本发明属于核苷化合物合成领域，更具体地，本发明涉及一种新型核苷修饰物2’-eoe-鸟嘌呤核苷的制备方法。
背景技术
近年，随着基因组创药的发展，反义寡核苷酸药物被急速开发，究其原因在于其较传统药物来讲具有以下几点优势：1)特异性较强。一个15聚体的反义寡核苷酸含有30-45氢键，而低分子的传统药物(200-600u)与靶点一般只形成1-4个键；2)信息量较大。遗传信息从dna-rna-蛋白质，用互补寡核苷酸阻断某种蛋白的合成是很准确的；3)反义药物以核酸为靶点，与蛋白质作为靶点比较，更易合理设计新药物。由于作用于遗传信息传递的上游，所需药量较低，副作用可能较少。
随着技术研究的推进，对反义药物的研究正兴盛起来。国内已有数家科研单位正在开展反义药物的研究，并已有若干反义寡核苷酸产品处在临床前试验阶段，相信国产反义药物有望在未来5～8年内上市并造福于国内广大患者。
但是，目前反义药物的工业化合成工艺进行仍处于初级阶段，而实验室规模的工艺制备，无法满足工业化要求。
因此，本领域迫切需要提供有效且无需特别设备，适合大规模工业化生产反义药物或其前期合成原料的技术。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种新型核苷修饰物2’-eoe-鸟嘌呤核苷的制备方法。
在本发明的第一方面，提供一种式a所示化合物的制备方法，
所述的方法包括：
(1)以化合物c(2,6-二氨基-嘌呤核苷)为起始原料，先与金属氢化物反应，生成醇钠型活性中间体；接着与2-卤代乙基乙基醚反应，获得2,6-二氨基-嘌呤核苷中间体b；
(2)脱氨酶催化2,6-二氨基-嘌呤核苷中间体c，将其特定位点的氨基转化为羰基，从而获得化合物a(2’-eoe-鸟嘌呤核苷)。
在一个优选例中，(1)中，所述的金属氢化物为nah，kh、cah2；较佳地为nah。
在另一优选例中，(1)中，所述2-卤代乙二醇单乙醚选自：2-氯代乙基乙基醚，2-溴代乙基乙基醚，2-碘代乙基乙基醚；优选地，所述2-卤代乙二醇单乙醚为2-溴代乙基乙基醚。
在另一优选例中，(1)中，醇钠型活性中间体与2-卤代乙基乙基醚反应后，还包括：对含有2,6-二氨基-嘌呤核苷中间体b的粗品进行结晶纯化；优选地，以甲醇或乙醇作为结晶的溶剂；更优选地，以乙醇作为结晶的溶剂；进一步优选地，乙醇的用量与化合物c重量体积比为1∶10-30(较佳地为1∶15-25；最佳地为1∶20)。
在另一优选例中，(1)中，以n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、dmso或乙二醇二甲醚(dme)作为化合物c的溶剂，优选地以n,n-二甲基甲酰胺作为化合物c的溶剂；溶解后，降温至0±2℃，在惰性气体(较佳地为氩气或氮气)氛围下与金属氢化物反应；较佳地，按照重量体积比，溶剂的用量为化合物c的3～10倍(较佳地为5～10倍)。
在另一优选例中，(1)中，金所述化合物c和金属氢化物的摩尔比为1∶1.0-3.0(较佳地为1∶1.2-2.5；最佳地为1∶1.5)；和/或
2-卤代乙基乙基醚用量为化合物c的0.8～1.8摩尔当量，优选地为1～1.5摩尔当量。
在另一优选例中，(2)中，所述脱氨酶为腺苷脱氨酶；优选地，脱氨酶与化合物b按照重量比为1∶1000-3000(较佳地为1∶2000-3000；最佳地为1∶2500)；优选地，酶催化反应的温度为18～45℃(较佳地为25～45℃，更佳地为40℃)；或(2)中，在中性条件下，较佳地ph＝7-8条件下进行反应。
在另一优选例中，(2)中，生成式a所示的化合物后，还包括：将包含式a所示的化合物的产物进行重结晶纯化，获得高纯度的式a所示的化合物；优选地，以水(较佳地为去离子纯化水)为重结晶溶剂；更优选地，化合物b与水按照重量体积比为1∶20-40(较佳地为1∶25-35；最佳地为1∶30)。
在本发明的另一方面，提供一种化合物，其结构式如式a所示：
在另一优选例中，所述的化合物由前面任一所述方法制备获得。
在本发明的另一方面，提供所述的化合物的用途，用于合成反义寡核苷酸。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施方式
