一种重组大肠杆菌质周腔内生产唾液酸修饰N-糖基化重组蛋白方法与流程

本发明具体涉及一种重组大肠杆菌质周腔内生产唾液酸修饰n-糖基化重组蛋白方法，属于生物技术领域、蛋白质工程领域。

背景技术：

目前，已批准的蛋白药物中有70％是n-糖基化修饰的药物，唾液酸修饰n-糖基化药物蛋白可提高其理化性质。小分子量的药物蛋白在体内循环过程中很容易被肾脏滤掉、被肝脏非唾液酸糖蛋白受体介导清除及被外周血中蛋白酶降解。唾液酸修饰n-糖基化药物蛋白可显著增加药物蛋白的稳定性，降低免疫反应，延长药物半衰期。有报道表明，胚胎肾细胞系(hek)293s经过基因工程改造后，可生产唾液酸化寡糖链neu5ac-α-2,3-gal-β-1,4-glcnac修饰的重组蛋白，可降低该重组蛋白在体内的清除率，并且未产生新的免疫原性。但是，真核生物系统培养所需时间较长、成本高。虽然，在体外通过化学方法也可以获得唾液酸修饰的n-糖基化重组蛋白，但是该方法成本高、过程复杂，且产量低。在大肠杆菌质周腔内实现唾液酸修饰n-糖基化重组蛋白可降低生产唾液酸修饰n-糖基化药物蛋白成本，提高唾液酸修饰效率。利用流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)来源的糖基转移酶lsg基因簇表达的糖基转移酶可在大肠杆菌质周腔内合成寡糖链gal-β-1,4-glcnac-β-1,3-gal-β-1,3-glcnac,并在空肠弯曲杆菌来源的寡糖转移酶pglb作用下进行n-糖基化修饰重组蛋白。但还未见在大肠杆菌质周腔中末端唾液酸化的寡糖链neu5ac-gal-β-1,4-glcnac-β-1,3-gal-β-1,3-glcnac修饰重组蛋白的方法，如果能实现在大肠杆菌质周腔内末端唾液酸化的寡糖链neu5ac-gal-β-1,4-glcnac-β-1,3-gal-β-1,3-glcnac修饰重组蛋白，该方法可用于在大肠杆菌质周腔内生产唾液酸修饰n-糖基化药物蛋白。

技术实现要素：

为解决上述难题，本发明提供了一种重组大肠杆菌质周腔内唾液酸修饰n-糖基化重组蛋白方法，可快速、高效、大量生产唾液酸修饰的n-糖基化重组蛋白，无需在培养基中添加唾液酸即可低成本生产唾液酸修饰的n-糖基化重组蛋白，为唾液酸修饰n-糖基化药物蛋白的研发提供有效途径。

本发明的技术方案是利用流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)来源的糖基转移酶lsgcdef基因簇(genbank：m94855.1)、大肠杆菌来源的糖链合成起始酶weca基因(geneid：948789)、空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)来源的寡糖翻转酶pglk基因(geneid:905421)、寡糖转移酶pglb基因(geneid:905417)及唾液酸合成相关酶neubca基因簇(genbank:af400048.1),弧菌发光菌jt-ish-224(vibrionaceaephotobacteriumsp.jt-ish-224)来源的α-2,6唾液酸转移酶δ16psp2,6st基因(genbank：ab293985.1),以及需要唾液酸化n-糖基化修饰的重组蛋白基因，通过基因重组方法，克隆到大肠杆菌表达载体上，共同构建成大肠杆菌体内唾液酸修饰n-糖基化重组蛋白系统，在适合唾液酸修饰n-糖基化重组蛋白的重组大肠杆菌体内经自动诱导培养方法，无需添加外源唾液酸，进行唾液酸修饰n-糖基化重组蛋白。

其中，唾液酸化的寡糖链为neu5ac-α-2,6-gal-β-1,4-glcnac-β-1,3-gal-β-1,3-glcnac；需要唾液酸化n-糖基化修饰的重组蛋白基因上携带编码寡糖转移酶pglb识别序列。

