一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其在防治油茶炭疽病害中的应用的制作方法

本发明属于微生物工程
技术领域：
，尤其涉及一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其在防治油茶炭疽病害中的应用。
背景技术：
：油茶(camelliaoleiferaaabel)系山茶科山茶属植物，起源于中国，具有悠久的栽培历史，是与油棕、橄榄和椰子齐名的世界四大木本食用油源树种之一。我国的油茶资源丰富，主要分布在南方的湖南、江西、广西、浙江、福建、安徽、贵州等省区。据统计，目前全国有油茶林约为400万hm2以年产油茶籽60万吨。油茶病害对其产量的影响也日益突出，其中油茶炭疽病是最重要的病害之一，常导致油茶叶片枯死、果实早落，落果率一般为20％～40％，严重时可达60％以上，从而导致油茶减产10％～30％，甚至可达40％～50％，造成巨大的经济损失，油茶炭疽病已成为油茶产业的重要潜在威胁。因此，需要加强对油茶炭疽病的研究力度，提高对油茶炭疽病的防治技术。针对于油茶炭疽病，常见的防治措施有化学农药喷洒，但是化学方法污染较大。需要寻求更为环保的微生物防治的方法显得格外重要，生物防治由于其不易使病原菌产生抗药性、对环境安全、活性高且生产成本低逐渐成为大家关注和研究的热点。如：孟庆敏等研究发现油茶内生拮抗细菌y13是一株对油茶炭疽病菌有较强抑制作用的枯草芽胞杆菌(油茶炭疽病拮抗细菌y13主要抑菌物质分离纯化及作用方式，植物保护，2014年02期)，信珊珊等用解淀粉芽孢杆菌wh1发酵液中的抗菌活性物质为脂肽，该成分能够使油茶炭疽病菌丝畸形，高稀释倍数的发酵液对离体油茶叶片上的炭疽病仍然有显著的防效(1株解淀粉芽孢杆菌发酵条件的优化及其对油茶炭疽病的防效华中农业大学学报，2011年04期)。但是上述种的耐受性较差，适应性较差。因此，寻找一种耐受性更好，适应性更强的可用于防治油茶炭疽病的菌种对本领域具有十分重要的意义。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是，克服以上
背景技术：
中提到的不足和缺陷，提供一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其在防治油茶炭疽病害中的应用。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为提供一株解淀粉芽孢杆菌菌株，该解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其命名为解淀粉芽孢杆菌cfc-10(bacillusamyloliquefacienscfc-10)，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为gdmccno：60394，保藏时间为2018年6月25日，保藏单位的地址位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。解淀粉芽孢杆菌在生长代谢过程中能产蛋白酶和纤维素酶，还能产生对油茶炭疽病及其它作物病害具有显著抑制作用的挥发性化合物、粗蛋白和粗脂肽，是具有良好生物防治前景的微生物菌种。上述的解淀粉芽孢杆菌cfc-10(bacillusamyloliquefacienscfc-10)是从油茶炭疽发病区健康植株根际土壤样品中分离纯化获得，在na平板上，倒置30℃培养一段时间后，菌落形态呈乳白色，半透明，圆形，边缘不整齐，表面湿润光滑，显微镜观察细胞呈杆状，革兰氏染色为蓝紫色，阳性。上述的解淀粉芽孢杆菌cfc-10(bacillusamyloliquefacienscfc-10)可以产生抑菌类物质，包括抑菌类蛋白、脂肽类抗生物、寡肽酶、聚酮化合物等等，这些物质都具有很强的抑菌性。同时该菌株具有产吲哚乙酸、解磷和产氨能力，具有促进植物生长的潜力。cfc-10菌株能够在ph为4.0-8.5、温度范围为20℃-55℃的条件下生长，能够耐90℃温度，说明是一种耐受性很好、适应性很强的微生物菌株。上述的解淀粉芽孢杆菌cfc-10(bacillusamyloliquefacienscfc-10)的dna基因序列，见seqidno.1所示。