发明人经过广泛的研究和试验，首次发现以2,6-二氨基-嘌呤核苷(化合物c)为起始原料，先与氢化钠反应，生成醇钠型活性中间体，然后接着与2-溴代乙基乙基醚反应，生成目标基团修饰的2’-eoe-2,6-二氨基-嘌呤核苷中间体(化合物b)，然后通过生化反应，利用腺苷脱氨酶将化合物b特定位点的氨基转化为羰基，从而高收率，高选择性地生成目标产物2’-eoe-鸟嘌呤核苷(化合物a)。本发明所阐述的方法可以简便、经济地大量合成2’-eoe-鸟嘌呤核苷，获得非常高纯度的目标化合物。本发明的方法无需特别设备，适合于大规模工业化生产。
在医药品生产中，为了尽可能地抑制由含有的杂质生成的副生成物，有必要使用非常高纯度的寡核苷。因此，本发明提出了一种制备高纯度的5’-dmtr-2’-eoe-胸腺嘧啶核苷的方法。
本发明中，所述的2’-eoe-鸟嘌呤核苷的结构如下式a：
首先，本发明提供了一种制备特定目标基团修饰的嘌呤核苷化合物的方法，该化合物具有如下式b所示的结构式(2,6-二氨基-嘌呤核苷中间体b)。
所述的式b化合物的制备方法包括：以化合物c(2,6-二氨基-嘌呤核苷)为起始原料，先与金属氢化物反应，生成醇钠型活性中间体；接着与2-卤代乙基乙基醚反应。其合成路线如下所示：
获得如上中间体后，进一步地，本发明提供了一种适合工业化生产制备2’-eoe-鸟嘌呤核苷(式a化合物)的方法，包括：在中性条件下，较佳地ph＝7-8条件下，以脱氨酶催化2,6-二氨基-嘌呤核苷中间体b，将其特定位点的氨基转化为羰基，从而获得化合物a(2’-eoe-鸟嘌呤核苷)。其合成路线如下所示：
本发明涉及的各步骤的合成中，solvent1可以选取dmf，dmso或者dme。应理解，solvent1可以应用本领域技术人员熟悉的那些，只要能够实现溶解反应物底物c，同时不与所述的金属氢化物(优选为nah)起反应的试剂均是可以用于本发明中的。作为本发明的优选方式，所述的solvent1试剂为dmf。
作为本发明的优选方式，所述的金属氢化物为nah，所述化合物c和氢化钠的摩尔比为1∶1.0-3.0；较佳地为1∶1.2-2.5；最佳地为1∶1.5。
作为本发明的优选方式，溶剂dmf的用量为化合物c的5～10重量体积比；2-卤代乙基乙基醚优选：2-溴代乙基乙基醚，且其用量为化合物c的0.8～1.8摩尔当量；较佳地为1∶0.8-1.2；最佳地为1∶1。
作为本发明的优选方式，solvent2为水，更佳地为去离子水；所述的结晶纯化工序中的结晶溶剂选自：去离子纯化水；其中去离子纯化水的用量与化合物b重量体积比为1∶20-40；较佳地为1∶25-35；最佳地为1∶30。
作为本发明的优选方式，所述脱氨酶是腺苷脱氨酶，较佳地，其与化合物b重量比为1∶1000-3000；较佳地为1∶2000-3000；最佳地为1∶2500；较佳地，其参与反应时的反应温度为：18～45℃；较佳地为：25～45℃；最佳地为40℃。
在进行酶反应之后，还包括步骤：将含有式a的化合物的反应粗品进行重结晶，进而获得高纯度的式a化合物。应理解，尽管本发明中提供了优选的结晶溶剂体系，但本领域已知的一些可替代溶剂体系也是可用于式a化合物的纯化。
在本发明的具体实施例中，提供了一种式a化合物的制备方法，包括步骤：
第一步，将化合物c溶于dmf中，降温至-2～2℃；然后加入氢化钠，搅拌反应，制得醇钠活性中间体；
第二步，向上述体系中加入2-溴乙基乙基醚，进行反应，制得化合物b粗品；
第三步，将制得化合物b粗品用乙醇结晶，得到高纯度的式b中间体；
第四步，将化合物b溶于去离子水中，加入腺苷脱氨酶，进行反应，制得2’-eoe-鸟嘌呤核苷粗品(即式a化合物)；
第六步，将式a粗品通过重结晶纯化工艺，得到高纯度的目标化合物a。
据此，本发明提供了有效且无需特别设备，适合大规模工业化生产，可得到高纯度2’-eoe-鸟嘌呤核苷的制备方法，可满足市场的需求。
本发明还提供了新型化合物2’-eoe-鸟嘌呤核苷，其可作为合成新型反义寡核苷酸的基础原料，可被应用于反义寡核苷酸的合成领域。