本发明所述方法包括以下步骤：

(1)适合唾液酸修饰n-糖基化重组蛋白大肠杆菌菌株的构建；

(2)唾液酸修饰n-糖基化重组蛋白表达载体的构建；

(3)大肠杆菌体内生产唾液酸修饰的n-糖基化重组蛋白；

(4)步骤(3)中获得的重组蛋白经纯化后即得唾液酸修饰的n-糖基化重组蛋白。

其中，步骤(1)具体为：所述适合唾液酸修饰n-糖基化重组蛋白大肠杆菌菌株的构建，基本方法为利用red同源重组系统，敲除大肠杆菌k12来源的w3110基因组中的nanketa基因簇，从而阻断唾液酸合成过程中的旁路途经，构建成大肠杆菌菌株的基因型为w3110δnanketa::kan。

步骤(2)具体为：将糖基转移酶lsgcdef基因簇、糖链合成起始酶weca基因、寡糖翻转酶pglk基因、寡糖转移酶pglb基因共同构建至大肠杆菌表达载体上，获得表达n-糖基化体系的载体；将唾液酸合成相关酶neubca基因簇、α-2,6唾液酸转移酶δ16psp2,6st基因以及需要唾液酸化n-糖基化修饰的重组蛋白基因，通过基因重组方法，克隆到大肠杆菌表达载体上，共同构建成大肠杆菌质周腔内唾液酸修饰n-糖基化重组蛋白系统。

所述步骤(3)具体为：将步骤(2)中构建的唾液酸修饰n-糖基化重组蛋白表达载体转化到步骤(1)获得的大肠杆菌菌株w3110δnanketa::kan中，经自动诱导培养方法，无需添加外源唾液酸，在该菌株体内生产唾液酸修饰的n-糖基化重组蛋白。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供一种在重组大肠杆菌菌株w3110δnanketa::kan质周腔内进行唾液酸修饰n-糖基化重组蛋白的方法，实现大肠杆菌质周腔中唾液酸修饰n-糖基化重组蛋白，其中，唾液酸化的寡糖链为neu5ac-α-2,6-gal-β-1,4-glcnac-β-1,3-gal-β-1,3-glcnac。该方法所需时间短、成本低、唾液酸化效率高，且培养过程中无需添加外源唾液酸，为生产治疗性唾液酸修饰n-糖基化蛋白药物建立技术平台。

附图说明

图1.pc15-ara-pglb-weca-pglk-lsgcdef载体图谱。

图2.pig6-fn3-p-δ16psp2,6st-neubca载体图谱。

图3.pig6-fn3载体图谱。

图4.重组大肠杆菌体内表达唾液酸修饰的n-糖基化重组蛋白的westernblotting检测结果。1.未糖基化的fn3重组蛋白，2.未唾液酸修饰的n-糖基化fn3重组蛋白，3.唾液酸修饰的n-糖基化fn3重组蛋白。

图5.重组大肠杆菌体内表达唾液酸修饰的n-糖基化重组蛋白的凝集素印记检测结果。

其中，图5a是eylaboratories公司生产的特异识别gal-β-1,4-glcnac的凝集素eca(catalognumber：h-5901-1)凝集素印记检测结果：1.未糖基化的fn3重组蛋白，2.未唾液酸修饰的n-糖基化fn3重组蛋白，3.唾液酸修饰的n-糖基化fn3重组蛋白。

图5b是eylaboratories公司生产的特异识别neu5ac-ɑ-2,6-gal的凝集素sna-ⅰ(catalognumber：h-6802-1)凝集素印迹检测结果：1.未糖基化的fn3重组蛋白，2.未唾液酸修饰的n-糖基化fn3重组蛋白，3.唾液酸修饰的n-糖基化fn3重组蛋白。

