-5mol/l，1.35×10^-5mol/l，1.5×10^-5mol/l，1.65×10^-5mol/l，1.8×10^-5mol/l，2.0×10^-5mol/l，2.2×10^-5mol/l，2.2×10^-5mol/l，2.4×10^-5mol/l，2.6×10^-5mol/l，2.8×10^-5mol/l，3.0×10^-5mol/l，3.25×10^-5mol/l，3.5×10^-5mol/l，4.0×10^-5mol/l，4.5×10^-5mol/l，5.0×10^-5mol/l，6.0×10^-5mol/l，8.5×10^-5mol/l的二价铜离子溶液，采用荧光光谱仪对其分别进行荧光光谱分析（激发波长为360nm），所得的荧光光谱图见图5。通过图5可以计算得到吡咯-罗丹明酰腙衍生物对二价铜离子的检出限为1.05×10^-7mol/l，荧光强度比值f552/f484对二价铜离子的线性响应浓度范围为6.0×10^-6-3.0×10^-5mol/l，因此本发明实施例1制得的衍生物可用于二价铜离子的比率荧光定量检测。

实施例3

吡咯-罗丹明酰腙衍生物在细胞内铜离子的检测实验

hela细胞用1×10^-5mol/l的上述实施例2制得的吡咯-罗丹明酰腙衍生物荧光探针与商用溶酶体定位染料lysotrackerred培育30分钟后加入2×10^-5mol/lcu²⁺溶液（溶剂为水）使得cu²⁺的终浓度为50μmol/l，继续培育30分钟后使用olympusfv500-ix70激光共聚焦显微镜进行荧光成像，获得在hela细胞的荧光成像图，具体如图6所示。荧光探针+lysotrackerred共染：a为蓝色通道荧光成像图；b为绿色通道荧光成像图；c为lysotrackerred红色通道荧光成像图；d为蓝色通道，绿色通道和红色通道叠加图；e为明场图；f为明场图和荧光图叠加图；荧光探针+cu²⁺+lysotrackerred共染：g为蓝色通道荧光成像图；h绿色通道荧光成像图；i为lysotrackerred红色通道荧光成像图；j为蓝色通道，绿色通道和红色通道叠加图；k为明场图；l为明场图和荧光图叠加图。m为荧光探针横跨hela细胞线性区域的蓝色通道强度与lystrasered红色通道强度的重叠图；n为荧光探针与二价铜离子作用后横跨hela细胞线性区域的绿色通道强度与lystrasered红色通道强度的重叠图。通过图6可以看出，本发明实施例1制得的吡咯-罗丹明酰腙衍生物作为荧光探针在hela细胞中蓝色通道发射强荧光，绿色通道弱荧光；加入二价铜离子后，蓝色通道荧光明显减弱，绿色通道荧光明显增强，说明吡咯-罗丹明酰腙衍生物可用于细胞中二价铜离子的比率荧光检测。图6m表明本发明实施例1制得的吡咯-罗丹明酰腙衍生物蓝色通道荧光发射与lysotrackerred红色通道的共染指数高达86%，图6n表明本发明实施例1制得的吡咯-罗丹明酰腙衍生物与二价铜离子作用后绿色通道荧光发射与lysotrackerred红色通道的共染指数高达90%，证明本发明实施例1制得的罗丹明类酰腙衍生物能够特异性定位溶酶体，并能够在活细胞溶酶体中实现对铜离子的比率荧光检测。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，其保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内，本发明的保护范围以权利要求书为准。