狗尾草U6启动子基因及应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，涉及植物转基因
技术领域：
，具体涉及狗尾草u6启动子基因的克隆和应用。
背景技术：
：狗尾草(setariaviridis)是谷子(setariaitalica)的野生近缘种，属单子叶植物纲禾本科黍亚科，黍亚科常分布在热带和亚热带地区，高粱、甘蔗、玉米、谷子、薏苡、黄茅、白茅等都属于黍亚科，该科植物具有热带植物的典型特征。是研究c4光合作用的优秀模型，同时也是研究单子叶植物、非生物胁迫耐受性和能源植物的模型。它具有许多适于遗传分析的特性，如二倍体、有相对较小的基因组(～510mb)、身材矮小、生长周期短和种子量大等。目前狗尾草作为新型模式植物的研究在国内外越来越热门，但还没有人克隆并应用狗尾草本身的u6启动子开展转基因技术研究。u6启动子是二型启动子，与真核生物rna聚合酶iii结合后，负责转录u6rna，这类启动子的特点是几乎所有启动子元件(除了+1位的转录起点)都位于转录起始位点的上游，也即它对转录起点后的序列无特殊选择或要求，能保证转录序列的结构特征。u6启动子+1位是鸟苷酸。rna聚合酶iii启动子识别的终止信号是连续4-5个胸苷酸，转录产物末端一般有4个尿苷酸。几乎所有的真核生物都具有u6启动子，u6启动子在真核生物体内一般发现是启动小片段，不带polya尾的序列，由rna聚合酶iii聚合u6启动子转录产生shrna，经剪切后产生成熟sirna，产生干扰效果；shrna的表达量取决于启动子的强弱，与同类的rna聚合酶iii的启动子h1相比，u6启动子启动能力更强，表达时间也长。目前，在转基因
技术领域：
，u6启动子多用在构建rnai表达载体上，用于启动干扰发夹结构的表达；此外，随着基因编辑技术的兴起，u6启动子也被开始广泛用于crispr/cas9系统中sgrna引导序列的启动表达，以保证引导序列的结构特征。u6启动子具有种属特异性，在转基因技术中，使用转化物种本身或接近物种的u6启动子能取得更高的的启动效率。前人研究表明，人u6启动子有几个明显的特点：1、具有tatabox，位于-30～-25bp，被poliii转录；2、在转录起点上游-66～-47bp处存在pse(proximalsequenceelement)，该元件是snrna激活因子蛋白复合物的结合位点；3、在-244～-214存在dse(distalsequenceelement)；4、启动子下游存在5'-tttt-3'序列为poliii提供转录终止信号；5、pse和dse之间的距离变化可显著影响转录效率；6、+1位的g对转录效率影响较大。根据这些特点，在使用u6启动子构建rnai表达载体时，u6启动子的长度最好在300bp左右，尽量不改变pse和dse的间距，同时保留tatabox和+1位的g，在下游应有5'-ttttt-3'序列作为终止信号。另外可以根据需要在启动子上游或终止信号下游设计测序引物序列、酶切位点等等。技术实现要素：本发明的目的是提供了狗尾草u6启动子基因，克隆了2个狗尾草u6启动子，并将这2个启动子与gus基因融合表达转化狗尾草胚性愈伤，通过瞬时表达验证了2个启动子能够在狗尾草上高效表达，为狗尾草及相近植物的转化研究提供了高效的启动子序列。为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供狗尾草u6启动子基因，包括2种狗尾草u6启动子基因，分别具有序列表中seqidno:1、seqidno:2所示的核苷酸序列。该2种启动子基因序列还包括含有如seqidno.1、seqidno.2所示基因序列的其它序列。启动子序列分别来自于狗尾草chr_02、chr_04染色体。本发明的另一目的在于提供狗尾草u6启动子基因在转基因
技术领域：
中的应用。本发明利用snrna序列在真核生物体内非常保守的序列特征，用拟南芥atu6启动子的snrna序列与狗尾草的基因组(setariaviridisv1.1)序列进行比对，通过比对序列结果设计多对引物，pcr克隆出狗尾草的2个u6启动子，并构建与gus基因融合表达载体转化狗尾草胚性愈伤，gus染色瞬时表达验证表明，克隆出的2个狗尾草u6启动子在狗尾草上具有很强的启动效率，能在狗尾草上很好的启动gus基因的表达。狗尾草是新型的模式植物，对植物生物技术的研究越来越重要，狗尾草u6启动子的克隆和应用，必将推进这些植物相关