图6.重组大肠杆菌体内表达唾液酸修饰的n-糖基化重组蛋白的糖链组成分析。6a.hcdms/ms谱图，6b.去卷积ms/ms谱图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式对本发明作进一步的说明，但并不影响本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明涉及实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。大肠杆菌菌株w3110购买于美国耶鲁大学-大肠杆菌遗传库存中心。

实施例1、适合唾液酸修饰n-糖基化重组蛋白大肠杆菌菌株的构建

用于基因改造的原始菌株是大肠杆菌k12来源的w3110，利用red同源重组系统敲除其基因组上的nanketa基因簇(seqidno.1)。基因敲除所用的质粒包括pkd13、pkd46。nanketa基因簇的敲除，具体步骤如下：

根据大肠杆菌w3110基因组上nanketa基因簇两侧碱基序列及pkd13上卡那霉素抗性基因两侧碱基序列设计两对敲除引物，分别为：

delnanketaf1：5ˊ-gcatccgcgccagccaactccccctgcgctgccgctgcgtgtaggctggagctgctt-3ˊ；

delnanketar1：5ˊ-tggtgtacaacattccagccctgagtggggtaaaactctgtcaaacatgagaattaa-3ˊ；

delnanketaf2：5ˊ-gtcaccctgcccggcgcgcgtgaaaatagttttcgcatccgcgccagccaactccccct-3ˊ；

delnanketar2：5ˊ-gcaattattgattcggcggatggtttgccgatggtggtgtacaacattccagccctgag-3ˊ。

先以pkd13为模板，利用引物delnanketaf1、delnanketar1进行第一次pcr扩增；再以第一次的pcr产物为模板，利用引物delnanketaf2、delnanketar2进行第二次pcr扩增，得到两侧分别有75bp、71bp与nanketa基因簇两端的基因组序列同源且带有卡那霉素抗性基因的pcr片段。pcr片段经电泳、切胶回收后电击转化进入携带pkd46表达的同源重组酶的大肠杆菌w3110菌株细胞中，通过pkd46表达的同源重组酶将pcr片段整合至基因组中替换nanketa基因簇。将转化子涂布于含有卡那霉素(15μg/ml)的lb固体培养基平板上，30℃培养过夜。利用鉴定引物jdnanketaf：5ˊ-cgcactggcaatcagttgtg-3ˊ与jdnanketar：5ˊ-cgtcacgccgttctactatc-3ˊ对长出的单克隆菌落进行菌落pcr扩增鉴定，并对pcr产物进行基因测序鉴定，确定nanketa基因簇被敲除。

为去除质粒pkd46，挑取阳性单克隆菌落于含卡那霉素(15μg/ml)的3mllb液体培养基中，42℃培养12小时，将菌液涂布于含卡那霉素(15μg/ml)的lb固体培养基平板上，37℃培养过夜。利用分别含氨苄青霉素(100μg/ml)、卡那霉素(15μg/ml)的lb固体培养基平板对长出的单克隆菌落进行抗性筛选，只在含卡那霉素(15μg/ml)的lb固体培养基平板上生长，而在含氨苄青霉素(100μg/ml)的lb固体培养基平板上不生长的菌落证明其质粒pkd46已丢失。获得缺失nanketa基因簇后的大肠杆菌菌株为w3110δnanketa::kan，该菌株阻断了唾液酸合成过程中的旁路途经。

lb固体培养基配方如下：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉15g/l，加ddh2o配制而成。

lb液体培养基的配方如下：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，加ddh2o配制而成。

实施例2、唾液酸修饰n-糖基化重组蛋白表达载体的构建

(1)n-糖基化机制的构建。具体步骤如下：

利用常规的基因重组技术，将编码糖基转移酶lsgcdef基因簇(genbank：m94855.1)、糖链合成起始酶weca基因(geneid：948789)、寡糖翻转酶pglk基因(geneid:905421)及寡糖转移酶pglb(geneid:905417)的基因构建至载体pacyc184上，并由阿拉伯糖启动子(arabinosepromoter，简写为ara)调控以上四种基因的表达，获得表达n-糖基化体系的载体pc15-ara-pglb-weca-pglk-lsgcdef，该载体图见图1，其序列见seqidno.3。

