一种携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体及其构建方法与流程

本发明涉及一种携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体及其构建方法，属于基因工程领域。

背景技术：

病毒的侵染性克隆是指具有侵染性的cdna或者通过体外转录获得的具有侵染性的rna。病毒侵染性克隆的获得使得rna病毒能够在dna水平上应用基因工程手段研究病毒各基因功能及病毒致病机制，而侵染性克隆中报告基因的插入和共表达，可以更为直观的观察和记录病毒的侵染过程，推进病毒致病相关研究的进行。目前，绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，gfp)就常被用作报告基因。gfp是于1962年在维多利亚多管发光水母中发现的一个发光蛋白，由238个氨基酸组成。而增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，egfp）是在野生型gfp的基础上将第64位氨基酸进行突变而成（苯丙氨酸突变成亮氨酸），其发射出的荧光强度比gfp大六倍以上，灵敏度更高。由于gfp发光稳定，且gfp基因的表达没有物种、细胞专一性，在发光过程中不需依赖辅助因子或其他基质而发光，对细胞的光毒性非常弱，它非常适合在病毒学领域中用作活体报告基因，其作用是其它酶类报告蛋白无法比拟的。

南瓜花叶病毒(squashmosaicvirus，sqmv)属于豇豆花叶病毒属的成员，能够侵染甜瓜、南瓜、西瓜、黄瓜等葫芦科作物，可通过机械方法、种子和介体昆虫进行传播。由于该病毒的种传率较高，且该病毒的侵染可以引起植株叶片花叶、皱缩，开花果实期时病害更为严重，对葫芦科作物的种植生产造成了极大的威胁。目前，该病毒侵染性克隆已成功获得，该病毒可以利用反向遗传学手段研究其致病和种传相关机制，推进该病毒病害防控相关工作。另外，该病毒为单链正义rna病毒，含有rna1和rna2两条链，其中，rna1基因组全长约为5.8kb，rna2基因组全长3.3kb。rna2基因组全长较短，且编码移动蛋白、大外壳蛋白和小外壳蛋白，在egfp报告基因的插入和表达方面，该基因组更适合分子操作，在病毒致病和种传相关研究工作中具有重要意义。

技术实现要素：

本发明提供了一种携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体及其构建方法，构建了携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体，为研究该病毒的侵染过程、揭示该病毒的种传机制提供了新的方法和手段，解决了上述问题。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体，其保藏号为cgmccno.13940，分类命名为：南瓜花叶病毒，于2018年11月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，详细地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明也提供了一种携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体的构建方法，包括以下步骤：

（1）以侵染性克隆psqmv-rna2的序列为基础，设计含有mp、lcp部分序列的多克隆位点，并进行基因合成，其序列如下：

mp-mcs-lcp：5＇ggtagaaccaaggcttatggtcaaaatgagttggacttggcccagttaagtctcgacgacacatcaagcttgagaggtagcgtcgaccccggggtcgacggagcaggacgtacgaaagcatacggacaaaatgaactagatcttgcgcaactttcc-3＇，seqidno.1；

（2）以（1）、增强型绿色荧光蛋白报告基因（egfp）和侵染性克隆psqmv-rna2的序列为基础，设计三对引物，其序列如下：

s2-1557-f：5＇ggtagaaccaaggcttatgg-3＇，seqidno.2；

s2-1557-r：5＇ccataagccttggttctacc-3＇，seqidno.3；

s2-1607-f：5＇ctagatcttgcgcaactttcc-3＇，seqidno.4；

s2-1607-r：5＇ggaaagttgcgcaagatctag-3＇，seqidno.5；

egfp-f：5＇gcttgagaggtagcgtcgacatggtgagcaagggcgag-3＇，seqidno.6；

egfp-r：5＇gtacgtcctgctccgtcgaccttgtacagctcgtccatgc-3＇，seqidno.7；

（3）以侵染性克隆psqmv-rna2为模板，利用引物s2-1607-f/s2-1557-r进行扩增，获得长度为7990bp的片段，以mp-mcs-lcp为模板，利用引物s2-1557-f/s2-1607-r进行扩增，获得长度为110bp的片段，利用同源重组方式将这两个片段进行连接，并将其转入大肠杆菌中，获得psqmv-rna2-mcs；

（4）以pcambia3301-egfp为模板，利用引物egfp-f/egfp-r进行扩增，获得长度为757bp的片段，利用同源重组方式将该片段与经sali单酶切处理的psqmv-rna2-mcs进行连接，并将其转入大肠杆菌中，获得psqmv-rna2-egfp，即为保藏号为cgmccno.13940的携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体。

