一种荧光探针及其制备和应用的制作方法

本发明涉及一种荧光探针及其制备和应用，特别是一种检测应用水中碱性l-氨基酸(l-精氨酸，l-组氨酸，l-赖氨酸)，l-苯丙氨酸及l-色氨酸用的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

氨基酸在生物体成长发育过程中发挥着极其重要的其作用：1.是人体组织的构成部分；2.构成人体内的各种物质；3.供给热量；4.免疫调节；5.作为体内重要的载体,起者运输的作用；6.氧化功能。氨基酸是蛋白质的基本组成物质,摄入氨基酸是人体获得氮源的唯一方式,人体吸收氨基酸后一部分被直接用来合成蛋白质，一部分被氧化分解,其中含氮部分用来合成其他必须氨基酸，一部分作为能量被分解掉,以尿素的形式排出体外。

因此对食物中氨基酸含量及其种类的检测显得尤为重要，而荧光探针是一种新型的检测试剂，由于其具有较高灵敏度、较低检测成本、样品处理简单、操作方便、测定快速以及实时检测的优点而备受人们的青睐。研究新型的检测水中l-氨基酸用的荧光探针及荧光探针检测方法很有必要。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种荧光探针及其制备和应用。本发明探针能对对水中碱性l-氨基酸(l-精氨酸，l-组氨酸，l-赖氨酸)，l-苯丙氨酸及l-色氨酸进行检测，一个探针检测多种氨基酸，能实现单探针对多种目标氨基酸的检测，检测成本低，检测效率高，且有利于对复杂微观系统的分析。此外使用本发明探针检测时，还具有较高灵敏度、样品处理简单、操作方便、测定快速以及实时检测的特点。

本发明的技术方案：一种荧光探针，所述探针的分子式为c48h48n32o16@c13h10ncl。

一种前述的荧光探针的制备方法，由八元瓜环(q[8])与吖啶盐酸盐制成。

前述的荧光探针的制备方法中，所述q[8]与吖啶盐酸盐的摩尔比为1：0.5-2。

前述的荧光探针的制备方法中，所述q[8]与吖啶盐酸盐的摩尔比为1：1。

前述的荧光探针的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)取q[8]，q[8]加水溶解，得溶液a，其浓度为1.0*10^-4mol/l；

(2)取吖啶盐酸盐，将吖啶盐酸盐加水溶解，得溶液b，其浓度为1.0*10^-3mol/l；

(3)将溶液a和溶液b按10：1比例混合，即摩尔比1：1，在常温下反应，调节其ph为4即可制得探针。

前述的荧光探针的制备方法中，所述步骤(1)和步骤(2)中加入的水是；ph＝7的二次水，用浓盐酸调节其ph＝4。

一种前述的荧光探针的应用，用于检测水中多种l-氨基酸。

前述的荧光探针的应用中，所述的用于检测水中多种l-氨基酸是；用于检测水中的碱性l-氨基酸、l-苯丙氨酸及l-色氨酸；所述的碱性l-氨基酸是l-精氨酸、l-组氨酸和l-赖氨酸。

前述的荧光探针的应用中，用于检测水中的碱性l-氨基酸、l-苯丙氨酸及l-色氨酸时，具体的检测方法是：

1)取荧光探针，加ph为4的水稀释成浓度为2.0*10^-5mol/l的溶液，得探针标准溶液；

2)向步骤1)制得的探针标准溶液中加入待检测水，放置10-20min，然后以固定激发波长346nm进行荧光发射光谱测定，并绘制激发出的该激光波长处的荧光强度的变化曲线；

3)根据步骤2)的曲线计算荧光探针溶液中加入待测水前后对应478nm下的荧光发射光谱强度变化值δf，即可对水中的碱性l-氨基酸(l-精氨酸，l-组氨酸，l-赖氨酸)，l-苯丙氨酸及l-色氨酸进行检测。

前述的荧光探针的应用中，所述步骤3)中，当加入待测水前后对应478nm下的荧光发射光谱强度发生变化或发生蓝移，则表明待检测水中含有碱性l-氨基酸(l-精氨酸，l-组氨酸，l-赖氨酸)，l-苯丙氨酸及l-色氨酸；当加入待测水前后对应478nm下的荧光发射光谱强不度发生变化或不发生蓝移，则表明待检测水中不含有碱性l-氨基酸(l-精氨酸，l-组氨酸，l-赖氨酸)，l-苯丙氨酸及l-色氨酸。