(2)唾液酸合成及转移途径的构建。具体步骤如下：

本发明选用重组人纤维连接蛋白ⅲ型结构域(fn3)作为受体蛋白，在大肠杆菌质周腔内进行唾液酸修饰n-糖基化重组蛋白研究。重组蛋白fn3基因在5ˊ端携带编码flag标签(氨基酸序列为：dykd，d代表天冬氨酸残基，y代表酪氨酸残基，k代表赖氨酸残基)序列，便于westernblotting检测；在3ˊ端携带编码pglb寡糖转移酶识别位点dqnat(d代表天冬氨酸残基，q代表谷氨酰胺残基，n代表天冬酰胺残基，a代表丙氨酸残基，t代表苏氨酸残基)序列，并在其下游引入编码6个组氨酸标签序列。组氨酸标签用于重组蛋白分离纯化。利用常规的基因重组技术，将重组蛋白fn3基因(seqidno.3)与唾液酸合成相关酶neubca基因簇(genbank:af400048.1)、弧菌发光菌jt-ish-224(vibrionaceaephotobacteriumsp.jt-ish-224)来源的α-2,6唾液酸转移酶δ16psp2,6st基因(genbank：ab293985.1)及来源于空肠弯曲杆菌pgl基因簇(genbank:y11648.1)上游的332bp的调控序列(简称为p,seqidno.4)克隆至载体pig6，获得表达重组蛋白fn3、唾液酸合成与转移相关酶的载体pig6-fn3-p-δ16psp2,6st-neubca，该载体图见图2，其序列见seqidno.5。另外，为了添加对照组，将重组蛋白fn3基因单独克隆至载体pig6，获得表达重组蛋白fn3的载体pig6-fn3，该载体图见图3，其序列见seqidno.6。

实施例3、大肠杆菌体内生产唾液酸修饰的n-糖基化重组蛋白及纯化。

将载体pc15-ara-pglb-weca-pglk-lsgcdef和pig6-fn3-p-δ16psp2,6st-ne-ubca共同转化进入重组大肠杆菌菌株w3110δnanketa::kan，获得携带唾液酸修饰n-糖基化重组蛋白表达载体的重组大肠杆菌菌株。

将转化子接种至含有卡那霉素(15μg/ml)、氨苄青霉素(100μg/ml)、氯霉素(34μg/ml)的lb固体培养基平板上，37℃过夜培养12小时。筛选出单克隆后将其接种到含有氨苄青霉素(100μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的3mllb液体培养基中，220rpm、37℃过夜培养。次日，以1:100的比例将菌液接种到含有氨苄青霉素(100μg/ml)、氯霉素(34μg/ml)的500ml自动诱导培养基中，220rpm、25℃条件下培养40小时，并每隔12小时加入l-阿拉伯糖(200μg/ml)作为诱导剂。4000rpm、4℃离心收集菌体，通过超声破碎、低温高速离心等方法获得包含唾液酸修饰的n-糖基化fn3重组蛋白的上清液。用平衡缓冲液平衡镍柱10个柱体积，将上述所得上清液平衡后低速上柱。样品上柱完毕后，用20mm咪唑浓度的缓冲液洗脱20个柱体积，接着分别用含有40、60、120、240、500mm咪唑浓度的缓冲液进行梯度洗脱，收集洗脱液，分离纯化的重组蛋白即为唾液酸修饰的n-糖基化fn3重组蛋白，其中，唾液酸化的寡糖链为neu5ac-α-2,6-gal-β-1,4-glcnac-β-1,3-gal-β-1,3-glcnac。以上纯化后的唾液酸修饰的n-糖基化fn3重组蛋白采用脱盐柱除盐后，于4℃保存。

