赤眼鳟β-肌动蛋白基因cDNA全长序列、扩增引物及扩增方法与流程

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种赤眼鳟β-肌动蛋白基因cdna全长克隆的方法。

背景技术：

肌动蛋白广泛存在于真核生物中,是构成细胞骨架和肌小节的主要成分，几乎参与了真核细胞所有的生理过程，如维持细胞结构、细胞运动、细胞分裂等。根据等电点的不同，肌动蛋白可分为α、β、γ三种类型。

β-肌动蛋白基因具有mrna的表达数量高，数量稳定的特点，在测定某种mrna的表达量时，常采用β-肌动蛋白mrna作为参照。β-肌动蛋白基因的启动子为强启动子，对于提高转基因表达量具有显著效果，且其表达不受组织的限制，这两大优点使得β-肌动蛋白基因启动子在转基因动物的研究中发挥着重要的作用。国内外对鳜鱼、黄鳝等物种的β-肌动蛋白的研究表明，β-肌动蛋白基因氨基酸编码区高度保守，各种生物间氨基酸序列的同源性高达70％以上。

赤眼鳟(squaliobarbuscurriculus)属硬骨鱼纲、鲤形目、鲤科、雅罗鱼亚科、赤眼鳟属,俗称野草鱼、红眼鱼。具有生长快、适应性强、商品鱼售价高等优点,其肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富,深受消费者青睐,是江河主要优质经济鱼类之一,也是淡水养殖的热门种类。目前国内没有对赤眼鳟β-肌动蛋白基因cdna的克隆和序列分析进行研究。

技术实现要素：

本发明通过rt-pcr技术和race法，从赤眼鳟肝脏中克隆获得了赤眼鳟β-肌动蛋白基因cdna全长序列，并利用软件对其进行氨基酸理化性质分析、信号肽预测、一级、二级、三级结构预测和同源性分析，为进一步研究该基因的结构和功能奠定基础，同时也为赤眼鳟其他功能基因的研究提供可靠的分子内标。

本发明的方面，公开了一种赤眼鳟β-肌动蛋白cdna基因序列的扩增方法，其特征在于，从赤眼鳟肝脏中抽提总rna，合成5′-race-readycdna和3′-race-readycdna，合成基因核心片段扩增所需cdna第一链，根据已知鱼类的β-肌动蛋白核苷酸序列设计保守区域rt-pcr扩增引物，根据克隆得到的赤眼鳟β-肌动蛋白的cdna核心片段设计两个5’-race下游引物，和两个3’-race上游引物。

进一步的，所述赤眼鳟肝脏的采集步骤包括解剖采集赤眼鳟肝脏，剪成100mg左右大小分装样品管中，液氮速冻，-70℃保存备用。

进一步的，所述从赤眼鳟肝脏中抽提总rna的步骤包括将研钵置于烤箱中180℃烘烤3-4小时然后冷却至室温再用液氮预冷，剪取液氮中保存的肝脏约100mg，加液氮研磨成粉末，反复研磨三次后加入总rna提取液并匀浆；将匀浆液转移至depc处理离心管，12000r/min4℃离心10min，保留上清液，弃沉淀，上清室温放置5分后，加氯仿1ml，上下颠倒混匀15秒，室温放置5-10min，12000r/min4℃离心15min；此时离心管内分为三层，将最上层上清液移至新离心管，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10min，12000r/min4℃离心10min；离心后弃上清，加入1mldepc水配制的75％的乙醇，悬浮沉淀，7500r/min4℃离心5min反复一次以彻底清洗；彻底去除乙醇，沉淀在室温下干燥30min左右，加20-30μlfree-rnase的灭菌去离子水，55℃水浴溶解；再进行rna浓度和纯度的检测。

进一步的，所述已知鱼类的β-肌动蛋白核苷酸序列设计保守区域pcr扩增引物为act01f:5’-tggcatcacaccttctacaacga-3’，act02r:5’-ccttcatagaggcaaataagtttcgg-3’，

