耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌及其用途的制作方法

本发明属于酿酒微生物技术领域，具体涉及一种耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌及其用途。

背景技术：

浓香型白酒是我国传统白酒中的典型代表之一，在世界范围内产生了广泛的影响，占有举足轻重的地位。现有的高通量测序研究表明，在浓香型白酒酒醅发酵中后期，细菌菌群中有90％以上为耐酸乳杆菌，这主要是因为耐酸乳杆菌能够耐受高乙醇浓度、高酸度、低含氧量等条件。而浓香型白酒发酵中后期是乳酸、乙酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯等风味物质形成的重要阶段，所以，作为优势菌的耐酸乳杆菌是形成这些风味物质的重要菌株，耐酸乳杆菌对白酒的风味具有重大贡献。因此，对耐酸乳杆菌的分离鉴定以了解其特性就显得非常重要。但在浓香型白酒中，关于耐酸乳杆菌的报道主要是dna序列信息方面，还没有关于分离鉴定获得耐酸乳杆菌菌株的相关报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题为：浓香型白酒发酵后期乙醇含量高，需要分离耐受乙醇浓度更高的菌株来适应的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌。其保藏编号为cgmccno.16507。保藏时间为2018年9月20日，保藏地点为中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

其中，上述耐酸乳杆菌的16srdna序列具有如seqidno：1所示的核苷酸序列。

seqidno:1耐酸乳杆菌的16srdna核苷酸序列

ttcgggtatgaagttagggaagcgagcggcggatgggtgagtaacacgtgggtaacctaccctatagtctgggataccacttggaaacaggtgctaataccggataaaaggagagatcacatgatttctttttgaaaggcggcgtaagctgtcgctaaaggatggacccgcggtgcattagctagttggtaaggtaacggcttaccaaggcaacgatgcatagccgagttgagagactgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttggtgaagaaagatagtgagagtaactgctcattatttgccggtaatcaaccagaaagtcacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggaaagataagtcagatgtgaaagccctcggcttaaccgaggaatagcatcggaaactgtctttcttgagtgcagaagaggagagtggaactccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctctctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagatacctggtagtccatgctgtaaacgatgagtgctaagtgttgggaggtttccgcctctcagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatctagtgccaacctaagagattaggcgttcccttcggggacactaagacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattattagttgccagcattaagttgggcactctaatgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgggcagtacaacgaggagcgaacttgtgaaggcaagcgaatctctgaaagctgttctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaatg。

其中，上述耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌的乙醇耐受浓度为≤15％，温度耐受为≤45℃，产乳酸能力为≤17.5g/l。

本发明所述的耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌的细胞学特征为：菌体为杆状，菌落呈乳白色，圆形，表明光滑湿润、凸起、边缘整齐。

本发明所述的耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌的生物学特征为：能利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、龙胆二糖、土伦糖、塔格糖、核糖醇、甘露醇、山梨醇、肌醇、n-乙酰葡萄糖胺、柠檬酸铁、苦杏仁苷、熊果苷、水杨苷或葡萄糖酸钾的至少一种。不能利用阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、乳糖、蜜二糖、棉子糖、来苏糖、岩藻糖、丙三醇、赤藻糖醇、卫矛醇、木糖醇、阿拉伯醇、甲基-β-d-吡喃木糖苷、甲基-α-d-吡喃甘露糖苷、甲基-α-d-吡喃葡萄糖苷、菊粉、淀粉、糖原、2-酮基葡萄糖酸钾和5-酮基葡萄糖酸钾。

本发明还提供了一种上述耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌在酿酒中的用途。

本发明的有益效果为：本发明首次分离鉴定了一株耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌，该耐酸乳杆菌能耐受15％的乙醇，耐受45℃高温，产乳酸能力达到17.5g/l，是一株新型的耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌。本发明为有效提高乙醇耐受、高温耐受，提高产乙醇能力提供了新的宝贵的菌种资源，具有很高的应用价值。

本发明提供的耐酸乳杆菌于2018年9月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，保藏号为cgmccno.16507，生物学分类命名为耐酸乳杆菌lactobacillusacetotolerans。

附图说明

图1所示为本发明耐酸乳杆菌菌株形态图；

图2所示为耐酸乳杆菌的16srdna系统发育树图；

图3所示为耐酸乳杆菌和模式菌株耐乙醇能力图；

图4所示为耐酸乳杆菌和模式菌株耐受温度图；

图5所示为耐酸乳杆菌和模式菌株耐受盐度图；

图6所示为耐酸乳杆菌和模式菌株耐受ph图。

具体实施方式

本发明提供了一种耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌，其保藏编号为cgmccno.16507。保藏时间为2018年9月20日，保藏地点为中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