进一步本发明的一种优选方案为：将所述的重组载体psqmv-rna2-egfp采用液氮冻融法导入农杆菌菌株gv3101。

本发明的有益效果：

（1）本发明涉及的南瓜花叶病毒重组载体通过接种可产生携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒，经该病毒侵染的植株在紫外灯下可产生绿色荧光，可以用于观察病毒能否侵染及侵染能力强弱分析，辅助寄主的抗性研究及病毒的弱毒株筛选工作，辅助该病毒防控工作；

（2）本发明所获得的携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒可用于研究病毒的侵染过程，揭示其种传机制，辅助该病毒致病机制研究；

（3）本发明所使用的方法可对重组载体中的增强型绿色荧光蛋白报告基因进行替换，用于表达其他外源基因或多肽，为获得大量的目的蛋白特供新的工具。

附图说明

图1携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体的构建策略；

图2接种10天后甜瓜叶片在自然光和紫外灯下所观察到的症状图；

图3发病叶片rt-pcr及酶切检测结果。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体，其保藏号为cgmccno.13940，分类命名为：南瓜花叶病毒，于2018年11月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，详细地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

一种携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体的构建方法，包括以下步骤：

（1）以侵染性克隆psqmv-rna2的序列为基础，设计含有mp、lcp部分序列的多克隆位点（图1），并进行基因合成，其序列如下：

mp-mcs-lcp：5＇ggtagaaccaaggcttatggtcaaaatgagttggacttggcccagttaagtctcgacgacacatcaagcttgagaggtagcgtcgaccccggggtcgacggagcaggacgtacgaaagcatacggacaaaatgaactagatcttgcgcaactttcc-3＇，seqidno.1；

（2）以（1）增强型绿色荧光蛋白报告基因（egfp）和侵染性克隆psqmv-rna2的序列为基础，设计三对引物，其序列如下：

s2-1557-f：5＇ggtagaaccaaggcttatgg-3＇，seqidno.2；

s2-1557-r：5＇ccataagccttggttctacc-3＇，seqidno.3；

s2-1607-f：5＇ctagatcttgcgcaactttcc-3＇，seqidno.4；

s2-1607-r：5＇ggaaagttgcgcaagatctag-3＇，seqidno.5；

egfp-f：5＇gcttgagaggtagcgtcgacatggtgagcaagggcgag-3＇，seqidno.6；

egfp-r：5＇gtacgtcctgctccgtcgaccttgtacagctcgtccatgc-3＇，seqidno.7；

（3）含有多克隆位点的南瓜花叶病毒重组载体的构建

a)以侵染性克隆psqmv-rna2的质粒为模板，利用引物s2-1607-f/s2-1557-r进行全长扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用axygen胶回收试剂盒（axygen）进行回收，获得产物h1。其中，pcr扩增体系为：10μl2×q5hotstartmix，1μl上游引物(10mm)，1μl下游引物(10mm)，1μlpsqmv-rna2的质粒；最后用ddh2o补足至20μl。反应程序为：98℃30s；98℃10s，60℃20s，72℃3min，35cycles；72℃2min。

b)以含有mp-mcs-lcp的克隆载体质粒为模板，利用引物s2-1557-f/s2-1607-r进行扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用axygen胶回收试剂盒（axygen）进行回收，获得产物h2。其中，pcr扩增体系为：10μl2×q5hotstartmix，1μl上游引物(10mm)，1μl下游引物(10mm)，1μl含有mp-mcs-lcp的克隆载体质粒；最后用ddh2o补足至20μl。反应程序为：98℃30s；98℃10s，60℃20s，72℃10s，35cycles；72℃2min。

c)利用nebuilderhifidnaassemblycloningkit（neb）将a)和b)中所获得的两个片段进行连接，并将其转入大肠杆菌中，获得psqmv-rna2-mcs（图1）。其中，同源重组体系为：5μlnebuilderhifidnaassemblymastermix，2.5μl产物h1，2.5μl产物h2；总体积共10μl，将体系混匀，置于50℃，孵育15min即可。