以上述合成的基因片段扩增所需cdna第一链为模板，分别以act01f，act02r为引物扩增赤眼鳟肝脏β-肌动蛋白基因cdna核心片段，用taqdna聚合酶(takara)进行pcr扩增。

进一步的，所述扩增条件为：94℃预变性5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸5min。

进一步的，所述两个5’-race下游引物分别为

mlact5’03r:5’-gattacgccaagcttacattgccgtcaccttcaccgttccagt-3’；

mlact5’04r：5’-gattacgccaagcttaggccaggatggaacctccgatccag-3’。

进一步的，所述5’-race首轮扩增用mlact5’03r引物和试剂盒自带通用引物10*universalprimeramix(upm)对上述合成5′-race-readycdna进行扩增，下游引物的touchdownpcr反应条件为：94℃预变性5min，随之94℃1min，70℃1min，72℃1min，5个循环，94℃1min，68℃1min，72℃1min，5个循环，94℃1min，65℃1min，72℃1min，25个循环，最后72℃延伸5min。取以上首次扩增产物1μl为模板，用试剂盒提供的nesteduniversalprimer(nup)引物，和mlact5’04r引物进行二次pcr扩增，扩增条件为：94℃预变性5min，94℃1min，57℃1min，72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸5min，获得基因cdna5′端序列。

进一步的，所述已克隆得到的赤眼鳟β-肌动蛋白的cdna核心片段序列设计两个3’-race上游引物为

mlact3’01f:5’-gattacgccaagcttagatcacatccctggcccctagcacaa-3’；

mlact3’02f：5’-gattacgccaagctttccatcctggcctccctgtccacctt-3’。

进一步的，所述两个3’-race上游引物的第一轮pcr用mlact3’01f和试剂盒提供的10*universalprimeramix(upm)，反应体系和反应条件同5’-race第一轮pcr。巢式第二轮pcr以第一轮扩增产物为模板，所用引物为mlact3’02f和试剂盒提供的nesteduniversalprimer(nup)引物，pcr反应体系和条件同5’-race第二轮pcr，获得基因cdna3′端序列。

进一步的，所述赤眼鳟β-肌动蛋白基因cdna序列全长为1816bp，开放阅读框(95-1222)1128bp，编码375个氨基酸，翻译起始密码子atg，序列终止密码子taa，终止密码子之后有加尾信号“aataaa”。

附图说明

图1signalp3.0预测结果

图2赤眼鳟β-肌动蛋白跨膜结构预测结果

图3tmhmm预测β-肌动蛋白跨膜结构结果

图4dnaman预测赤眼鳟β-肌动蛋白二级结构

图5swiss-model预测赤眼鳟β-肌动蛋白同源三级结构模型

图6不同物种β-肌动蛋白氨基酸序列同源性比较

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以下结合具体的实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1赤眼鳟β-肌动蛋白基因cdna全长序列结构与分析

