一种重组大肠杆菌制备(R)-对氯环氧苯乙烷的方法与流程

本发明涉及一种重组大肠杆菌制备(r)-对氯环氧苯乙烷的方法，属于生物技术领域。

背景技术：

手性环氧化物及其邻二醇是一类高附加值的多功能手性化合物，可用于药物、精细化学品、农药及功能性材料等的合成，具有重要的应用价值。例如，芳香族环氧乙烷及其邻二醇可作为左旋咪唑levamisole、抗hiv药物(-)-hyperolactonec、心血管药物硝苯洛尔(r)-nifenalol、抗抗癌药物依利罗地eliprodil等的合成前体。目前，对于手性环氧化物及其邻二醇的合成主要有化学合成和生物催化两种方法。然而，化学合成法面临依赖重金属催化剂带来毒性、反应条件苛刻、立体选择性不强和低产率等一系列问题。近年来，环氧化物水解酶(epoxidehydrolase,eh,ec3.3.2.x)介导的动力学拆分和对映体归一性水解法因其来源广泛、底物谱广、反应条件温和立体选择性高等优点而逐渐走进人们的视野。ehs能催化外消旋环氧化物的选择性开环，通过加成一个水分子生成相应的手性邻二醇或选择性保留手性环氧化物(即对映归一性水解或动力学拆分两种形式)。

随着生物技术发展，新ehs不断被发现并且在合成手性中间体中的潜能被不断开发。1993年，faber等从细菌中筛选到具有ehs活性菌株，如rhodococcussp.对2-甲基-1,2-环氧庚烷具有高对映选择性。胡蝶等从宇佐美曲霉中成功发掘出一种新型的环氧化物水解酶aueh2，发现其在动力学拆分外消旋环氧苯乙烷(rac-so)中具有很大的应用潜力。植物ehs则更加容易获得且原料也较为廉价。李闯等从菜豆基因组中克隆了新型还氧化物水解酶pveh2，pveh2对(rac)-so有极好的对映选择性(e>200)。

鉴于此，通过对生物资源的进一步“挖掘”具有较高活性和较高立体选择性的新型eh，进而应用于制备手性环氧化物和邻二醇。将推动ehs产业化生产和应用进程，能产生较大的经济效益。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种重组大肠杆菌，是以大肠杆菌为宿主，表达番茄(solanumlycopersicum)来源的环氧化物水解酶。

在本发明的一种实施方式中，所述环氧化物水解酶的genbank登录号为axm43803.1。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以e.colibl21、e.colijm109、e.colidh5α、或e.colitop10为宿主。

本发明的第二个目的是提供构建所述重组大肠杆菌的方法，所述方法是以pet系列的质粒为表达载体，表达编码所述环氧化物水解酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是将番茄来源还氧化物水解酶sleh1基因克隆到pet-28a(+)的bamhⅰ和xhoⅰ的酶切位点之间，构建得到重组质粒pet28a(+)-sleh1，再将重组质粒转化到宿主细胞中，得到重组菌。

本发明的第三个目的是提供一种(r)-对氯环氧苯乙烷(pcso)的生物转化方法，所述方法是以所述重组大肠杆菌细胞为催化剂，以外消旋对氯环氧苯乙烷(rac-pcso)进行动力学拆分反应。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌按照0.125～1mg湿菌体细胞/mm底物的比例加入至反应体系中。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将发酵得到的重组大肠杆菌e.coli/sleh1按照80～150mg/ml湿菌体的比例溶解于浓度为100mmol/l，ph为5.0～10.0的nah2po4-na2hpo4缓冲溶液中，在20～50℃下加入10～150mmrac-pcso进行动力学拆分反应，得到手性纯(ees>98％)的(r)-pcso。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌经过iptg诱导。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导是加入0.05～1mm的iptg，在16～30℃下诱导4～16h。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导是将重组大肠杆菌接种到lb培养基中，于37℃下220rpm震荡培养12h，再将培养液按1％接种量接入lb培养基中，于37℃下220rpm震荡培养2.5h，后添加浓度为0.05～1mm的iptg，在16～30℃下220rpm震荡培养4～16h。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导温度为25℃，诱导时间为8h，iptg浓度为0.05mm。

在本发明的一种实施方式中，所述方法的菌悬液浓度为150mg/ml，反应体系缓冲液ph为7.5，反应温度为25℃。

本发明还要求保护氨基酸序列如genbank登录号：axm43803.1所示的环氧化物水解酶在手性化合物催化，制备药物、精细化学品、农药及功能性材料方面的应用。

本发明还要求保护所述重组大肠杆菌在制备手性环氧苯乙烷、对氟环氧苯乙烷、对甲基环氧苯乙烷、邻甲苯缩水甘油醚、环氧己烷、环氧辛烷及其邻二醇，以及在药物、精细化学品、农药及功能性材料等合成方面的应用。