上述的解淀粉芽孢杆菌cfc-10(bacillusamyloliquefacienscfc-10)，其16srdna序列在ncbi数据库中用blast进行同源性分析，得到相似性较高的序列，运用mega6.06软件构建系统发育树；该解淀粉芽孢杆菌cfc-10(bacillusamyloliquefacienscfc-10)的16srdna序列与解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)的同源性达到99％，因此将其鉴定为解淀粉芽孢杆菌。综合形态学观察、生理生化鉴定及16srdna序列分析结果，可以确定该解淀粉芽孢杆菌cfc-10为解淀粉芽孢杆菌种(bacillusamyloliquefaciens)，其被命名为解淀粉芽孢杆菌cfc-10。上述的解淀粉芽孢杆菌cfc-10(bacillusamyloliquefacienscfc-10)发酵液对拮抗油茶炭疽病原菌的抑菌圈达到了28.97mm，说明本发明提供的解淀粉芽孢杆菌cfc-10(bacillusamyloliquefacienscfc-10)对油茶炭疽病原菌菌具有明显的抑制作用，因而能够很好的应用于防治油茶炭疽病害。基于一个总的技术构思，本发明还相应提供一种上述的解淀粉芽孢杆菌菌株在防治油茶炭疽病害中的应用。上述的应用，优选的，所述应用的方法具体包括如下步骤：(1)将所述的解淀粉芽孢杆菌cfc-10接种至种子培养基中进行培养，得到的种子液接种至发酵培养基中进行发酵，得到解淀粉芽孢杆菌cfc-10发酵菌液；(2)在油茶炭疽病发病初期及之前，采用所述步骤(1)后得到的解淀粉芽孢杆菌cfc-10发酵菌液稀释后喷施于油茶树干。优选的，所述步骤(1)中，种子培养基的组分包括牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，所述牛肉膏、蛋白胨和氯化钠的质量比为(2.3-3.1):(8.5-10):(3.8-5.1)。优选的，所述步骤(1)中，发酵培养基的组分包括玉米粉、黄豆粉和cacl2，所述玉米粉、黄豆粉和cacl2的质量比为(10-20):(6-15):(1-3)。优选的，所述步骤(1)中，培养的温度为28-32℃，培养时间18-24h，种子培养基的ph在7.0-7.2。优选的，所述步骤(1)中，发酵的接种量为0.1％-5％，发酵温度25-45℃，发酵时间32-48h，发酵培养基的ph在7.0-8.0，摇床震荡的转速为150-250rpm。优选的，所述步骤(2)中，解淀粉芽孢杆菌cfc-10发酵菌液用水稀释，稀释后菌种浓度为108cfu/ml以上。优选的，所述步骤(2)中，喷施方法为以喷湿树干为度，至少喷施2次，每次喷施间隔8-10d。与现有技术相比，本发明的有益效果为：1、本发明提供的解淀粉芽孢杆菌菌株为解淀粉芽孢杆菌cfc-10，该菌株对油茶炭疽病原菌菌具有明显的抑制作用，能够很好的应用于防治油茶炭疽病害，该菌株还可以产生吲哚乙酸，具有解磷能力、产氨能力，具有促进植物生长的潜力；该菌株能够在ph为4.0-8.5、温度范围为20℃-55℃的条件下生长，能够耐90℃温度，是一种适应性很强的微生物菌株。2、本发明的应用，在油茶炭疽病发病初期及之前，采用解淀粉芽孢杆菌cfc-10发酵菌液稀释后喷施于油茶树干，能够很好的防治油茶炭疽病害，有效的解决了化学药剂的替代，降低了农药残留，保证了农产品的质量安全，具有一定的实用价值和推广应用价值。一株解淀粉芽孢杆菌菌株，其命名为解淀粉芽孢杆菌cfc-10(bacillusamyloliquefacienscfc-10)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称gdmcc)，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为gdmccno：60394，保藏时间为2018年6月25日，保藏单位的地址位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是实施例中解淀粉芽孢杆菌cfc-10的菌落形态图。图2是实施例中解淀粉芽孢杆菌cfc-10的革兰氏染色图。图3是实施例中解淀粉芽孢杆菌cfc-10的16srdna序列构建的系统发育树图。图4是实施例中解淀粉芽孢杆菌cfc-10对油茶炭疽病原菌的抑菌图。具体实施方式为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。