1.实验材料与方法

1.1实验动物与样品采集

1龄健康赤眼鳟采自湖南浏阳市乌龙渔场殖场。麻醉剂麻醉后解剖采集赤眼鳟肝脏，剪成100mg左右大小分装样品管中，液氮速冻，-70℃保存备用。

1.2方法

1.2.1赤眼鳟肝脏总rna抽提

将研钵置于烤箱中180℃烘烤3-4小时然后冷却至室温再用液氮预冷，剪取液氮中保存的肝脏约100mg，加液氮研磨成粉末，反复研磨三次后加入总rna提取液1mltrizol并匀浆；将匀浆液转移至1.5ml的depc处理离心管，12000r/min4℃离心10min，保留上清液，弃沉淀。上清室温放置5分min后，加氯仿1ml，上下颠倒混匀15sec，室温放置5-10min，12000r/min4℃离心15min；此时离心管内分为三层，将最上层上清液移至新离心管，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10min，12000r/min4℃离心10min；离心后弃上清，加入1mldepc水配制的75％的乙醇，悬浮沉淀，7500r/min4℃离心5min反复一次以彻底清洗；彻底去除乙醇，沉淀在室温下干燥30min左右，加20-30μlfree-rnase的灭菌去离子水，55℃水浴溶解；再进行rna浓度和纯度的检测。取5μl用核酸蛋白仪测定总rna浓度及纯度，样品的浓度计算公式：[rna]＝od260×d×40ng/μl，其中d为样品的稀释倍数，根据od260/od280比值判断rna的纯度。

1.2.2cdna第一链合成

按clontech公司smarttmracecdnaamplificationkit的操作步骤分别合成5′-race-readycdna和3′-race-readycdna，具体如下：

(1)按比例混合以下各成分：

表1

(2)70℃孵育2min，冰上速冷2min，短暂离心收集各成分，然后依次加入以下试剂：

表2

(3)轻轻混匀各成分，42℃恒温气浴1.5hr；

(4)加入tricine-edtabuffer100μl，72℃孵育7min，即完成第一链cdna的合成，用tebuffer稀释10倍-20℃保存备用。

1.2.3赤眼鳟β-肌动蛋白基因cdna核心序列克隆

根据已知鱼类的β-肌动蛋白核苷酸序列设计保守区域pcr扩增引物：

act01f:5’-tggcatcacaccttctacaacga-3’

act02r:5’-ccttcatagaggcaaataagtttcgg-3’

以上述按fermentasrevertaidtmfirststrandcdnasynthesiskit反转录试剂盒操作要求合成基因核心片段扩增所需cdna第一链为模板，分别以act01f，act02r为引物扩增赤眼鳟肝脏β肌动蛋白基因cdna核心片段，用taqdna聚合酶(takara)进行pcr扩增，扩增条件为：94℃预变性5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸5min。

1.2.4赤眼鳟β-肌动蛋白基因cdna5’末端获取

根据克隆得到的赤眼鳟β-肌动蛋白的cdna核心片段设计两个5’-race下游引物，

mlact5’03r:5’-gattacgccaagcttacattgccgtcaccttcaccgttccagt-3’；

mlact5’04r：5’-gattacgccaagcttaggccaggatggaacctccgatccag-3’，上游引物用试剂盒提供的引物。touchdownpcr反应条件为：94℃预变性5min，随之94℃1min，70℃1min，72℃1min，5个循环，94℃1min，68℃1min，72℃1min，5个循环，94℃1min，65℃1min，72℃1min，25个循环，最后72℃延伸5min。取首次扩增产物1μl，用试剂盒提供的nesteduniversalprimer(nup)引物，mlact5’04r引物进行二次pcr扩增，扩增条件为：94℃预变性5min，94℃1min，57℃1min，72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。

1.2.5赤眼鳟β-肌动蛋白基因cdna3’末端获取

根据已克隆得到的赤眼鳟β-肌动蛋白的cdna核心片段序列设计两个3’-race上游引物。

mlact3’01f:5’-gattacgccaagcttagatcacatccctggcccctagcacaa-3’；

mlact3’02f：5’-gattacgccaagctttccatcctggcctccctgtccacctt-3’，下游引物用试剂盒提供的通用引物。第一轮pcr用mlact3’01f和试剂盒提供的10*universalprimeramix(upm)，反应体系和反应条件同5’-race第一轮pcr。巢式pcr所用引物为mlact3’02f和试剂盒提供的nesteduniversalprimer(nup)引物，pcr反应体系和条件同5’-race第二轮pcr。

