一种基于实时荧光PCR检测短短芽孢杆菌的引物和探针、试剂及其试剂盒与方法与流程

本发明公开涉及实时荧光pcr检测的技术领域，尤其涉及一种基于实时荧光pcr检测短短芽孢杆菌的引物和探针、试剂及其试剂盒与方法。

背景技术：

随着人类对环境生态的保护意识日益提高，环境污染降解菌剂在环境保护、污水净化等方面的应用越来越广。目前，国内外应用于检测环境污染降解菌剂菌种技术主要有三种：形态学生理生化方法、pcr特异性扩增法、基因序列测定比对法，在实际检测中应用最多的是形态学生理生化方法和pcr特异性扩增法，pcr特异扩增法又有普通定性pcr、实时荧光pcr、巢式pcr等。

近年来，我国每年从美国、日本等地进口环保微生物菌剂达二十万余吨，用于生物防控，随着我国环保意识的增强，进口量将逐年增多，需求量将越来越大，为了增加进口环保微生物菌剂的质量安全，保护我国自然环境不受外来菌种的破坏，需要尽快建立环境污染降解菌剂中短短芽孢杆菌的检验方法。

技术实现要素：

鉴于此，本发明公开提供了一种基于实时荧光pcr检测短短芽孢杆菌的引物和探针、试剂及其试剂盒与方法，以弥补我国在环境污染降解菌剂中短短芽孢杆菌的检测空白。

本发明一方面提供了一种基于实时荧光pcr检测短短芽孢杆菌的引物和探针，所述引物包括上游引物p1以及下游引物p2；

所述上游引物p1具有seqno.1序列；

所述下游引物p2具有seqno.2序列；

所述探针具有seqno.3序列。

优选，所述探针的5'端用报告荧光染料fam标记，所述探针的3'端用淬灭荧光染料tamra标记。

本发明还提供了一种基于实时荧光pcr检测短短芽孢杆菌的试剂，所述试剂中含有上述的引物和探针。

本发明同时还提供了一种基于实时荧光pcr检测短短芽孢杆菌的试剂盒，所述试剂盒中含有上述的引物和探针或含有上述的试剂。

优选，所述试剂盒还含有dna聚合酶反应液、空白对照品、阳性对照品以及阴性对照品。

本发明另一方面还提供了一种检测短短芽孢杆菌的实时荧光pcr方法，所述方法采用上述引物和探针或上述试剂或上述试剂盒，具体步骤如下：

——提取待测样品基因组dna；

——以所提取得dna为模板，加入引物、探针以及dna聚合酶反应液进行实时荧光pcr反应，其中，反应条件为：94℃15min，循环1次；94℃3s，59℃32s，循环40次，记录样品反应ct值；

——在样品检测的同时，设置空白对照、阴性对照以及阳性对照，其中，空白对照以ddh20为模板，按照上述条件进行实时荧光pcr反应，检测ct值大于或等于40；阴性对照以非短短芽孢杆菌物种基因组dna为模板，按按照上述条件进行实时荧光pcr反应，检测ct值大于或等于40；阳性对照以短短芽孢杆菌基因组dna或目的基因质粒片段为模板，按照上述条件进行实时荧光pcr反应，检测ct值小于或等于35；

——若待测样品短短芽孢杆菌基因检测ct值大于或等于40，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该待测样品未检出短短芽孢杆菌基因；若待测样品短短芽孢杆菌基因检测ct值小于或等于35，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该待测样品检出短短芽孢杆菌基因；若待测样品短短芽孢杆菌基因检测ct值在35～40之间，重做实时荧光pcr扩增，再次扩增后结果ct值大于40且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该待测样品未检出短短芽孢杆菌基因，再次扩增后结果ct值仍小于40且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该检测样品检出短短芽孢杆菌基因。