技术领域：
的研究，具有重要的现实意义。附图说明图1：狗尾草u6基因与拟南芥u6基因的盒式位置比对图；图2：狗尾草u6启动子退火温度50～55℃时的pcr结果图(注：每对引物从左到右退火温度从55℃到50℃)；图3：狗尾草u6启动子退火温度55～60℃时的pcr结果(注：每对引物从左到右退火温度从60℃到55℃)；图4：从狗尾草q、s序列上pcr出构建gus融合表达载体具有粘性末端的2个u6启动子序列图；图5：是用于转化的pzmubi-gus(zmubis-hph)质粒载体图；图6：是用于转化的pseu6q-gus(seu6q-hph)质粒载体图；图7：是用于转化的pseu6s-gus(seu6s-hph)质粒载体图；图8：狗尾草胚性愈伤gus基因瞬时表达情况图。ubi是对照载体pzmubi-gus(zmubis-hph)载体，s是pseu6s-gus(seu6s-hph)载体，q是pseu6q-gus(seu6q-hph)载体，ck是不经转化的愈伤，为空白对照。图9：pzmubi-gus(zmubis-hph)、pseu6q-gus(seu6q-hph)、pseu6s-gus(seu6s-hph)载体转化狗尾草胚性愈伤后不同启动子gus瞬时表达差异性分析。q是pseu6q-gus(seu6q-hph)载体染色情况，s是pseu6s-gus(seu6s-hph)载体染色情况，ubi是pzmubi-gus(zmubis-hph)载体染色情况，从分析可知，以农杆菌agl1进行转化，q、s与对照ubi启动子启动能力差异不显著。具体实施方式1、利用u6启动子snrna序列的保守性，在https://phytozome.jgi.doe.gov网站上，利用拟南芥atu6启动子的snrna序列(gtcccttcggggacatccgataaaattggaacgatacagagaagattagcatggcccctgcgcaaggatgacacgcataaatcgagaaatggtccaaatttt)与狗尾草的基因组(setariaviridisv1.1)序列进行比对(blast)。检查比对结果，从中挑选出序列同源性大于95％的位置(chr_02、chr_04、chr_06、chr_08、chr_09)，下载这些位置的序列信息，并在http://seqtool.sdsc.edu/cgi/bw.cgi#！网站上对挑选出的序列进行boxshade(盒式)序列分析比对，找到这些启动序列的use位置和tata框位置(图1)。2、狗尾草u6启动子的pcr克隆：在下载的u6启动序列use和tata框位置前寻找和设计引物，引物设计参考http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/网站，尽量选择能区别克隆目标启动序列的引物对。然后以狗尾草a10品系dna为模版，pcr克隆目标启动序列，pcr后跑胶观察，回收通过pcr克隆出的目标条带进行测序比对。克隆启动子序列的位置、引物对及序列大小(见表1)。pcr试剂购于bbi生命科学有限公司，反应条件：95℃5min，94℃30s，退火设计50～55℃和55～60℃两个温度梯度45s，72℃1min32循环，72℃5min，4℃保存。最后能克隆出启动子序列，测序后符合预期启动序列的启动子序列分别位于chr_02、chr_04染色体上(图2、3)，分别命名为q、s，q最佳反应温度为60℃，s最佳反应温度为53℃。表1从狗尾草a10品系克隆u6启动子的pcr引物注：reverse代表正向序列，forward代表反向序列。3、狗尾草u6启动子与gus基因融合植物表达载体构建：以带gus基因的pzmubi-gus(zmubis-hph)质粒(见图4)为骨架质粒(hygr植物筛选基因，kanr菌落筛选基因)，质粒由美国donalddanforthplantsciencecenter的thomasp.brutnell实验室提供；以表1克隆的setaria02_r(q)和setaria04-r(s)u6启动子序列为模版，设计带骨架质粒gus基因启动子粘性末端的引物对(见表2)pcr克隆目标启动子序列(图4)，通过酶切连接将质粒gus基因前的zmubi启动子替换为克隆的狗尾草u6启动子，构建狗尾草u6启动子与gus基因融合植物表达载体。