一株泰乐菌素降解菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物降解抗生素领域，具体涉及一株泰乐菌素降解菌及其应用。

背景技术：

泰乐菌素(tylosin)，也被称作泰乐霉素或者是泰农，是由美国科学家在1959年在对一株被称为弗氏链霉菌(streptomycesfradiae)的研究当中所获得的一种大环内酯类抗生素。泰乐菌素为一种白色板状结晶，微溶于水，呈碱性。泰乐菌素的分子式为：c46h77no17，相对分子质量：916.1，化学结构式为：

泰乐菌素是一种广谱抗生素，对支原体有特效，对多种g⁺菌具有很强的抗菌作用，还对部分g^－菌、弯杆菌、螺旋体及球虫具有抑制作用。

目前，泰乐菌素环境残留问题已经成为国内外普遍关注的热点环境问题之一。至今，国内外有关泰乐菌素生物降解与降解菌株筛选方面的研究报道也不是很多。

因此，找到一种能采用快速、高效的降解泰乐菌素的菌株就成了亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种快速、高效的降解泰乐菌素菌株，从而解决泰乐菌素环境残留的问题。

本发明的技术方案为：一株泰乐菌素降解菌，为波茨坦短芽孢杆菌(brevibacillusborstelensis)tyl2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年12月29日，保藏编号为cgmccno.17051，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

波茨坦短芽孢杆菌cgmccno.17051或其代谢产物在泰乐菌素降解上的应用。

波茨坦短芽孢杆菌cgmccno.17051或其代谢产物在修复被泰乐菌素污染的土壤或水体上的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用药渣为筛选的最初原料，得到一株能高效降解泰乐菌素的波茨坦短芽孢杆菌cgmccno.17051，该菌株及制成的菌剂可直接应用于泰乐菌素企业废弃物的处理，也可应用于周边被泰乐菌素污染的土壤与水体环境的修复。

保藏说明：

波茨坦短芽孢杆菌(brevibacillusborstelensis)tyl2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年12月29日，保藏编号为cgmccno.17051，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为波茨坦短芽孢杆菌cgmccno.17051的生长曲线；

图2为优化条件下波茨坦短芽孢杆菌cgmccno.17051对泰乐菌素的降解；

图3污水中波茨坦短芽孢杆菌cgmccno.17051对泰乐菌素的降解。

具体实施方式

实施例1

泰乐菌素降解菌的分离与筛选

2017年11月20日从内蒙古自治区呼和浩特市托克托县中牧生物药业有限公司获得泰乐药渣样品，将采取的样品称取10g放在三角瓶中，加入90ml的磷酸盐缓冲液中，置于摇床中30℃、150rpm振荡2h，取出后静置。将上清液稀释到10^-5、10^-6、10^-7，吸取100μm上清液涂布到牛肉膏蛋白胨固体培养基(蛋白胨5g，nacl5g，牛肉膏3g，琼脂18g，蒸馏水定容至1000ml，用1mol/l氢氧化钠调节ph至7.0～7.2后灭菌。)中，在30℃恒温条件下培养3天。根据菌落生长速度、大小、形状、颜色等特征挑取菌落在牛肉膏蛋白胨固体培养基平板划线，重复多次，直至分离出单菌。保存在4℃冰箱中。

菌株降解功能验证

对纯化得到的单菌落进行活化培养，用牛肉膏蛋白胨培养基(蛋白胨5g，nacl5g，牛肉膏3g，蒸馏水定容至1000ml，用1mol/l氢氧化钠调节ph至7.0～7.2后灭菌。)活化培养2天，得到菌株培养液。取100μl培养液，分别涂布于以泰乐菌素为唯一碳源且泰乐菌素浓度为25mg/l的泰乐菌素无机盐固体培养基(无机盐固体培养基：nh4cl1g，nacl1g，k2hpo41.5g，kh2po40.5g，mgso40.2g，琼脂18g，蒸馏水1l，ph值调试到7.0)平板上，30℃遮光培养3天，按25mg/l的梯度逐渐提高培养基中泰乐菌素的浓度至100mg/l，培养同上。经驯化最终得到耐高浓度泰乐菌素的菌株，初步认定为对泰乐菌素具有降解能力的优势菌株。划线培养，于4℃冰箱内保存。