本发明提供的基于实时荧光pcr检测短短芽孢杆菌的引物和探针，具有良好的灵敏性和特异性，通过实时荧光pcr方法可以定性分析环境污染降解菌剂中是否含有短短芽孢杆菌，发挥了实时荧光pcr检测技术中结果的可靠性高、灵敏度好、特异性强、操作简单快捷等优点，进一步完善了环境污染降解菌剂检测体系，加大对国际技术贸易壁垒的保护力度。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施方案中检测短短芽孢杆菌阳性样品的荧光pcr扩增图；

图2为本发明实施方案中样品检测的荧光pcr扩增图；

图3、图4为本发明实施方案中关于灵敏性和重复性的荧光pcr扩增图；

图5为本发明实施方案中关于特异性的荧光pcr扩增图。

具体实施方式

下面以具体的案例对本发明进行进一步解释，但并不用于限制本发明的保护范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用产品均为市购。

下面结合具体的实施例对本发明的检测过程进行进一步的详细说明，具体如下：

1、引物以及探针设计

选择短短芽孢杆菌dna(genbankaf424046.1)作为靶序列，通过primerexplorev4在线设计软件分别设计并合成实时荧光pcr特异性扩增引物和探针，具体如下：

实时荧光pcr引物包括上游引物p1和下游引物p2以及探针，其中，

上游引物p1：gcgccgcaacttttgatt(seqno.1)；

下游引物p2：cacaattccccgtttttcgt(seqno.2)；

探针：ctcaggcgtttaatagg(seqno.3)，且该探针的5'端用报告荧光染料fam标记，3'端用淬灭荧光染料tamra标记。

2、样品dna的提取与纯化

将短短芽孢杆菌增菌的营养肉汤2ml加到2ml无菌离心管中，10000r/min离心2min，尽量弃净上清，沉淀加入te缓冲液570μl重悬，然后加入10mg/ml溶菌酶100μl，37℃温育30min，再加入10％sds30μl，65℃温育10min，加入等体积的酚混匀，12000r/min离心10min，取上清移入一新离心管中，重复一次，两次酚抽提后取上清加等体积的酚/氯仿(1:1体积比)混匀，12000r/min离心10min，取上清再移入一新离心管中，加等体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/l乙酸钠，轻缓颠倒混匀，12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用500μl75％乙醇洗两次，离心管开盖室温放置数分钟使乙醇挥发，加入100μl无菌水，-20℃保存以待检测。也可使用等效的商业化的dna提取试剂盒并按其说明提取制备模板dna。

3、建立实时荧光pcr扩增反应体系

2×realmastermix12.5μl、正向引物(10pmol/μl)1μl、反向引物(10pmol/μl)1μl、探针(5pmol/μl)1μl、dna模板50ng、50×roxreferencedye*30.25μl、ddh2o补充至25μl。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。

4、实时荧光pcr扩增反应

按照仪器操作要求选择相应的荧光通道，设置扩增反应条件94℃15min，循环1次；94℃3s，59℃32s，循环40次，记录样品反应的ct值。

5、确定质量控制指标

空白对照以ddh20为模板，按照3和4所述条件，进行实时荧光pcr反应，检测ct值大于或等于40；

阴性对照以非短短芽孢杆菌基因组dna为模板，按照3和4所述条件，进行实时荧光pcr反应，检测ct值大于或等于40；

阳性对照以短短芽孢杆菌基因组dna为模板，按照3和4所述条件，进行实时荧光pcr反应，检测ct值小于或等于35。

6、结果判定

待测样品的ct值大于或等于40，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品未检出短短芽孢杆菌基因；

待测样品短短芽孢杆菌基因检测ct值小于或等于35，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，判定该样品检出短短芽孢杆菌基因；

待测样品短短芽孢杆菌基因检测ct值在35～40之间，重做实时荧光pcr扩增，再次扩增后结果ct值大于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品未检出短短芽孢杆菌基因；再次扩增后结果ct值仍小于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品检出短短芽孢杆菌基因。