2结果

2.1赤眼鳟β-肌动蛋白基因序列结构与分析

通过rt-pcr和race法，从赤眼鳟肝脏中克隆获得了赤眼鳟β-肌动蛋白基因5’和3’端cdna片段，经过克隆测序后，比对所得有效序列运用dnastar软件与核心片段拼接，结果表明赤眼鳟β-肌动蛋白基因全长cdna共1816bp，开放阅读框(95-1222)1128bp，编码375个氨基酸，5’端非编码区为94bp，3’端非编码区为594bp。核苷酸序列的3’端非编码区还含有1个“aataaa”的mrna加尾信号。

2.2赤眼鳟β-肌动蛋白基因氨基酸理化性质分析

运用expasyproteomicsserver-protparam(http://www.expasy.ch/cgi-bin/protparam)在线服务软件分析赤眼鳟β-肌动蛋白基因氨基酸理化性质表明，该基因由375个氨基酸组成；分子式为c1850h2903n491o562s23；相对分子量为41.75kda；；理论pi值为5.30；不稳定系数为35.25小于40，表明该蛋白是稳定的，总平均亲水性为-0.213，脂肪系数为81.41，具体的氨基酸组成及含量见表3。

表3赤眼鳟β-肌动蛋白氨基酸组成及含量

根据表3可知，赤眼鳟β-肌动蛋白基因氨基酸组成和含量的分布：赤眼鳟β-肌动蛋白由20种氨基酸组成，其中甘氨酸含量最大，占7.7％，其次是异亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、丝氨酸和苏氨酸；半胱氨酸含量很少，仅占整体的1.6％，含量最小的是色氨酸，仅含有4个，只占整体的1.1％；带正电荷的氨基酸残基包括精氨酸和赖氨酸，共37个，占氨基酸含量的9.9％，带负电荷的氨基酸残基包括天冬氨酸和谷氨酸，共49个，占氨基酸含量的13.1％；亲水性氨基酸残基包括c、n、q、s、t和y，共105个，占氨基酸含量的27.9％，疏水性氨基酸残基包括a、f、g、i、l、m、p、v和w，共186个，占氨基酸含量的49.6％。

2.3赤眼鳟β-肌动蛋白信号肽预测

利用sosui工具(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosuisignal/sosuisignal_submit.html)和signalp3.0分别对β-肌动蛋白氨基酸序列进行了信号肽预测，两个软件的预测结果一致，表明该蛋白无信号肽。signalp3.0预测结果如图1。

序列长度＝70

2.4β-肌动蛋白跨膜结构预测

通过在线软件tmpred(http://www.ch.embnet.org/software/tmpred_form.html)和tmhmm(http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm-2.0对β-肌动蛋白进行跨膜结构预测，预测结果如图2。从图2可知该蛋白预测到2个跨膜区域，即在120-150和330-350的区段为由内向外的跨膜区域；tmhmm软件进一步评估，从图3可以推断该蛋白为非跨膜蛋白。

2.5β-肌动蛋白二级结构预测

通过clc-proteinwork-bench5.3和dnaman软件进行β-肌动蛋白二级结构预测。clc-proteinwork-bench5.3软件预测。结果表明该蛋白含有9个α-螺旋和15个片层结构组成；dnaman软件预测结果如图4，图中黑、蓝和红三种颜色分别表示α-螺旋、片层结构和卷曲环形结构，其中横坐标表示氨基酸序列位点，纵坐标表示各个位点二级结构形式的可能性。根据预测结果可知赤眼鳟β-肌动蛋白由三种不同结构相间构成了复杂的二级结构。

2.6β-肌动蛋白三级结构预测

运用swiss-model软件对赤眼鳟β-肌动蛋白氨基酸序列进行同源三级结构建模。模型构建的氨基酸范围从第2个氨基酸到第375个氨基酸；其建模参考模板为原鸡肌动蛋白细胞质，目标蛋白与参考蛋白的序列比对同源性为99.20％；模型评估e值为0.99，模型中可见典型的α-螺旋结构(如图5)。

