基于荧光定量PCR检测鲟鱼的引物和探针及其试剂盒与方法与流程

本发明属于分子生物学
技术领域：
，涉及一种基于荧光定量pcr检测鲟鱼的引物和探针及其试剂盒与方法。
背景技术：
：鲟鱼(acipenser)，属于硬骨鱼纲，辐鳍亚纲，鲟形目，是远古鱼类，具有很高的科研、药用和观赏价值。鲟鱼为高蛋白、多脂肪性鱼类，其鱼皮可制成优质特种皮革，鱼卵可制成鱼子酱，鱼胆可入药，鱼肉、鱼肠和鱼骨等均是上等佳肴，可谓是“全身都是宝”。但是由于人为因素影响鲟鱼生存环境和过度捕捞等多因素影响，野生鲟鱼数量锐减，虽然人工养殖技术不断提升，但是仍无法实现大规模养殖。不少商家为了谋求高额利润，在加工处理、市场流通等环节，存在以次充好、乱贴标签的现象。目前关于鉴定鲟鱼的报道较少，主要依赖于传统的形态学鉴别法，但需要从业人员具备较强的专业背景知识，受主观判断影响大，易出错。而以分子生物学为基础的检测方法主要包括微卫星分子标记、随机引物扩增多态性、限制性长度多态性等，但这些方法存在耗时长、操作复杂、重复性差和误差大等弊端。为了对鱼肉及其制品进行溯源，亟需快速、精准、高效的鉴定方法。技术实现要素：有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于提供一种基于荧光定量pcr检测鲟鱼的引物和探针。本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于荧光定量pcr检测鲟鱼的试剂盒。本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于荧光定量pcr检测鲟鱼的方法。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：一方面，本发明提供了一种基于荧光定量pcr检测鲟鱼的引物和探针，包括上游引物fp、下游引物bp、探针probe，其核苷酸序列分别如下所示：fp：5-ctgcatacattaaattgtac-3；bp：5-ggtagatgaaacattctg-3；probe：5-fam-taatccccattaatttctagccacca-tamra-3，其中5端标记的荧光基团是fam，3端标记的淬灭基团是tamra。优选地，扩增反应时，fp引物、bp引物和探针的摩尔比为：2：2：1。另一方面，本发明还公开了一种基于荧光定量pcr检测鲟鱼的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1或2中所述的检测引物和探针。优选地，该基于荧光定量pcr检测鲟鱼的试剂盒还包括以下成分的部分或者全部：(1)pcrmix反应液；(2)去离子水；(3)阳性对照和阴性对照。优选地，所述的pcrmix反应液含有：5utaq酶，2.5mmdntps，25mmmgcl2，2×pcrbuffer。优选地，阳性对照为含有鲟鱼特异性基因片段的t载体克隆，阴性对照为不含有鲟鱼特异性基因片段的水或其他溶剂。再有，本发明还公开了一种基于荧光定量pcr检测鲟鱼的方法，包括如下步骤：(1)待检样品dna的提取；(2)荧光定量pcr反应体系的配制：将步骤(1)中提取的待检样品dna加入荧光定量pcr反应体系，混匀后离心，所述荧光定量pcr反应体系中含有如权利要求1或2中所述的引物和探针；(3)荧光定量pcr反应：设置阳性对照和阴性对照，将配好的荧光定量pcr反应体系置于荧光定量pcr仪后开始反应，反应程序如下：95℃反应10min；95℃反应15sec，60℃反应60sec，45个循环，每循环延伸结束时收集荧光信号；(4)结果判断：通过观察荧光定量pcr的扩增曲线判断扩增结果。优选地，荧光定量pcr反应体系为25μl反应体系，其含有10μmol/lfp和bp引物各1μl，10μmol/l探针0.5μl，pcrmix反应液12.5μl，模板5μl，用去离子水补齐到25μl。本发明的方案是基于荧光定量pcr技术实现对鲟鱼快速检测，从原理上讲，荧光定量pcr技术是利用扩增过程中taq酶的5端核酸外切酶活性切割与靶序列结合的寡核苷酸探针，该探针5端标记荧光报告集团，3端标记荧光淬灭基团并被磷酸化以防止探针在pcr过程中延伸，当引物延伸至寡核苷酸结合位置时，taq酶可以将其切割成小片段，使报告集团和淬灭基团分开并发出荧光，经过检测伴随扩增产物增加过程中荧光强度的增加对样本进行定量分析。