将分离纯化得到的高效菌进行活化，以1％(2×108cfu)的接种量接种到含有50mg/l的泰乐菌素培养基中30℃，150r/min培养7天，每隔2天取样一次，用高效液相色谱法测定各菌株对泰乐菌素的降解率，选择降解效果好的菌株。以不加菌为空白组，以上每个处理设置3个平行。

泰乐菌素含量测定

泰乐菌素储备液及标准溶液：称取0.05g泰乐菌素标准品，加入少量甲醇溶解，再转移到10ml的棕色定量瓶中，用甲醇定容，配置成5mg/ml的标准储备液。用储备液在配置成标准溶液(3.125、6.25、12.5、25、50、100、200mg/l)均用甲醇稀释而成。将配置好的溶液放置4℃冰箱中。

样品处理：取5ml样品加入8ml的乙腈和8ml正己烷，涡旋1min，超声3min，5000r/min离心10min，过0.2μm滤膜。

检测条件：采用alliance2695型高效液相色谱仪2998型pda检测器(美国waters公司)对泰乐菌素含量进行测定。色谱条件：色谱柱sunfirec18(150mm×4.6mm，3.5μm，waters，usa)；流动相为0.1％甲酸(a)：乙腈(b)＝70∶30；流速为1.0ml/min；柱温40℃；紫外检测器，检测波长为285nm；进样体积为10μl。

经过上述筛选，得到一株对泰乐菌素降解效果突出的菌株，编号为tyl2。

菌株tyl2的鉴定

形态观察及生理生化特征的鉴定

采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，所筛选的降解菌株tyl2在牛肉膏蛋白胨培养基上的生长形态为圆形、乳白色，边缘规则不透明，镜检观察到该菌为革兰氏阳性菌株，短棒状，光滑。并且该菌的生长最适温度35℃，最适ph为7，对降解菌进行部分生理生化实验操作，鉴定生理生化特征参照《常见细菌系统鉴定手册》，鉴定结果见表1：

表1菌株tyl2的生理生化特征

+:表示反应阳性；

-:表示反应阴性

菌株生长曲线测定

将菌株tyl2接种到培养基中，在30℃，150r/min条件下培养，每隔2h取1次样，采用分光光度法检测样品的od600值，以确定降解菌的生长量，绘制菌株的生长曲线(结果见图1)。

将菌株tyl2送到专业的鉴定机构(上海美吉生物医药科技有限公司)进行了测序鉴定，结果如下seqidno.1所示。

将16srdna基因序列与genbank中已登录的基因序列进行比对分析发现菌株与brevibacillusborstelensis具有最高的同源性达99％，结合以上结果该菌株为波茨坦短芽孢杆菌(brevibacillusborstelensis)，且为该菌命名为波茨坦短芽孢杆菌(brevibacillusborstelensis)tyl2将其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年12月29日，保藏编号为cgmccno.17051，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

实施例2

tyl2降解条件的优化测定

采用单因素试验确定泰乐降解菌去除泰乐菌素的最佳培养条件。测定的内容包括温度(25℃-45℃)、转速(90r/min-200r/min)、ph(5-11)、泰乐菌素浓度(25mg/l-150mg/l)、接种量(1％-10％)，培养时间为7天。以上每个处理设置3个平行。测定结果见图2。从图2中看出tyl2在35℃，150r/min，ph＝7，接种量为1.4×10⁹cfu/ml，泰乐菌素的浓度为25mg/l时，在优化条件下经7天处理后，降解率达到最高为75％左右。

实施例3

污水中泰乐菌素降解菌株tyl2降解效率测定

将筛选出高效的降解菌tyl2添加到污水样品中，在降解菌tyl2的最佳优化条件下培养7天，检测泰乐菌素的残留量。检测结果见图3。从图3种可以看到tyl2在优化的条件下，对污水中的泰乐菌素的降解可以达到60％以上。说明该菌可用于泰乐菌素的降解。该菌株tyl2及制成的菌剂可直接应用于泰乐菌素企业废弃物的处理，也可应用于周边被泰乐菌素污染的土壤与水体环境的修复。

序列表

<110>中国农业科学院农业资源与农业区划研究所

<120>一株泰乐菌素降解菌及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1405

<212>dna

<213>波茨坦短芽孢杆菌(brevibacillusborstelensis)

<400>1

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