并且，除可作为药物开发工具外，2’-eoe-鸟嘌呤核苷还可用于科学研究，特别是功能基因组学研究。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、发明人筛选较多条件后，发现可以特定的化合物c为起始原料，与金属氢化物在特定的反应条件下，可以优势合成2’-eoe-2,6-二-氨基嘌呤核苷即化合物b，极大低降低了异构体的生成，较大地提高了转化率以及降低了中间体化合物b的纯化难度，便于规模化生产。
2、本发明制备过程中无需特殊或非常危险性试剂，对设备，人员素质等无高等级要求。
3、本发明过程简单，便捷，可通过简单的三步反应即可制的目标化合物。
4、本发明提供的纯化方法简便，无需特殊设备，成本低廉。
5、本发明提供的纯化方法效果显著，目标化合物的含量可以达到99％以上。
6、本发明的方法可以简便、经济地大量合成2’-eoe-鸟嘌呤核苷，可以应用于工业化大规模生产。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，实施例中的定义各试剂的量的百分比(％)是质量体积比(w/v)。
本发明下述实施例中的hplc(高效液相色谱)条件：
柱：ymc-aqc185μm4.6*250mm
流速：0.8ml/min
波长：260nm
流动相：a液：teaa缓冲液(0.1摩尔/升的乙酸水溶液用三乙胺调至ph＝7.0)。b液：色谱级甲醇。分析过程中a液，b液在线脱气，氦气流速50ml/min。
梯度：
实施例1、2’-乙氧乙基(eoe)-2,6-二氨基嘌呤核苷的制备(化合物b)
称取2,6-二氨基嘌呤核苷(cas号：2096-10-8)135.58kg溶解于1350ldmf中，反应液降温至0±2℃，氩气保护下加入nah29.10kg，加入过程温度0℃～5℃，加毕0℃搅拌1h。
上述反应体系自然恢复至室温后，向体系中滴加2-溴乙基乙基醚73.64kg，滴毕室温搅拌反应。反应至产物不再增加。0±2℃下向体系缓慢加入水淬灭反应。向体系中缓慢加入2mhcl溶液，调节ph至中性。65℃真空浓缩至不滴，残余固体在乙醇中结晶得到72.91kg淡黄色固体，其为2’-eoe-2,6-二氨基嘌呤核苷。纯度98.3％，收率42.8％。
1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ(ppm):7.95(s,1h),6.80(brs,2h),5.83(d,j＝6.5hz,1h),5.75(brs,2h),5.46(brs,1h),5.01(d,j＝4.5hz,1h),4.49-4.47(m,1h),4.30-4.25(m,1h),3.96-3.91(m,1h),3.68-3.60(m,2h),3.59-3.51(m,2h),3.44-3.40(m,2h),3.37-3.29(m,2h),1.01(t,j＝7.0hz,3h).
实施例2、2’-eoe-鸟嘌呤核苷的制备(化合物a)
称取前述实施例1获得的2’-eoe-2,6-二氨基嘌呤核苷52.91kg，加入1060l水，ph试纸检测体系为中性后加入脱氨酶，37～42℃搅拌反应。反应结束后反应液于油泵水浴55±2℃浓缩至小体积，有大量白色晶体析出，再将体系冰浴0℃保持1h，过滤，滤饼用冰水洗涤，滤饼用水重结晶一次，离心干燥后得产品47.64kg，其为2’-eoe-鸟嘌呤核苷。纯度99.6％，收率：90.0％。
1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ(ppm):10.63(s,1h),7.95(s,1h),6.46(brs,2h),5.78(d,j＝6.6hz,1h),5.06(t,j＝5.4hz,1h),5.04(d,j＝4.8hz,1h),4.38-4.36(m,1h),4.26-4.23(m,1h),3.91-3.89(m,1h),3.68-3.64(m,1h),3.61-3.50(m,3h),3.44-3.42(m,2h),3.36-3.33(m,2h),1.02(t,j＝7.2hz,3h).
实施例3、2’-eoe-鸟嘌呤核苷合成下游产品的工艺
利用“2’-eoe-鸟嘌呤核苷”合成下游产品的主要工艺流程如下。
根据以上工艺流程，获得有用的下游产物，应用于反义寡核苷酸药物领域。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。