2.7赤眼鳟β-肌动蛋白氨基酸序列同源性分析

赤眼鳟β-肌动蛋白酸酶氨基酸序列经ncbi中proteinblast比对，发现赤眼鳟β-肌动蛋白与多个物种的β-肌动蛋白具有较高的相似性，用于多序列比对β-肌动蛋白氨基酸序列及dnaman软件比对不同物种间相似性结果见表4。参与比对的序列共有14条，赤眼鳟β-肌动蛋白与其余13种物种的β-肌动蛋白的相似较高，都为99％。

运用dnaman软件进行多序列比对可知(图6)，赤眼鳟β-肌动蛋白氨基酸序列与其余13种不同物种的β-肌动蛋白的氨基酸序列所共有的高度保守位点比较多，即图中黑色阴影标记的部分；此外同一位点多序列同源性在90％以上的位点也比较多，即图中紫色阴影标记位点。结果表明，多个物种的β-肌动蛋白基因序列同源性较高，赤眼鳟β-肌动蛋白基因保守性较高。

表4赤眼鳟与不同物种的β-肌动蛋白同源性比较

3.讨论

肌动蛋白广泛存在于真核生物中,几乎参与了真核细胞所有的生理过程。目前对β-肌动蛋白基因的研究，主要集中于软体动物和鱼类，如栉孔扇贝、三角帆蚌、牡蛎和草鱼等。本实验通过rt-pcr技术和race法克隆得到的赤眼鳟β-肌动蛋白基因cdna序列全长为1816bp，开放阅读框(95-1222)1128bp，编码375个氨基酸，翻译起始密码子atg，序列终止密码子taa，终止密码子之后有加尾信号“aataaa”。通过一系列的生物信息学软件和在线分析，发现赤眼鳟β-肌动蛋白是不具有信号肽的非跨膜蛋白。生物有机体蛋白质的各种氨基酸残基可分为亲水残基和疏水残基两类，疏水残基一般位于蛋白质内部，而亲水性残基位于表面，这样蛋白质的亲水部位与蛋白质的抗原位点有密切的关系。本研究克隆获得的精氨酸酶亲水性氨基酸残基包括c、n、q、s、t和y，共105个，占氨基酸含量的27.9％，疏水性氨基酸残基包括a、f、g、i、l、m、p、v和w，共186个，占氨基酸含量的49.6％，表明该蛋白亲水性不高，因而抗原位点有可能比较少。一般认为在蛋白质二级结构中，β转角结构为凸出结构，多存在于蛋白质抗原表面；α-螺旋和β-片层结构规则不易变形，难以与抗体嵌合，因而一般不作为抗原表面，其主要功能是作为蛋白质骨架起稳定作用；无规则卷曲区域则决定蛋白质的功能。dnaman软件预测赤眼鳟β-肌动蛋白二级结构比较复杂，具有9个α-螺旋和15个β-片层结构，可以推断该蛋白结构比较稳固。本次推导得到的赤眼鳟β-肌动蛋白氨基酸序列与鲮鱼、鲢鱼和金丝鱼等13种不同物种都有很高的相似性，高达99％，符合β-肌动蛋白基因氨基酸序列编码区高度保守的特点，这种高度的保守性与perler等的研究结果一致。

4.结论

通过rt-pcr技术和race法，从赤眼鳟肝脏中克隆获得了赤眼鳟β-肌动蛋白基因cdna全长序列。该基因cdna全长共1816bp，由长94bp的5’端非编码区，长594bp的3’端非编码区和长1128bp的开放阅读框(95-1222)组成，阅读框共编码375个氨基酸，推算的分子量约为41.75kda，理论等电点5.30。通过在线软件对赤眼鳟β-肌动蛋白基因进行跨膜结构和信号肽预测，结果显示赤眼鳟β-肌动蛋白为无信号肽非跨膜蛋白。赤眼鳟β-肌动蛋白氨基酸序列经ncbi比对，与鲮鱼、鲫鱼、黄颡鱼等多个物种的β-肌动蛋白具有较高的相似性，都为99％，显示该基因在生物进化上的高度保守。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>湖南农业大学