本发明所述的耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌的乙醇耐受浓度为≤15％，温度耐受为≤45℃，产乳酸能力为≤17.5g/l。

本发明的菌株是从宜宾五粮液股份有限公司酒醅中分离获得。

本发明的耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌能耐受15％的乙醇，耐受45℃高温，产乳酸能力达到17.5g/l，是一株新型的耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌。本发明为有效提高乙醇耐受、高温耐受，提高产乙醇能力提供了新的宝贵的菌种资源，具有很高的应用价值。

下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明使用的培养基mrs组成包括：酪蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、酵母膏5g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠5g/l、柠檬酸铵2g/l、磷酸氢二钾2g/l、硫酸镁0.1g/l、硫酸锰0.05g/l，吐温801g/l，ph自然。

斜面和平板培养基为相应mrs培养基中加入2％的琼脂粉。

实施例1耐酸乳杆菌lactobacillusacetotoleransr3的分离和鉴定

1、菌株的分离

发酵糟醅取自宜宾五粮液股份有限公司酿酒车间。取10g出窖的酒醅于90ml无菌生理盐水中，振荡混匀后取上清液进行梯度稀释，取10^-2-10^-5稀释液涂布于含溴甲酚绿的mrs平板上，37℃厌氧下培养7天，挑选平板上的菌落进行划线后培养，重复三次，直至分离获得纯化的菌株，斜面保存。菌株命名为r3。

2、菌株的形态学特征

分离得到的r3菌株为革兰氏阳性菌，短杆状，在mrs培养基上菌落为乳白色、表面湿润光滑、边缘整齐、中间凸起。

3、生理生化特性

分离得到的r3菌株能利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、龙胆二糖、土伦糖、塔格糖、核糖醇、甘露醇、山梨醇、肌醇、n-乙酰葡萄糖胺、柠檬酸铁、苦杏仁苷、熊果苷、水杨苷或葡萄糖酸钾中的至少一种。不能利用阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、乳糖、蜜二糖、棉子糖、来苏糖、岩藻糖、丙三醇、赤藻糖醇、卫矛醇、木糖醇、阿拉伯醇、甲基-β-d-吡喃木糖苷、甲基-α-d-吡喃甘露糖苷、甲基-α-d-吡喃葡萄糖苷、菊粉、淀粉、糖原、2-酮基葡萄糖酸钾和5-酮基葡萄糖酸钾。

4、16srdna鉴定

将菌株r3接种于mrs培养基中，37℃厌氧下培养7天，取1ml菌液，离心收集菌体，用细菌基因组提取试剂盒提取基因组dna，-20℃保藏备用。

利用引物27f和1492r对细菌基因组16srdna进行扩增，27f：agtttgatcmtggctcag(seqidno:2)，1492r：ggttaccttgttacgactt(seqidno:3)。

扩增体系(共25μl)：10×pcrbuffer2.5μl，dntp(2.5mmol/leach)1μl，dna10ng，引物f(10μmol/l)0.5μl，引物r(10μmol/l)0.5μl，加双蒸水至25μl。扩增程序:：94℃4min；94℃45s，55℃45s，72℃60s，共30个循环；72℃10min，4℃终止反应。

16srdna序列测定：利用胶回收试剂盒进行pcr扩增产物的纯化；纯化产物的测序工作由上海生工生物有限公司完成，测定结果得到菌株r3的16srdna序列如seqidno:1所示。

系统发育树构建：将所测定的细菌16srdna基因序列分别与genbank数据库进行blastn和rdpclassifier相似性分析，选取与实验菌株亲缘关系相对较近的标准菌株用clustalw软件进行序列比对，采用mega5软件进行系统发育分析，构建系统发育树，如图2所示。

综合菌体形态、生理生化特性和16srdna基因序列，将菌株r3鉴定为耐酸乳杆菌(lactobacillusacetotolerans)。该菌株r3于2018年9月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmccno.16507。

实施例2耐酸乳杆菌r3的产乳酸能力试验

采用高效液相色谱法检测耐酸乳杆菌r3的产乳酸能力。

将菌株r3接种于液体mrs培养基中活化，培养到对数生长期od600＝1.8，按照体积比5％的接种量接种到100ml液体mrs培养基，37℃厌氧盒培养7天。采用hplc测定乳酸含量。