本发明的有益效果：(1)本发明发现了由一种番茄来源环氧化物水解酶基因sleh1表达的重组酶的新应用；与其它来源的环氧化物水解酶相比，其催化rac-pcso的对映选择性更强，对映体比率(e值)为46.1，大于已报到的pveh1^w102l的25.5和kau2的35；(2)本发明构建的重组大肠杆菌作为催化剂进行生物转化，可以以150mm(已报到最高浓度)rac-pcso为底物，在单水相中经动力学拆分反应生产手性纯(ees>98％)的(r)-pcso，产率由已报道的pveh1^w102l的45.6％提高至47.5％(理论产率为50％)。

附图说明

图1为本发明的重组表达载体pet-28a(+)-sleh1的物理图谱。

图2为12％sds-page图谱，其中，m为蛋白分子量marker；1泳道为没有经过iptg诱导的e.colibl21(de3)/pet28a(+)-sleh1；2泳道为经0.05mmol/liptg诱导的e.colibl21(de3)/pet28a(+)-sleh1。

图3为重组环氧化物水解酶对150mmrac-pcso的水解反应进程。

具体实施方式

rac-pcso购自上海energy公司；其他试剂均为分析纯。手性正相hplc色谱柱od-h(daicel,osaka,japan；250mm×4.6mm)购买自大赛璐药物手性技术(上海)有限公司；高效液相色谱仪(waterse2695)为美国waters科技公司产品。

酶活测定方法：在实施例2所述的测试条件下，酶活单位(u)定义为每分钟消耗1μmol的pcso所需的酶量。

转化率的计算方法：转化率c(％)＝[(adiol×ε)/(adiol×ε+aepoxide)]×100％，aepoxide和adiol分别为hplc检测出的底物与产物峰的总面积；ε为摩尔消光系数(1.0399)。

底物ees，产物eep和产率(％)的计算方法：ees(％)＝[(rs-ss)/(rs+ss)]×100％；eep(％)＝[(rp-sp)/(rp+sp)]×100％，产率(％)＝(1-c)rs/(rs+ss)，其中rs和ss分别代表(r)-pcso和(s)-pcso的浓度，rp和sp表示(r)-对氯苯基乙二醇(pcped)和(s)-pcped的浓度。

e值的计算方法：ln[(1-ees)/(1+ees/eep)]/ln[(1+ees)/(1+ees/eep)]

实施例1环氧化物水解酶基因的克隆及表达质粒的构建

提取番茄的总rna(使用trizol试剂盒，invitrogen公司)，参照试剂盒说明书进行操作。反转录过程参照takara公司的rt-pcr试剂盒(pcrprimescripttmrtreagentkit)说明书，后以反转录得到的cdna为模板，上、下游引物(引物中引入bamhⅰ和xhoⅰ限制性内切酶酶切位点，由上海生工合成)序列分别为ggatccatggagaagatagagcacaagat,ctcgaggaacttttgaatgaagtcatagatgtg，采用常规pcr方法扩增sleh1全长基因，pcr反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，循环30次，再在72℃下延伸10min。pcr产物用1.0％琼脂糖核酸凝胶电泳检测与纯化后用dna胶回收试剂盒(上海生工)回收目的片段，回收产物和表达载体pet-28a(+)经相同的限制酶的处理之后，用t4dna连接酶将两者在17℃下过夜连接，得到重组表达载体pet-28a(+)-sleh1，并将其导入到e.colibl21(de3)的感受态细胞内，得到重组大肠杆菌e.coli/sleh1。

实施例2温度对重组菌株的诱导表达影响

将实施例1中的基因工程菌e.coli/sleh1接种于含0.1g/l卡那霉素的lb液体培养基中，37℃条件下、220rpm震荡培养12h，再将培养液按1％接种量接入lb培养基中，于37℃下220rpm震荡培养2.5h，后添加浓度为0.2mm的iptg，在16～30℃下220rpm震荡培养8h，离心收集菌体。

所得到的菌体按照150mg/ml湿菌体浓度用nah2po4-na2hpo4(100mm,ph7.5)缓冲液进行重新混悬。以菌悬液直接作为催化剂，以rac-pcso为底物，比较不同诱导温度下活细胞的催化活性。具体操作为：在10ml的ep塑料管中，加入3.3ml菌悬液，0.5ml浓度为200mm的rac-pcso甲醇溶液，1.2ml缓冲液，在25℃震荡条件下，反应10min，取500μl反应液，加入到2ml乙酸乙酯中终止反应。将样品进行hplc检测，比较不同样品间底物的减少量(检测条件：手性正相hplc色谱柱od-h，流动相为正己烷/异丙醇＝8/2，流速为0.8ml/min，测定方法参见论文yehh,hud,shixl,etal.directedmodificationofanovelepoxidehydrolasefromphaseolusvulgaristoimproveitsenantioconvergencetowardsstyreneepoxides[j].catalysiscommunications,2016,87:32-35.)，以25℃诱导温度下的相对酶活为100％，比较不同诱导温度下活细胞的催化活性，结果见表1。在25～30℃进行诱导，重组大肠杆菌细胞的环氧化物水解酶相对酶活达83.5％以上。