实施例：本发明提供的一株解淀粉芽孢杆菌菌株，其命名为解淀粉芽孢杆菌cfc-10(bacillusamyloliquefacienscfc-10)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称gdmcc)，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为gdmccno：60394，保藏时间为2018年6月25日，保藏单位的地址位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。1、菌株的筛选s01：通过多点采样法采集油茶炭疽发病区健康植株根际土壤样品，并将采集到的土样研细；s02：将研细的土样放入装有无菌水的离心管中充分震荡，得到土壤悬浮液；s03：将所述土壤悬浮液梯度稀释，得到不同浓度的土壤悬浮液；s04：选取浓度为10-5、10-6和10-7的土壤悬浮液，并加入到na培养基平板上进行涂布处理，放到30℃的培养箱中培养，得到菌落；s05：挑选形态不一的单菌落进行划线保种，培养24小时，得到分离菌，将所述分离菌置于4℃的冰箱中保存备用；s06：用直径0.5cm的打孔器将油茶炭疽病原菌菌块接种于pda培养基平板中心，在距平板中央2.5cm十字交叉处等距离接种不同的芽孢杆菌，以不接种油茶炭疽菌种为对照，每处理3次重复；25℃培养，对照长满全皿时，记录具备抑菌能力的细菌，得到抑菌圈最大的菌种为解淀粉芽孢杆菌cfc-10。2、菌株的鉴定本发明对实施例提供的菌株进行了鉴定，该鉴定包括以下内容：1)形态学鉴定将本发明实施例提供的菌株划线到na培养基平板上，然后将平板倒转，在温度为30℃的条件下培养24h，观察并记录平板上菌落的生长情况。菌落形态图如图1所示，菌落呈不规则近圆形、边缘不整齐、乳白色、半透明、表面光滑湿润。进一步，用试剂盒对本发明实施例提供的菌株进行革兰氏染色并在油镜下观察菌株和对菌株进行拍照，该菌株的革兰氏染色如图2所示。经革兰氏染色后，本发明实施例提供的菌株为杆状，且呈紫色，为革兰氏阳性菌，芽孢染色有芽孢生成。2)生理生化鉴定接触酶实验：直接滴加3％的过氧化氢于菌株的液体培养物(24h)中，立即观察，有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性。菌株立即产生大量气泡，实验结果为阳性。氧化酶实验：取白色洁净滤纸一角于洁净培养皿中，蘸取试验菌菌落少许，滴加试剂(1％盐酸二甲基对苯二胺水溶液)一滴，阳性者立即呈粉红色，以后颜色逐渐加深。菌株变色，为阳性。淀粉水解实验：菌种点接至淀粉培养基上，30℃培养48h，滴加少量碘液于平板，轻轻旋转，使碘液均匀分布于平板，观察。菌落周围出现无色透明圈表明有水解淀粉的能力，反之，没有。菌株菌落周围有透明圈产生，能够水解淀粉，为阳性。甲基红mr实验：挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于30℃，3～5天，取培养液1ml，加甲基红指示剂1～2滴，阳性呈红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。菌液变黄色，为阴性。vp实验：挑取新纯培养物少许，接种于通用培养基，于30℃培养2d、培养液2.5ml先加入a-萘酚纯酒精溶液0.6ml，再加40％氢氧化钾水溶液0.2ml，摇动2～5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或30℃恒温箱，如2h内仍不显现红色，可判定为阴性。菌液立即变红，为阳性。明胶液化实验：取新纯培养物，穿刺接种于明胶高层约2/3深度，另有两支未接种的空白对照。20℃下培养3～5d。每天观察结果，若细菌生长且明胶部分或全部变为可流动的液体，则为试验阳性。否则为阴性。明胶被液化，为阳性。硝酸盐还原实验：将培养物接种于硝酸盐肉汤培养基，28℃摇床培养3d，取5ml培养液，按试剂盒(海博生物技术有限公司硝酸盐还原试剂盒)说明加入显色剂，变黄为阳性，不变色为阴性。菌液变黄，为阳性。产硫化氢实验：将待检菌穿刺接种于醋酸铅培养基，于35℃培养24～48h观察结果。培养基变黑为阳性，不变为阴性。培养基未变色，为阴性。柠檬酸盐利用实验：挑取菌苔在西蒙斯氏柠檬酸盐培养基斜面上划线接种，35℃培养3-7天。培养基为碱性(指示剂蓝色或桃红色)者为阳性，否则为阴性。