前处理：取发酵液0.1ml，以0.1％的磷酸水溶液稀释至1ml，于2ml离心管中，振荡均匀，0.2μm滤膜过滤后作为待测样品。

hplc条件：柱温30℃。流动相：a：甲醇；b：0.1％的磷酸水溶液。梯度洗脱：0min：100b；8min：100b；25min：10b；28.5min：10b；29min：100b；35min：100b；停止：35min；流速：1.0ml/min。乳酸标准曲线：标准曲线为：y＝0.284x-3.0446，r²＝0.9999。

实验结果为：乳酸含量为17.5g/l。

实施例3耐酸乳杆菌r3的耐乙醇能力试验

将菌株lactobacillusacetotoleransr3和模式菌株lactobacillusacetotoleranscicc10720均接种于液体mrs培养基中活化，培养到对数生长期od600＝1.8，按照体积比5％的接种量均接种到含不同浓度乙醇(2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、15％和16％)的100ml液体mrs培养基，37℃厌氧下培养7天。利用紫外/可见光分光光度计(eppendorfbiospectrometer)测定吸光度od600。计算培养后与前的od600差值，结果如图3所示。

由图3可知，菌株lactobacillusacetotoleransr3在乙醇浓度为15％的mrs培养基中培养后其od600差值为1.15，而当乙醇浓度为16％时，其od600差值几乎为0，表明基本不生长。因此lactobacillusacetotoleransr3的乙醇耐受能力为15％。相比模式菌株lactobacillusacetotoleranscicc10720的乙醇耐受能力为12％，菌株lactobacillusacetotoleransr3的耐乙醇能力增强。

实施例4耐酸乳杆菌r3的耐温度能力试验

将菌株lactobacillusacetotoleransr3和模式菌株lactobacillusacetotoleranscicc10720均接种于液体mrs培养基中活化，培养到对数生长期od600＝1.8，按照体积比5％的接种量均接种到100ml液体mrs培养基，分别放置在不同温度(30、35、40、45、50和55℃)的培养箱中厌氧下培养7天。利用紫外/可见光分光光度计(eppendorfbiospectrometer)测定吸光度od600。计算培养后与前的od600差值，结果如图4所示。

由图4可知，菌株lactobacillusacetotoleransr3在45℃培养后其od600差值为1.41，而当温度为50℃时，其od600差值几乎为0，表明基本不生长。因此菌株lactobacillusacetotoleransr3的温度耐受能力为45℃。相比模式菌株lactobacillusacetotoleranscicc10720的乙醇耐受能力为40℃，耐高温能力增强。

实施例5耐酸乳杆菌r3的耐盐能力

将菌株lactobacillusacetotoleransr3和模式菌株lactobacillusacetotoleranscicc10720均接种于液体mrs培养基中活化，培养到对数生长期od600＝1.8，按照体积比5％的接种量均接种到含不同nacl(2％、4％、6％、8％、9％和10％)的100ml液体mrs培养基，37℃厌氧盒培养7天。利用紫外/可见光分光光度计(eppendorfbiospectrometer)测定吸光度od600。计算培养后与前的od600差值，结果如图5所示。

由图5可知，菌株lactobacillusacetotoleransr3在nacl为8％的mrs培养基中培养后其od600差值为1.38，而当乙醇浓度为9％时，其od600差值负，表明不生长。因此菌株lactobacillusacetotoleransr3的nacl耐受能力为8％。相比模式菌株lactobacillusacetotoleranscicc10720的nacl耐受能力为4％，耐盐能力增强。

实施例6耐酸乳杆菌r3的耐酸能力

将菌株lactobacillusacetotoleransr3和模式菌株lactobacillusacetotoleranscicc10720均接种于液体mrs培养基中活化，培养到对数生长期od600＝1.8，按照体积比5％的接种量均接种到含不同ph(7、6、5、4、3、2和1.8)的100ml液体mrs培养基，用盐酸调节ph，在37℃厌氧盒培养7天。利用紫外/可见光分光光度计(eppendorfbiospectrometer)测定吸光度od600。计算培养后与前的od600差值，结果如图6所示。

由图6可知，菌株lactobacillusacetotoleransr3在ph为2的mrs培养基中培养后其od600差值为0.50，而当乙醇浓度为1.8时，其od600差值负，表明不生长。因此，菌株lactobacillusacetotoleransr3的ph耐受能力为2。模式菌株lactobacillusacetotoleranscicc10720的ph耐受能力也为2。本发明的菌株r3与现有的耐酸乳杆菌耐ph能力相当。

序列表

<110>宜宾五粮液股份有限公司

<120>耐乙醇、耐高温及高产乳酸的耐酸乳杆菌及其用途

<130>a181256k

<141>2018-11-27

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<211>1369

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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aaagccctcggcttaaccgaggaatagcatcggaaactgtctttcttgagtgcagaagag600

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