表1

实施例3诱导时间对重组菌株的诱导表达影响

将实施例1中的基因工程菌e.coli/sleh1接种于含0.1g/l卡那霉素的lb液体培养基中，37℃条件下、220rpm震荡培养12h，再将培养液按1％接种量接入lb培养基中，于37℃下220rpm震荡培养2.5h，后添加浓度为0.2mm的iptg，在25℃下220rpm震荡培养4～16h，离心收集菌体。

比较方法同上，以8h诱导温度下的相对酶活为100％，比较不同诱导时间下活细胞的催化活性，结果见表2。诱导8～16h重组大肠杆菌细胞的环氧化物水解酶相对酶活达80.1％以上。

表2

实施例4诱导剂浓度对重组菌株的诱导表达影响

将实施例1中的基因工程菌e.coli/sleh1接种于含0.1g/l卡那霉素的lb液体培养基中，37℃条件下、220rpm震荡培养12h，再将培养液按1％接种量接入lb培养基中，于37℃下220rpm震荡培养2.5h，后添加浓度分别为0.05～1mm的iptg，在25℃下220rpm震荡培养8h，离心收集菌体。

以0.2mm的iptg诱导条件下的相对酶活为100％，比较不同诱导剂浓度下活细胞的催化活性，结果见表3。

表3

实施例5环氧化物水解酶sleh1的制备

将实施例1中的基因工程菌e.coli/sleh1按照优化后的发酵条件进行发酵，绝对酶活为75u/l，离心收集菌体。菌体细胞的sds-page分析结果如图2所示，目的蛋白的表观分子约为41.0kda。

实施例6反应ph值对重组菌株催化pcso的影响

将实施例1的基因工程菌e.coli/sleh1按优化后的发酵条件进行发酵，离心收集菌体。所得到的菌体按照150mg/ml湿菌体浓度用ph为5.0～10.0的缓冲液进行重新混悬。以菌悬液直接作为催化剂，以rac-pcso为底物，25℃下反应，比较不同ph体系下活细胞的催化活性。

比较方法同上，以ph为7.5的反应条件下的相对酶活为100％，比较不同ph体系下活细胞的催化活性，结果见表4。在ph为6～8的环境中，重组大肠杆菌细胞的环氧化物水解酶相对酶活达91.9％以上。

表4

实施例7反应温度对重组菌株催化pcso的影响

将实施例1中的基因工程菌e.coli/sleh1按照优化后的发酵条件进行发酵，离心收集菌体。所得到的菌体按照150mg/ml湿菌体浓度用ph为7.5的缓冲液进行重新混悬。以菌悬液直接作为催化剂，以rac-pcso为底物，20～50℃下反应，比较不同反应温度下活细胞的催化活性。

比较方法同上，以25℃的反应条件下的相对酶活为100％，比较不同反应温度下活细胞的催化活性，结果见表5。在20～30℃进行转化反应，重组大肠杆菌细胞的环氧化物水解酶相对酶活达95.8％以上。

表5

实施例8重组菌在制备手性pcso中的应用

将实施例1中的基因工程菌e.coli/sleh1按照优化后的发酵条件进行发酵，离心收集菌体。所得到的菌体按照200mg/ml湿菌体浓度用nah2po4-na2hpo4(100mm,ph7.5)缓冲液进行重新混悬。以菌悬液直接作为催化剂，以rac-pcso为底物，进行手性pcso的制备。具体操作为：在10ml的ep塑料管中，加入3.75ml菌悬液，90.3μlrac-pcso原液，1.25ml缓冲液，在25℃震荡条件下，转化12h，在反应进行至15min、30min、45min、1h、3.5h、6h、7h、8h、10h、12h时分布取100μl反应液，加入到1ml乙酸乙酯中终止反应。将样品进行hplc检测。将分析结果绘制成反应进程图，如图3所示。

经检测，反应进行至3h时，(r)-pcso的ees值达到86.9％，产率达到48.1％；而反应进行至12h时，(r)-pcso的ees值达到98.1％，产率达到47.5％(手性拆分的理论产率为50％)。

实施例9

具体实施方式同实施例8，区别在于，湿菌体的添加量为100mg/ml，结果显示，反应12h的产率达到45.1％，ees值达到84.7％。

对照例1

参照实施例8的方法，利用基因工程菌e.coli/sleh1和e.coli/sleh1^w102l(公开于论文《定点突变提高菜豆环氧水解酶的对映选择性》)对rac-pcso进行生物转化，反应条件如表6所示。结果显示，在细胞催化剂用量更少的情况下，本发明的e.coli/sleh1产率和ees均高于已报道的环氧化物水解酶。

表6

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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