培养基变蓝色，为阳性。卵磷脂酶活性实验：用75％乙醇将新鲜鸡蛋表面消毒，并用灭菌的镊子将鸡蛋打个孔，倾去蛋清，然后用无菌吸管吸出卵黄，加入到融化后冷却至50℃左右的培养基中，混匀后倒平板，点接菌种，30℃培养24-48h观察，菌落边缘出现浑浊不透明区者为酶阳性。菌落周围出现明显的浑浊不透明区，为阳性。丙二酸盐利用实验：挑取培养12h菌苔接种于丙二酸盐培养基，35℃培养培养24-48h，培养基由绿变蓝者为阳性，反之为阴性。培养基变蓝色，为阳性。葡萄糖发酵实验：挑取少量本菌株穿刺接种于葡萄糖氧化发酵培养基，在温度为30℃的条件下培养3d，观察培养基颜色的变化。若无颜色变化，则需要继续观察7d，培养基变黄者为发酵型。在此次实验中，培养基变黄，说明本菌株为阳性。纤维素分解实验：将待测菌株划线接种于添加0.8％纤维素粉的琼脂基础培养基上，以不接种的培养基作为空白对照，30℃培养1～2周，菌株能在培养基上生长，实验结果为阳性；反之为阴性。菌株能够缓慢生长，为阳性。半乳糖利用实验：将本菌株接种在半乳糖培养基中，在温度为30℃的条件下培养2d，观察菌落生长情况，若菌落形成，则可以利用半乳糖，反之，不行。在此次实验中，菌体生长，为阳性，说明本菌株可以利用半乳糖。阿拉伯糖利用实验：将本菌株接种于阿拉伯糖培养基中，在温度为30℃的条件下培养2d，观察菌落生长情况，若菌落形成，则可以利用阿拉伯糖，反之，不行。在此次实验中，菌体生长，为阳性，说明本菌株可以利用阿拉伯糖。甘露糖利用实验：将本菌株接种于甘露糖培养基中，在温度为30℃的条件下培养2d，观察菌落生长情况，若菌落形成，则可以利用甘露糖，反之，不行。在此次实验中，菌体生长，为阳性，本菌株可以利用甘露糖。d-果糖利用实验：将本菌株接种于d-果糖培养基中，在温度为30℃的条件下培养2d，观察菌落生长情况，若菌落形成，则可以利用d-果糖，反之，不行。在此次实验中，菌体生长，为阳性，本菌株可以利用d-果糖。d-木糖利用实验：将本菌株接种于d-木糖培养基中，在温度为30℃的条件下培养2d，观察菌落生长情况，若菌落形成，则可以利用d-木糖，反之，不行。在此次实验中，菌体不生长，为阴性，本菌株不可以利用d-木糖。14％nacl生长实验：将本菌株接种于含有14％的nacl的na液体培养基中，在温度为30℃的条件下培养2d，若发酵液变浑浊，则可以在14％nacl溶液中生存，若未变浑浊，则不可以。在实验中，发酵液变浑浊，为阳性，可以在14％nacl溶液中生存。产吲哚乙酸(iaa)试验：将待测菌株接种到添加0.5mmol/ll-色氨酸的tsb培养基中30℃摇床培养48h，取培养液2ml，10000r/min离心10min，取上清，每1ml上清液添加2mlsalkowski试剂，室温暗处静置30min，以空白培养基作为对照，如有粉色产生则说明有iaa产生。有粉色产生，产iaa，为阳性。产氨试验：将菌株接种到蛋白胨培养基中，30℃摇床培养3d，取培养液少许于试管中，滴加5滴纳氏试剂，以空白培养基作为对照，出现黄褐色沉淀为阳性，证明菌株具有产氨的能力。有黄褐色沉淀产生，具有产氨能力，为阳性。解磷试验：将菌株接种到添加2％琼脂的nbrip培养基上，30℃培养3d，菌落周围有无色透明圈出现者为阳性，证明该菌株具有解磷能力。菌株菌落周围有无色透明圈出现，为阳性。综上，生理生化鉴定结果如表1。表1本菌株的生理生化鉴定结果表性特征反应特征表性特征反应特征接触酶测定+柠檬酸盐利用+氧化酶测定+卵磷脂酶活性测定+淀粉水解测定+丙二酸盐利用+甲基红mr测定-纤维素分解+vp实验+半乳糖利用+明胶液化测定+阿拉伯糖利用+硝酸盐还原测定+甘露糖利用+葡萄糖发酵+d-果糖利用+产硫化氢测定-d-木糖利用-14％nacl生长+20℃生长+ph4生长+55℃生长+ph8.5生长+90℃耐温+产吲哚乙酸+解磷+产氨+其中，“+”表示为本菌株有反应或可以利用，“-”示为本菌株没有反应或不可以利用。表1试验结果，说明该菌株可以产生吲哚乙酸，具有解磷能力，产氨能力，这些促生特性试验结果说明菌株具有促进植物生长的潜力。cfc-10菌株能够在ph为4.0-8.5、温度范围为20℃-55℃的条件下生长，能够耐90℃温度，说明是一种耐受性很好、适应性很强的微生物菌株。此外，解淀粉芽孢杆菌cfc-10(bacillusamyloliquefacienscfc-10)可以产生抑菌类物质，包括抑菌类蛋白、脂肽类抗生物、寡肽酶、聚酮化合物等等，这些物质都具有很强的抑菌性。