7、样本检测以及结果验证

将环境污染降解菌剂短短芽孢杆菌样品提取dna后，按照上述检测过程进行实时荧光pcr检测。经检测，含有短短芽孢杆菌的环境污染降解菌剂的扩增结果呈阳性，而阴性对照、空白对照的扩增结果均显示为无扩增现象，具体见图1。

入境环保微生物菌剂30批，其中短短芽孢杆菌微生物菌剂产品3批，采用本发明建立的检测方法进行形态学和实时荧光pcr检测，以短短芽孢杆菌cicc21889为对照，检测结果与实际样品成分相符，具体请见图2，其中，a-样品1为sb3187(306g)[621d8981]、b-样品2为sb3100(823d8480)、c-样品3为sb3187(306g)[551d8891]、d－短短芽孢杆菌cicc21889。

8、灵敏性和重复性检测

将提取短短芽孢杆菌基因组dna的稀释至110ng/反应、11ng/反应、1.1ng/反应、0.11ng/反应、0.011ng/反应，每个稀释度重复8次，验证短短芽孢杆菌检测引物和探针的灵敏性，检测结果如图3所示。

由图3可见，实时pcr检测短短芽孢杆菌基因组dna的灵敏度可以达到>0.011ng/反应。模板浓度为0.011ng/反应时，扩增ct值为35，由以上结果我们可以判定，当ct值≤35时，可以判定为检出短短芽孢杆菌；当ct值≥40时，可以判定为未检出短短芽孢杆菌；当35≤ct值≤40时，建议重新进行检测再判定。

对短短芽孢杆菌菌液依据gb4789.2-2016进行系列稀释并进行平板计数，对稀释液进行提取基因组dna，按照本发明的反应体系进行扩增，通过测算菌量cfu/ml，确定反应体系的灵敏度。

将短短芽孢杆菌菌液稀释，提取其稀释液基因组dna，每个稀释度重复8次，验证短短芽孢杆菌检测引物和探针的灵敏性，检测结果如图4所示。

由图4可见，实时pcr检测短短芽孢杆菌基因组dna的灵敏度可以达到>46cfu/ml反应。模板浓度为46cfu/ml时，扩增ct值为35，由以上结果我们可以判定，当ct值≤35时，可以判定为检出短短芽孢杆菌；当ct值≥40时，可以判定为未检出短短芽孢杆菌；当35≤ct值≤40时，建议重新进行检测再判定。

9、特异性检测

采用短短芽孢杆菌检测引物和探针，选取短短芽孢杆菌(3株)、马红球菌等40种菌种dna样品作为模板，验证短短芽孢杆菌检测引物和探针的特异性，并验证上述43种样品dna提取的质量，检测结果如图5所示，其中，a-样品1为：sb3187(306g)[621d8981]、b-样品2为：sb3100(823d8480)、c-样品为：sb3187(306g)[551d8891]、d－短短芽孢杆菌cicc21889。

由图5可见，只有短短芽孢杆菌得到了扩增，而所有其他40种样品和阴性对照均没有检测到荧光信号，因此本发明中短短芽孢杆菌检测引物和探针特异性强，适合于对短短芽孢杆菌的检测。

综上本实施方案提供的检测用引物、探针、试剂以及试剂盒具有良好的灵敏性和特异性，操作简单快速，检测结果准确可靠，为短短芽孢杆菌的鉴别检测提供了一种简便、有效、准确的检测方法，进一步完善了环境污染降解菌剂检测体系，加大对国际技术贸易壁垒的保护力度。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由面的权利要求指出。

应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。

序列表

<110>沈阳出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心

<120>一种基于实时荧光pcr检测短短芽孢杆菌的引物和探针、试剂及其试剂盒与方法

<130>2018

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

gcgccgcaacttttgatt18

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>2

cacaattccccgtttttcgt20

<210>3

<211>17

<212>dna

<213>人工序列()

<400>3

ctcaggcgtttaatagg17