为验证本发明的有益效果，发明人进行了大量的实验研究，部分实验过程和结果如下：

实验例1探究q[8]与吖啶盐酸盐所形成探针的合适摩尔比

为了探究q[8]与吖啶盐酸盐所形成探针的合适摩尔比，采用紫外吸收光法谱和荧光光谱法对主客体之间的相互作用进行了考察。

摩尔比法测定各体系之间的紫外吸收光谱和荧光谱和荧光光谱数据，具体方法为：将g和q[8}分别配制成1.0mmol/l和0.1mmol/l的水溶液(ph＝4)备用，固定客体浓度为0.04mmol/l，改变q[8]的浓度，配置nq[8]/ng为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0，2.2，2.4，2.6，2.8，3.0的水溶液(ph＝4)，在室温下测定溶液的紫外-可见吸收光谱(实验数据为附图1a，1b)；固定客体浓度为0.02mmol/l，改变q[8]的浓度，配置nq[8]/ng为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0，2.2，2.4，2.6，2.8，3.0的水溶液，在激发波长为346nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为5nm，电压为540v的条件下测定溶液的荧光发射光谱(实验数据为附图2a，2b).随后采用等摩尔连续变化法(job法)测定体系之间的紫外吸收光谱和荧光谱，固定主客体的总浓度为4.0mmol/l不变，通过不断改变主客体之间的物质的量之比，配制出一系列不同摩尔比nq[8]/(nq[8]+ng)＝0.1,0.2······0.8,0.9的待测溶液，并按此方法，测定紫外吸收光谱和荧光谱(实验数据为附图1c，2c)。

实验例2定量分析

向本发明制得的浓度为2.0*10^-5mol/l的荧光探针标准溶液(按实施例1进行制备)中加入不同体积分数的含有l-phe的溶液进行检测，检测结果如图6所示，可以看出，加入不同体积分数后标准溶液中l-phe的浓度也不相同，不同浓度的l-phe可使荧光探针溶液发生不同程度的荧光增敏，而l-phe响应的线性范围为(1.0-30.0)*10^-5mol/l，检出限为2.108*10^-6mol/l。然后进行了探针标准溶液加入不同浓度含有l-phe的溶液时的核磁滴定实验(检测结果如附图8所示)，并由此推断出l-phe与探针的作用模式图如附图8插图所示。

向本发明制得的浓度为2.0*10^-5mol/l的荧光探针标准溶液(按实施例1进行制备)中加入不同体积分数的含有l-trp的溶液进行检测，检测结果如图7所示，可以看出，加入不同体积分数后标准溶液中l-trp的浓度也不相同，不同浓度的l-trp可使荧光探针溶液发生不同程度的荧光增敏，而l-trp响应的线性范围为(1.0-30.0)*10^-5mol/l，检出限为4.750*10^-6mol/l。然后进行了探针标准溶液加入不同浓度含有l-phe的溶液时的核磁滴定实验(检测结果如附图9所示)，并由此推断出l-trp与探针的作用模式图如附图9插图所示。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明的荧光探针能够同时对水中碱性l-氨基酸(l-精氨酸，l-组氨酸，l-赖氨酸)，l-苯丙氨酸及l-色氨酸同时进行检测，只要其中含有一种或多种氨基酸，均可检测出，具有检测范围广及特异性的优点。即一个探针检测多种氨基酸，能实现单探针对多种目标氨基酸的检测，检测成本低，检测效率高，且利于对复杂微观系统的分析。

2、本发明是通过利用q[8]与反吖啶盐酸盐形成超分子配合物，当检测到上述氨基酸时，碱性l-氨基酸(l-精氨酸，l-组氨酸，l-赖氨酸)会破坏探针探针酸碱环境从而使探针的荧光发生蓝移，苯丙氨酸及色氨酸破坏探针从而形成新的复合物，使探针的荧光又发生增敏作用，因此，可以简单、快速、灵敏的对水中的碱性l-氨基酸(l-精氨酸，l-组氨酸，l-赖氨酸)，l-苯丙氨酸及l-色氨酸进行检测。

3、本发明与传统的检测方法相比，其检测成本大大降低，并且操作也方便，可以实时检测。

因此，本发明探针能对对水中碱性l-氨基酸(l-精氨酸，l-组氨酸，l-赖氨酸)，l-苯丙氨酸及l-色氨酸进行检测，一个探针检测多种氨基酸，能实现单探针对多种目标氨基酸的检测，检测成本低，检测效率高，且有利于对复杂微观系统的分析。此外使用本发明探针检测时，还具有较高灵敏度、样品处理简单、操作方便、测定快速以及实时检测的特点。