3)菌株的16srdna序列测定：本发明实施例采用康为世纪生物科技有限公司基因组提取试剂盒提取本菌株中的dna。其中，上述提取试剂盒包括50μl的pcr反应体系，而pcr反应体系包括25μl的2×mastermix；2.5μl的上游引物；2.5μl的下游引物；18μl的ddh2o；2μl的模板dna。pcr反应条件为：在温度为94℃预变性5min；94℃变性0.5min；53℃退火0.5min；72℃延伸1min；30个循环，72℃延伸5min，4℃保存。pcr产物结果由上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果如序列表seqidno.1所示。所得序列通过ncbi—blast进行序列比对分析，运用mega6.06软件构建系统发育树(如图3所示)，该解淀粉芽孢杆菌cfc-10(bacillusamyloliquefacienscfc-10)的16srdna序列与解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)的同源性达到99％。综合述形态学观察、生理生化鉴定及16srdna序列分析结果，可以确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌，其被命名为解淀粉芽孢杆菌cfc-10(bacillusamyloliquefacienscfc-10)。3.解淀粉芽孢杆菌cfc-10的效果将上述得到的解淀粉芽孢杆菌cfc-10(bacillusamyloliquefacienscfc-10)在以下条件下进行发酵：玉米粉10-20g/l，黄豆粉6-15g/l，cacl21-3g/l，25-45℃，150-250rpm，ph7.0-8.0，接种量1％-5％，5l酵罐发酵32-48h得到发酵菌液，实测芽孢浓度为(4.2±0.61)×1010cfu/ml。用对峙平板法检测上述的解淀粉芽孢杆菌cfc-10(bacillusamyloliquefacienscfc-10)发酵菌液的抑菌活性，如图4所示，对拮抗油茶炭疽病原菌的抑菌圈达到了28.27mm，说明本发明提供的解淀粉芽孢杆菌cfc-10(bacillusamyloliquefacienscfc-10)对油茶炭疽病原菌菌具有明显的抑制作用，因而能够很好的应用于防治油茶炭疽病害。4.解淀粉芽孢杆菌cfc-10在防治油茶炭疽病害中的应用1)培养基种子培养基：牛肉膏0.3g/l，蛋白胨1g/l，氯化钠0.5g/l；发酵培养基：玉米粉10-20g/l，黄豆粉6-15g/l，cacl21-3g/l。2)解淀粉芽孢杆菌cfc-10发酵菌液的制备挑取一环解淀粉芽孢杆菌cfc-10，接种至含有种子培养基的500ml锥形瓶中，ph在7.0-7.2，培养温度为30℃，培养时间24h；然后将得到的种子液全部接种至含有发酵培养基的5l发酵罐中，接种量0.1％-5％，ph在7.0-8.0，发酵温度25-45℃，摇床震荡的转速为150-250rpm，待发酵32-48h后得到解淀粉芽孢杆菌cfc-10发酵菌液。3)林间大田试验效果检测在油茶炭疽病发病初期进行，在3个试验点分别设置生防区、化学防治对照区和空白对照区3个处理，每个小区3株，小区间设置保护行。生防区采用解淀粉芽孢杆菌cfc-10菌悬液兑水稀释喷雾，化学防治对照区采用75％百菌清按500倍兑水稀释喷雾。以喷湿树干为度，共施药2次中间间隔10d。4)调查实施效果方法按油茶叶部病害调查的行业标准在第一次喷药前进行第一次调查，第二次喷药后十天进行第二次调查。病情指数分级标准如表2所示。调查时，以发病率进行调查统计，按照如下的公式计算病情指数和防治效果，结果如下表3。表2病情指数分级标准病级发病程度代表数值0级整株油茶新叶片上没有任何病斑出现01级新叶片上有病斑出现，发病叶片数小于整株新叶片的1/41.02级新叶片上有病斑出现，发病叶片数小于整株新叶片的1/4～1/22.03级新叶片上有病斑出现，发病叶片数小于整株新叶片的1/2～3/43.04级新叶片上有病斑出现，发病叶片数小于整株新叶片的3/44.0表3防治效果对比从表3数据可以得出，含有108cfu/ml细胞数的发酵菌液与对照药剂百菌清的防治效果达到了相同的防止标准，证明含量在108cfu/ml以上的菌种浓度都可以达到相同的效果。发酵菌液能够有效的解决了化学药剂的替代，降低了农药残留，保证了农产品的质量安全，具有一定的实用价值和推广应用价值。以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。序列表<110>中南林业科技大学，湖南省林业科学院<120>一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其在防治油茶炭疽病害中的应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1451<212>dna<213>解淀粉芽孢杆菌cfc-10(bacillusamyloliquefacienscfc-10)<400>1cgcagtgcgggtgctatacatgcagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgtt60agcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccggg120aaaccggggctaataccggatggttgtctgaaccgcatggttcagacataaaaggtggct180tcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctca240ccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacac300ggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgac360ggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaag420aacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggcta480actacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggc540gtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccgggga600gggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagc660ggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaa720ctgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacg780ccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgc840attaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggg900gcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccagg960tcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacagg1020tggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcg1080caacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgaca1140aaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacaca1200cgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaa1260tctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagta1320atcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcac1380accacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatggagccagccgccga1440agtga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