同时，培养只携带载体pig6-fn3的大肠杆菌菌株w3110δnanketa::kan与携带载体pig6-fn3和载体pc15-ara-pglb-weca-pglk-lsgcdef的大肠杆菌菌株w3110δnanketa::kan作为对照组，具体步骤如下：

将载体pig6-fn3转化进入大肠杆菌w3110δnanketa::kan。将转化子接种至含有卡那霉素(15μg/ml)、氨苄青霉素(100μg/ml)的lb固体培养基平板上，37℃过夜培养12小时。筛选出单克隆后将其接种到含有氨苄青霉素(100μg/ml)的3mllb液体培养基中，220rpm、37℃过夜培养。次日，以1:100的比例将菌液接种到含有氨苄青霉素(100μg/ml)的500ml自动诱导培养基中，220rpm、25℃条件下培养40小时。

将载体pig6-fn3和载体pc15-ara-pglb-weca-pglk-lsgcdef共同转化进入大肠杆菌w3110δnanketa::kan。将转化子接种至含有卡那霉素(15μg/ml)、氨苄青霉素(100μg/ml)、氯霉素(34μg/ml)的lb固体培养基平板上，37℃过夜培养12小时。筛选出单克隆后将其接种到含有氨苄青霉素(100μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的3mllb液体培养基中，220rpm、37℃过夜培养。次日，以1:100的比例将菌液接种到含有氨苄青霉素(100μg/ml)、氯霉素(34μg/ml)的500ml自动诱导培养基中，220rpm、25℃条件下培养40小时，并每隔12小时加入l-阿拉伯糖(200μg/ml)作为诱导剂。

运用与以上获得唾液酸修饰的n-糖基化fn3重组蛋白的相同菌体收集、纯化及脱盐方法，获得未糖基化的fn3重组蛋白与未唾液酸修饰的n-糖基化fn3重组蛋白。

lb固体培养基配方如下：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉15g/l，加ddh2o配制而成。

lb液体培养基的配方如下：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，加ddh2o配制而成。

自动诱导培养基的配方如下：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.5g/l，乳糖2g/l，磷酸氢二钠7.1g/l，磷酸二氢钾6.8g/l，硫酸铵3.3g/l，硫酸钠0.9g/l，七水硫酸镁0.25g/l，加ddh2o配制而成。

实施例4、大肠杆菌体内生产唾液酸修饰n-糖基化重组蛋白的检测。

利用westernblotting检测、凝集素印迹检测及质谱检测等方法检测重组蛋白的唾液酸修饰情况。

(1)westernblotting检测采用sigma公司生产的抗flagm1单克隆抗体作为一抗、solarbio公司生产的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠igg作为二抗，以纯化并脱盐后的未糖基化的fn3重组蛋白、未唾液酸修饰的n-糖基化fn3重组蛋白作为阴性对照，对唾液酸修饰的n-糖基化fn3重组蛋白进行检测分析。通过对比分子迁移率，确定fn3重组蛋白的糖基化及唾液酸修饰情况。结果图见图4，fn3重组蛋白经n-糖基化修饰后分子量增大，经唾液酸化n-糖基化修饰后分子量进一步增大。

(2)凝集素印迹检测分别采用eylaboratories公司生产的特异识别gal-β-1,4-glcnac的凝集素eca(catalognumber：h-5901-1)、特异识别neu5ac-ɑ-2,6-gal的凝集素sna-ⅰ(catalognumber：h-6802-1)，以纯化并脱盐后的未糖基化的fn3重组蛋白、未唾液酸修饰的n-糖基化fn3重组蛋白作为阴性对照，对唾液酸修饰的n-糖基化fn3重组蛋白进行检测分析。结果图见图5，a图为eylaboratories公司生产的特异识别gal-β-1,4-glcnac的凝集素eca(catalognumber：h-5901-1)凝集素印记检测结果，未糖基化的fn3重组蛋白及唾液酸修饰的n-糖基化fn3重组蛋白都没有特异性条带出现，而未唾液酸修饰的n-糖基化fn3重组蛋白检测到特异性条带，证明fn3重组蛋白被n-糖基化修饰；b图为eylaboratories公司生产的特异识别neu5ac-ɑ-2,6-gal的凝集素sna-ⅰ(catalognumber：h-6802-1)凝集素印迹检测结果，未糖基化的fn3重组蛋白及未唾液酸修饰的n-糖基化fn3重组蛋白都没有特异性条带出现，而唾液酸修饰的n-糖基化fn3重组蛋白检测到特异性条带，证明fn3重组蛋白被唾液酸化n-糖基化修饰。