（4）携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体的构建

a)以pcambia3301-egfp的质粒为模板，利用引物egfp-f/egfp-r进行扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用axygen胶回收试剂盒（axygen）进行回收，获得产物egfp。其中，pcr扩增体系为：10μl2×q5hotstartmix，1μl上游引物(10mm)，1μl下游引物(10mm)，1μlpcambia3301-egfp质粒；最后用ddh2o补足至20μl。反应程序为：98℃30s；98℃10s，60℃20s，72℃30s，35cycles；72℃2min。

b)以psqmv-rna2-mcs的质粒为模板，利用限制性内切酶sali-hf（newengland）进行酶切处理。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用axygen胶回收试剂盒（axygen）进行回收，获得产物psqmv-rna2-mcs。其中，酶切体系为：2μlcutsmart，1μlsali-hf，5μlpsqmv-rna2-mcs质粒，最后用ddh2o补足至20μl；将体系混匀，置于37℃，孵育1h即可。

c)利用nebuilderhifidnaassemblycloningkit（neb）将a)和b)中所获得的两个片段进行连接，并将其转入大肠杆菌中，获得psqmv-rna2-egfp（图1），即为保藏号为cgmccno.13940的南瓜花叶病毒重组载体。其中，同源重组体系为：5μlnebuilderhifidnaassemblymastermix，1μl产物egfp，4μl产物psqmv-rna2-mcs；总体积共10μl，将体系混匀，置于50℃，孵育15min即可。

（5）重组载体的转化

取5μlpsqmv-rna2-egfp载体质粒，加入到50μl的gv3101感受态细胞中，轻轻混匀，置于冰上静置10min，经液氮速冻5min、37℃温浴5min后，置于冰上静置2min，加500μl不加抗生素的lb液体培养基，置于28℃、200rpm条件下的摇床中复苏培养2h，经12,000g离心1min，收集菌体后，将其涂布在lb固体培养基（50ng/μlkan、50ng/μlrif）上。将平板置于28℃培养箱中恒温培养48h后挑取单胞、进行培养，经pcr检测后筛选获得阳性克隆。

（6）重组载体接种实验

将含有psqmv-rna1、psqmv-rna2和psqmv-rna2-egfp的农杆菌菌液分别转至lb液体培养基（50ng/μlkan、50ng/μlrif）中扩大培养过夜，经6,000g离心6min收集菌体，用接种缓冲液（10mmmgcl2、10mmmes和100μmas）将菌体进行悬浮，室温静置2h以上。在接种前，将psqmv-rna1分别与psqmv-rna2和psqmv-rna2-egfp两种菌液按1:1比例进行混合、摇匀，用1ml注射器从甜瓜子叶叶背进行注射接种，接种后将其置于28℃/25℃、16h/8h（光照/黑暗）条件下继续培养。

（7）侵染性检测和荧光观察

在接种7天至10天后，接种植株新叶开始出现花叶症状，未接种植株无花叶症状的产生（图2）。将各植株置于手持式紫外灯下进行观察，发现接种psqmv-rna2-egfp的植株上部叶片有绿色荧光的产生，而未接种植株和接种psqmv-rna2的植株叶片均未观察到绿色荧光的产生（图2）。利用引物rna2-1557f/rna2-2362r（5＇-gttgcctttatgtaaggagaactc-3＇，seqidno.8；）进行rt-pcr检测，发现接种psqmv-rna2和psqmv-rna2-egfp均有目的片段的扩增，长度分别约为800bp、1600bp；将扩增产物进一步经酶切处理检测，结果显示经sali酶切处理后，接种psqmv-rna2-egfp的植株所对应的扩增产物可被分成约700bp和800bp两个片段，而接种psqmv-rna2的植株所对应的扩增产物无变化，与预期一致，说明egfp成功转录和表达（图3）。另外，将发病叶片汁液经摩擦方式接种健康的甜瓜植株，接种7天后，植株产生花叶症状，且接种psqmv-rna2-egfp的植株在手持式紫外灯下仍可产生荧光。由上可知，南瓜花叶病毒重组载体经接种后可产生绿色荧光标记的南瓜花叶病毒，且病毒后代可以进行传播，说明携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体构建成功。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国农业科学院果树研究所

<120>一种携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体及其构建方法

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>126

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggagaaccaaggcaggcaaaagagggacggcccagaagccgacgacacacaagcgagagg60

agcgcgaccccggggcgacggagcaggacgacgaaagcaacggacaaaagaacagacgcg120

caaccc126

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggtagaaccaaggcttatgg20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ccataagccttggttctacc20

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ctagatcttgcgcaactttcc21

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ggaaagttgcgcaagatctag21

<210>6

<211>38

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

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<210>7

<211>40

<212>dna

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<400>7

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<210>8

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gttgcctttatgtaaggagaactc24