附图说明：

图1为q[8]与吖啶盐酸盐摩尔比法(a)，(b)，job法(c)紫外；

图2为q[8]与吖啶盐酸盐摩尔比法(a)，(b)，job法(c)荧光；

图3为q[8]与吖啶盐酸盐核磁滴定及包结模式图；其中，(a)g；(b)g:q[8]＝1：0.17；(c)g:q[8]＝1：0.42；(d)g:q[8]＝1：0.69；(e)g:q[8]＝1：1.04；(f)q[8]；

图4为q[8]与吖啶盐酸盐包结所形成探针的质谱图；

图5为探针标准溶液加入含有不同l型氨基酸的溶液时的荧光光谱曲线；

图6为为探针标准溶液加入不同浓度含有l-phe的溶液时的荧光光谱曲线(a)，荧光强度(b)及检出限模拟图(c)；

图7为探针标准溶液加入不同浓度含有l-trp的溶液时的荧光光谱曲线(a)，荧光强度(b)及检出限模拟图(c)；

图8为探针标准溶液加入不同浓度含有l-phe的溶液时的核磁滴定图；其中，(a)g；(b)g:q[8]＝1：1；(c)g:q[8]:l-phe＝1：1：7.15；(d)g:q[8]:l-phe＝1：1:14.33；(e)g:q[8]:l-phe＝1：1：21.26；(f)g:q[8]:l-phe＝1：1：27.78；(g)l-phe；

图9为探针标准溶液加入不同浓度含有l-trp的溶液时的核磁滴定图；其中，(a)g；(b)g:q[8]＝1：1；(c)g:q[8]:l-trp＝1：1：0.7；(d)g:q[8]:l-trp＝1：1：1.75(e)g:q[8]:l-trp＝1：1：3.97；(f)g:q[8]:l-trp＝1：1：5.88；(g)g:q[8]:l-trp＝1：1：7.63；(h)g:q[8]:l-trp＝1：1：10.68；(i)g:q[8]:l-trp＝1：1：17.01；(d)l-trp。

具体实施方式

实施例1：

一种检测水中多种氨基酸用的荧光探针，所述探针的分子式为c48h48n32o16@c13h10ncl，所述探针的探针模式图如附图3插图，所述探针由q[8]与吖啶盐酸盐按摩尔比1：1制成。

上述检测水中多种l-氨基酸用的荧光探针的制备方法，步骤如下：

1)取q[8]，将q[8]加ph＝7的二次水溶解，得溶液a，其浓度为1.0*10^-4mol/l；

2)吖啶盐酸盐，吖啶盐酸盐ph＝7的二次水溶解，得溶液b，其浓度为1.0*10^-3mol/l；

3)将溶液a和溶液b按10：1比例混合(即摩尔比1：1)，此结果由q[8]与吖啶盐酸盐紫外，荧光的摩尔比，job实验，质谱实验，以及q[8]与吖啶盐酸盐的核磁滴定得出(实验结果如附图1，附图2，附图3和附图4)，在常温下反应，用浓盐酸调节其ph为4即可制得探针。

上述荧光探针检测水中碱性l-氨基酸(l-精氨酸，l-组氨酸，l-赖氨酸)，l-苯丙氨酸及l-色氨酸的方法如下：

1)取所述探针，加用ph为4的水稀释，制取浓度为2.0*10^-5mol/l的探针标准溶液；

2)向步骤1)制得的探针标准溶液中加入待检测水，放置15min，然后以固定激发波长346nm进行荧光发射光谱测定，并绘制激发出的该激光波长处的荧光强度的变化曲线；

3)根据步骤2)的曲线计算荧光探针溶液中加入待测水前后对应478nm下的荧光发射光谱强度变化值δf，当加入待测水前后对应478nm下的荧光发射光谱强度发生明显蓝移时，则表明待检测水中含碱性l-氨基酸(l-精氨酸，l-组氨酸，l-赖氨酸)；当加入待测水前后对应478nm下的荧光发射光谱强度明显增强时，则表明待检测水中含有l-苯丙氨酸及l-色氨酸。当加入待测水前后对478nm下的荧光发射光谱强度不发生以上两种情况时，则表明待检测水中不含碱性l-氨基酸(l-精氨酸，l-组氨酸，l-赖氨酸)，l-苯丙氨酸及l-色氨酸。检测结果如附图5所示。