<120>赤眼鳟β-肌动蛋白基因cdna全长序列、扩增引物及扩增方法

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tggcatcacaccttctacaacga23

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ccttcatagaggcaaataagtttcgg26

<210>3

<211>43

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gattacgccaagcttacattgccgtcaccttcaccgttccagt43

<210>4

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gattacgccaagcttaggccaggatggaacctccgatccag41

<210>5

<211>42

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gattacgccaagcttagatcacatccctggcccctagcacaa42

<210>6

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

gattacgccaagctttccatcctggcctccctgtccacctt41

<210>7

<211>1816

<212>dna

<213>赤眼鳟(spualiobarbuscurriculus)

<400>7

actttgagctcctccacacgcagctagtgcggaatatcatcagcttgtaacccattctct60

taagtcgacaaaccccccaaacctaagttcagccatggatgatgaaattgccgcactggt120

tgttgacaacggatccggtatgtgcaaagccggattcgctggagatgatgctccccgtgc180

tgtcttcccatccatcgtgggtcgccccagacatcagggcgtcatggtcggtatgggaca240

gaaggacagctatgttggtgacgaggctcagagcaagagaggtatcctgaccctgaagta300

ccccatcgagcacggtattgtcaccaactgggacgatatggagaagatctggcatcacac360

cttctacaacgagctgcgtgttgccccagaggagcaccccgtcctgctcacagaggcccc420

cctgaaccccaaagccaacagggaaaagatgacacagatcatgttcgagaccttcaacac480

ccccgccatgtacgttgccatccaggctgtgctgtccctgtatgcctctggtcgtaccac540

tggtatcgtgatggactctggtgatggtgtcacccacactgtgcccatctacgagggtta600

tgccctgccccatgccatcctccgtctggacttggctggccgtgacctgactgactacct660

catgaagatcctcaccgagagaggctacagcttcaccaccacagctgagagggaaattgt720

ccgtgacatcaaggagaagctctgctatgtggctcttgacttcgagcaggagatgggcac780

cgctgcttcctcctcctccctggagaagagctatgagctgcctgacggacaggtcatcac840

cattggcaatgagaggttcaggtgcccagaggctctgttccagccatccttcttgggtat900

ggagtcttgcggtatccatgagaccaccttcaactccatcatgaagtgtgacgtcgacat960

ccgtaaggacctgtatgccaacactgtattgtctggtggtaccaccatgtaccctggcat1020

tgctgacaggatgcagaaggagatcacatccctggcccctagcacaatgaaaatcaagat1080

catcgccccacctgagcgtaaatactctgtctggatcggaggttccatcctggcctccct1140

gtccaccttccagcagatgtggattagcaagcaggagtatgacgagtctggaccatccat1200

cgtccaccgcaaatgcttctaaacggactgttaccacttcacgccgactcaaactgcgca1260

gagaaaaacttcaaacgacaacattggcatggcttttgttatttttggcgcttgactcag1320

gatctaaaaactggaacggtgaaggtgacggcaatgttttttggcaaataagcatccccg1380

aagttctacaatgcatctgaggactcaatggtttttgtttttgtttctttagtcattcca1440

aatgtttgttaaatgcattgttccgaaacttatttgcctctatgaaggctgcccagtaat1500

tgggagcatacttaacattgtagtattgtatgtaaattatgtaacaaaacaatgtctggg1560

tttttgtactttcagccttaaaatcttgggttatttttttttttttttttttttttttct1620

ttgttccaaaaaactaagctttaccattcaagatgtaaaggtatccattctccccctggg1680

catattgtaaaagctgtgtggaacgtggcggtgccagacatttggtggggccaacctgta1740

cactgactaattcaaatccaataaaagtgcacatgtgtaagacatcaaaaaaaaaaaaaa1800

aaaaaaaaaaaaaaaa1816