融合植物表达载体通过dna测序检测目标启动序列构建情况。pcr使用东盛生物的hstmmix，反应条件：94℃3min，94℃30s，50℃30s，72℃1min，34循环，72℃5min，4℃保存。表2从etaria02_reverse(q)和setaria04-reverseu6(s)启动子克隆产物pcr目标启动子序列到gus基因融合植物表达载体上的引物对4、狗尾草u6启动子农杆菌转化验证：将对照质粒pzmubi-gus(zmubis-hph)(图5)，狗尾草u6启动子与gus基因融合植物表达载体pseu6q-gus(seu6q-hph)(图6)，pseu6s-gus(seu6s-hph)(图7)，转化到农杆菌agl1菌株，以狗尾草成熟种子诱导的胚性愈伤为转化外植体材料，进行农杆菌转化，共培养5天后取出胚性愈伤进行gus染色观察，从gus基因的gus染色表达情况评估克隆的u6启动子的启动能力和表达活性。gus染色液按照常规方法配制x-gluc母液和x-gluc基液，然后按比例混合后储存于4℃冰箱备用，取用于检测的组织块，加入gus染色液中37℃过夜染色，倒掉染色液，70％酒精脱色1～3次，95％的酒精脱色1～2次，观察gus染色情况(见图8)。最后收集胚性愈伤在体视显微镜下观察拍照。同时，取同等重量的每种愈伤gus染液的蓝色上清液在620nm波长(蓝色上清液的最大吸收波长)处测定光吸收值(见表3)。数据、图标处理在excel2010下进行，通过sigmaplot10.0软件对数据进行统计分析、差异显著性检验和相关性分析。从分析结果可知，以农杆菌agl1进行转化，目标载体启动子q、s与对照ubi启动子启动能力差异不显著(图9)。表3pzmubi-gus(zmubis-hph)、pseu6q-gus(seu6q-hph)、pseu6s-gus(seu6s-hph)载体转化番木瓜胚性愈伤后gus瞬时表达染色液od620测定重复1重复2重复3平均值ubi2.0752.3362.3762.262q2.0872.1132.3502.183s1.9962.3722.5302.299备注：q是pseu6q-gus(seu6q-hph)载体染色情况，s是pseu6s-gus(seu6s-hph)以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。序列表<110>中国热带农业科学院热带生物技术研究所<120>狗尾草u6启动子基因及应用<160>2<210>1<211>414<212>dna<213>狗尾草（setariaviridis）的u6启动子基因序列<400>1cccgtggtctacaagaatctgaatgcaaaacatgccatatctctgacacggattgaattc60acgtagtgattggtctgttctatcgtgtctgaactccccattcatgaatgaaattgttaa120agtttttctacttacagtctgtgtgcatcaaagaaagatttcacgtactttatttgcgct180ttggaaagcatgatcgcgtagttgcaaaaaatccctcgcagaaaagaaaaaaaaagccac240ggagaagtacgggccatggcccaatacgaagtaccgcgcagcccatgtctatcggtgggg300atgggagaactggcgggctcaacgacgcggggcaacaagccgaagaattagtcccacctc360ggctgctcacaaagcgaaagcacagcttataaaccgaggcgctagcaccgggtt414<210>2<211>204<212>dna<213>狗尾草（setariaviridis）的u6启动子基因序列<400>2gcccacatcccacatgactccgccgaaccgggccgttgagggagaatcggcccacgtgct60ggcttccgctgggcctcccgtgcgctgcgggtctgcgggtgtggggagttgggacgagaa120caacaggctcggaagtttagtaccacatcgccagattagtagcgcgtagaccagcttata180tacgcggagctccaccctcgttct204当前第1页12