实施例2：

一种检测水中多种氨基酸用的荧光探针，由q[8]与吖啶盐酸盐按摩尔比1：0.5制成。

上述检测水中多种l-氨基酸用的荧光探针的制备方法，步骤如下：

1)取q[8]，将q[8]加ph＝7的二次水溶解，得溶液a，其浓度为1.0*10^-4mol/l；

2)吖啶盐酸盐，吖啶盐酸盐ph＝7的二次水溶解，得溶液b，其浓度为1.0*10^-3mol/l；

3)将溶液a和溶液b按10：1比例混合(即摩尔比1：1)，此结果由q[8]与吖啶盐酸盐紫外，荧光的摩尔比，job实验，质谱实验，以及q[8]与吖啶盐酸盐的核磁滴定得出(实验结果如附图1，附图2，附图3和附图4)，在常温下反应，用浓盐酸调节其ph为4即可制得探针。

上述荧光探针检测水中碱性l-氨基酸(l-精氨酸，l-组氨酸，l-赖氨酸)，l-苯丙氨酸及l-色氨酸的方法如下：

1)取所述探针，加用ph为4的水稀释，制取浓度为2.0*10^-5mol/l的探针标准溶液；

2)向步骤1)制得的探针标准溶液中加入待检测水，放置15min，然后以固定激发波长346nm进行荧光发射光谱测定，并绘制激发出的该激光波长处的荧光强度的变化曲线；

3)根据步骤2)的曲线计算荧光探针溶液中加入待测水前后对应478nm下的荧光发射光谱强度变化值δf，当加入待测水前后对应478nm下的荧光发射光谱强度发生明显蓝移时，则表明待检测水中含碱性l-氨基酸(l-精氨酸，l-组氨酸，l-赖氨酸)；当加入待测水前后对应478nm下的荧光发射光谱强度明显增强时，则表明待检测水中含有苯丙氨酸及色氨酸。当加入待测水前后对应478nm下的荧光发射光谱强度不发生以上两种情况时，则表明待检测水中不含碱性l-氨基酸(l-精氨酸，l-组氨酸，l-赖氨酸)，l-苯丙氨酸及l-色氨酸。

实施例3：

一种检测水中多种金属离子用的荧光探针，由q[8]与吖啶盐酸盐按摩尔比1：2制成。

上述检测水中多种l-氨基酸用的荧光探针的制备方法，步骤如下：

1)取q[8]，将q[8]加ph＝7的二次水溶解，得溶液a，其浓度为1.0*10^-4mol/l；

2)吖啶盐酸盐，吖啶盐酸盐ph＝7的二次水溶解，得溶液b，其浓度为1.0*10^-3mol/l；

3)将溶液a和溶液b按10：1比例混合(即摩尔比1：1)，此结果由q[8]与吖啶盐酸盐紫外，荧光的摩尔比，job实验，质谱实验，以及q[8]与吖啶盐酸盐的核磁滴定得出(实验结果如附图1，附图2，附图3和附图4)，在常温下反应，用浓盐酸调节其ph为4即可制得探针。

上述荧光探针检测水中碱性l-氨基酸(l-精氨酸，l-组氨酸，l-赖氨酸)，l-苯丙氨酸及l-色氨酸的方法如下：

1)取所述探针，加用ph为4的水稀释，制取浓度为2.0*10^-5mol/l的探针标准溶液；

2)向步骤1)制得的探针标准溶液中加入待检测水，放置15min，然后以固定激发波长346nm进行荧光发射光谱测定，并绘制激发出的该激光波长处的荧光强度的变化曲线；

3)根据步骤2)的曲线计算荧光探针溶液中加入待测水前后对应478nm下的荧光发射光谱强度变化值δf，当加入待测水前后对应478nm下的荧光发射光谱强度发生明显蓝移时，则表明待检测水中含碱性l-氨基酸(l-精氨酸，l-组氨酸，l-赖氨酸)；当加入待测水前后对应478nm下的荧光发射光谱强度明显增强时，则表明待检测水中含有l-苯丙氨酸及l-色氨酸。当加入待测水前后对应478nm下的荧光发射光谱强度不发生以上两种情况时，则表明待检测水中不含碱性l-氨基酸(l-精氨酸，l-组氨酸，l-赖氨酸)，l-苯丙氨酸及l-色氨酸。