该方法具有灵敏度高、特异性强、检测时间短、操作方便等优点。本发明以荧光定量pcr技术为依托，开发一种可快速鉴别鲟鱼的试剂盒及检测方法。目前尚未有将荧光定量pcr技术应用于快速鉴别鲟鱼的试剂盒。本试剂盒能够在短时间内实现鲟鱼的快速、精准鉴定，完成鱼肉及其制品的种质溯源，为食品安全监督管理部门和第三方食品加工企业等单位提供有力的技术支持，同时有利于提升我国水产行业的属种鉴定能力，有着广阔的应用前景和产业化前景。因此，结合上述原理及本发明实施例中的技术效果可知，本发明至少包含如下有益效果：(1)检测时间短：在60min内可实现将对鲟鱼的鉴定；(2)可实时监控：通过监测荧光信号，实现实时在线监控，更加直观得观察产物的增加；(3)特异性强：引入荧光探针，使引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了其特异性；(4)操作简便：仅需完成配液、上机和结果读取这三个步骤，无需进行跑胶、酶切等复杂操作，使得操作人员更容易接受，有利于方法推广；(5)污染少：采用闭管检测，无需后续对pcr产物进行开盖处理，避免了气溶胶污染。因此，本方法克服了传统种属鉴定操作复杂，时间长等局限，可实现快速、精准得鉴定银鱼。附图说明图1是本发明实施例3中特异性实验的检测结果图。具体实施方式以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1基于荧光定量pcr技术快速鉴别鲟鱼检测试剂盒的建立基于荧光定量pcr技术快速鉴别鲟鱼的检测试剂盒，包括引物组、pcrmix反应液、去离子水、阳性对照和阴性对照。(1)荧光定量pcr扩增引物设计：以鲟鱼特异性保守序列为靶基因进行引物的设计。引物序列见表1。表1引物序列表引物名称引物序列(5’-3’)fpctgcatacattaaattgtac(seqidno：1)bpggtagatgaaacattctg(seqidno：2)probetaatccccattaatttctagccacca(seqidno：3)(2)荧光定量pcrmix反应液含有：5utaq酶，2.5mmdntps，25mmmgcl2，2×pcrbuffer。(3)阳性对照为含有鲟鱼特异性基因片段的t载体克隆，其制备方法为：dna模板来源于鲟鱼，利用表1中的fp和bp引物(seqidno：1和seqidno：2)对模版dna进行pcr扩增反应，得到含靶基因序列的dna，回收该扩增片段，利用常规方法连接到t载体中，即为阳性对照。(4)阴性对照为去离子水。实施例2基于荧光定量pcr技术快速鉴别鲟鱼的检测方法利用实施例1的试剂盒检测鲟鱼的方法，包括如下步骤：(1)待检样品dna的提取；(2)荧光定量pcr反应体系：25μl反应体系中含有10μmol/lfp和bp引物各1μl，10μmol/l探针0.5μl，pcrmix反应液12.5μl，模板5μl，用去离子水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的pcr管混匀后离心，放置荧光pcr仪(如abi7500)进行反应。(3)反应程序如下：95℃反应10min；95℃反应15sec，60℃反应60sec，45个循环，每循环延伸结束时收集荧光信号。(4)结果判断：观察荧光定量pcr仪扩增ct判断扩增结果，如果ct值小于30且出现“s”型曲线则为阳性，即检测样品为鲟鱼；反之，则为阴性。实施例3特异性实验样本来自广州某水产市场以及某生鲜网站，包括青石斑鱼、鲟龙鱼、黄花鱼、鲈鱼、鲟鱼、三文鱼、金鲳鱼、舟山鲳鱼、武汉草鱼、阿拉斯加黄金鲽鱼、南美灰鲳、多宝鱼、马拉西亚鲟鱼、东海带鱼、鳜鱼、武汉桂鱼、俄罗斯秋刀鱼、东海鲳、鲫鱼等37个样品，所有样品均经过测序法验证其属种，检测结果见图1。由图中的检测接过来看，本发明方案具有良好的特异性。另外，利用本发明的方法及试剂盒对实际检测样本的的检测，选取来自检验检疫部门和质检部门多个检测站提供的435个样本鱼类的检测，除一个样本误检外，其余样本均能够检测出正确的结果，通过本发明的方案确定待检测鱼类是否为鲟鱼，并通过测序或者其他检测方法的验证，准确性高于99.1％，且方便快捷。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页12