(3)唾液酸修饰n-糖基化fn3重组蛋白糖链组成分析。

检测方法：取实施例3中获得的纯化并脱盐后的唾液酸修饰的n-糖基化fn3重组蛋白，加入胰酶trypsin(promegav5280)、glu-c酶(promega)进行酶解后，采用thermoorbitrapexactivehf型液质联用质谱仪进行定性检测。根据二级谱图by离子及相应修饰质量数匹配情况，确定主要的修饰糖型。

检测器：thermolorbitrapexactivehfmassspectrometer(thermofisher)

流动相：a液，0.1％甲酸+99％水；b液，99.9％乙腈+0.1％甲酸；流速:0.6μl/min。结果图见6，糖肽为iggggsdqnatk(分子量为1104.1)，i代表异亮氨酸残基，g代表甘氨酸残基，s代表丝氨酸残基，d代表天冬氨酸残基，q代表谷氨酰胺残基，n代表天冬酰胺残基，a代表丙氨酸残基，t代表苏氨酸残基，k代表赖氨酸残基，修饰位点位于天冬酰胺残基。a图可见neuac(分子量为292.10)、neuac-h2o(分子量为274.09)、neuac(1)hex(1)hexnac(1)(分子量为657.23)的特异峰；去卷积后，b图可见糖肽iggggsdqnatk带有糖链neuac(1)hex(2)hexnac(2)(分子量为2125.89)的特异峰，其去除neuac、hex或hexnac后，分别得到a图中的糖肽iggggsdqnatk带有糖链hex(2)hexnac(2)(分子量为1634.79)、糖肽iggggsdqnatk带有糖链hex(1)hexnac(1)(分子量为1469.66)及糖肽iggggsdqnatk带有糖链hexnac(1)(分子量为1307.61)。以上质谱分析结果，结合westernblotting检测、凝集素印迹检测结果，确定修饰fn3重组蛋白的末端唾液酸化的寡糖链为neu5ac-gal-β-1,4-glcnac-β-1,3-gal-β-1,3-glcnac。

根据以上具体实施例可得出结论，本发明所述的一种重组大肠杆菌质周腔内唾液酸修饰n-糖基化重组蛋白方法简单、快速、高效且生产成本低，为进一步生产更加稳定的治疗性蛋白药物或糖疫苗建立技术平台。

本发明实施方式不限于此，仅为本发明较佳的具体实施方式，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和通用方法，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，本发明还可以有其它的实施方式。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，本发明还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，如可以用其它的大肠杆菌表达载体、更换具有相同功能的唾液酸糖基转移酶基因、其他受体蛋白表达基因等类似方法，用大肠杆菌生产唾液酸修饰的n-糖基化重组蛋白，均落在本发明权利保护范围之内。

本发明所述一种重组大肠杆菌体内唾液酸修饰n-糖基化重组蛋白方法，所涉及的基因序列如下：

seqidno.1敲除的nanketa基因簇

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seqidno.2pc15-ara-pglb-weca-pglk-lsgcdef

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seqidno.3重组蛋白fn3基因

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seqidno.4来源于空肠弯曲杆菌pgl基因簇(genbank:y11648.1)上游的332bp的调控序列(简称为p)

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seqidno.5pig6-fn3-p-δ16psp2,6st-neubca

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seqidno.6pig6-fn3

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