作为JAK激酶抑制剂的吡唑并和三唑并双环化合物的制作方法
本发明是关于可用作jak激酶抑制剂和更特别是用作jak3抑制剂的吡唑并和三唑并双环化合物，所述jak3抑制剂相较于jak激酶家族的其它成员(例如jak1、jak2和tyk2)对jak3具选择性。本发明还关于晶型、包含这些化合物的医药组合物、使用这些化合物来治疗发炎性疾病的方法和可用于制备这些化合物的方法和中间体。
背景技术：
溃疡性结肠炎为结肠的慢性发炎性疾病。所述疾病的特征在于直肠和大肠的粘膜层的发炎和溃疡。常见症状包括腹泻、血便和腹痛。临床过程为间歇性，特点为交替的恶化期和缓解期。发病率似乎于发达国家中较发展中国家更高。于主要工业化国家中估计120万人患有溃疡性结肠炎且预期所述数字随着人口增长而增加。患有溃疡性结肠炎的患者有增加的罹患结肠直肠癌风险。(例如，丹尼斯(danese)等人，《新英格兰医学杂志》(nengljmed),2011,365,1713-1725)。虽然存在各种治疗选项以促进并维持患者的溃疡性结肠炎(uc)的缓解，但是没有一种是理想的。仍存在对促进并维持中度到严重uc的缓解而无由慢性、全身性免疫抑制导致的安全问题的有效疗法的未满足的医疗需求。
虽然uc的确切发病机理尚不清楚，但是显然促发炎细胞因子于免疫反应中起着关键作用(斯特罗伯(strober)等人，《胃肠病学》(gastroenterol),2011,140,1756-1767)。于uc中最常升高的许多促发炎细胞因子(例如，il-4、il-6、il-13、il-15、il-23、il-24、ifnγ和瘦素)依靠酪氨酸激酶的jak家族(即，jak1、jak2、jak3和tyk2)用于信号转导。
jak3酶的抑制阻断许多关键促发炎细胞因子的信号传导。因此jak3抑制剂可能可用于治疗溃疡性结肠炎和其它胃肠发炎性疾病(例如克罗恩氏病(crohn'sdisease)和免疫检查点抑制剂诱发的结肠炎)。jak3抑制剂也可能可用于治疗发炎性皮肤病(例如特应性皮肤炎)和发炎性呼吸病症(例如过敏性鼻炎、哮喘和慢性阻塞性肺病(copd))。此外，jak3抑制剂也可用于治疗发炎起着突出作用的许多眼部疾病(例如葡萄膜炎、糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、干眼病、年龄相关的黄斑变性、视网膜静脉阻塞(rvo)和特应性角膜结膜炎)。
预期超过jak1对jak3的选择性是有益的，因为存在jak3选择性允许保留以下潜在有益细胞因子的证据：例如涉及粘膜愈合的il-10、涉及粘液屏障保护和上皮再生的il-22和涉及肠上皮细胞增生的il-6。超过jak2对jak3的选择性也允许保留红细胞生成素(epo)和血小板生成素(tpo)信号传导。因此，期望提供新的化合物，所述化合物为超过jak激酶家族的其它成员(例如jak1、jak2和tyk2)的选择性jak3抑制剂。
最后，由于jak/stat路径对免疫系统的调节作用，全身暴露于jak抑制剂中可具有不利全身性免疫抑制作用。因此，期望提供新的jak3抑制剂，所述抑制剂在作用位点处具有其作用而无显著全身作用。特别是，对于治疗胃肠发炎性疾病(例如溃疡性结肠炎)，期望提供新的jak3抑制剂，所述抑制剂可口服投与且以最小全身暴露实现胃肠道的治疗上相关暴露。针对皮肤病，期望提供新的jak3抑制剂，所述抑制剂可以最小全身暴露对皮肤局部投与。
因此，期望提供新的化合物，所述化合物为超过jak激酶家族的其它成员(例如jak1、jak2和tyk2)的选择性jak3抑制剂且具有最小全身暴露。
技术实现要素：
在一个方面，本发明提供具有作为jak激酶抑制剂和更特别是作为jak3抑制剂的活性的新颖化合物。
因此，本发明提供一种式(i)化合物：
或其医药上可接受的盐，其中
x1和x2各自独立地选自n和ch；
x3是选自由以下组成的群：n、ch、c-ch3、c-cf3、c-chf2、c-ch2-o-ch3、c-sme、c-nme2、c-nh-ch3、c-cl、c-cn和c-ome；
ra、rb、rc和rf各自独立地选自由h和c1-3烷基组成的群；
rd、re、rg、rh、ri、rj、rl、rm、rn和ro各自独立地选自由h和c1-3烷基组成的群，其中所述c1-3烷基可任选地经1到3个卤素取代；
任选地rd和re能够结合以形成环丙基环；
a是选自由以下组成的群：
(a)含有一个氮原子和任选地含有选自n、s、s(o)2和o的一个额外杂原子的4到10元单环杂环基，和
(b)含有一个氮原子和任选地含有选自n、s和o的一个额外杂原子的6到10元多环杂环基，
其中l与a中的碳原子连接且a任选地经1到3个rk基团取代；
各rk是独立地选自由f、cn、c1-3烷氧基、环丙基和c1-3烷基组成的群，其中所述c1-3烷基可任选地经oh、ome或1到3个卤素取代；
r1是选自由以下组成的群：
其中rp和rq各自独立地选自由h、c3-5环烷基和c1-6烷基组成的群，其中所述c1-6烷基可任选地经独立地选自由c1-3烷氧基和-s-c1-3烷基组成的群的1到3个取代基取代，
或rp和rq形成含有一个氮原子和任选地含有选自n、s和o的一个额外杂原子的4到6元单环杂环基，其中所述4到6元单环杂环基任选地经独立地选自由c1-6烷基、c1-3烷氧基、-s-c1-3烷基和-c1-3烷基-c1-3烷氧基组成的群的1到3个取代基取代；
r2是选自由h、cl、ome、me和f组成的群；
r3是选自由h和f组成的群；
r4是选自由h和f组成的群；且
r5是选自由h、me和f组成的群。
本发明还提供某些化合物的一些晶型(1型、2型、2b型、3型和4型)。
本发明还提供一种医药组合物，其包含本发明的化合物或其医药上可接受的盐或本发明的晶型和医药上可接受的载剂。
本发明还提供一种治疗哺乳动物的胃肠发炎性疾病(特别是，溃疡性结肠炎)的方法，所述方法包括对所述哺乳动物投与本发明的化合物或其医药上可接受的盐或本发明的晶型或本发明的医药组合物。
本发明还提供一种治疗哺乳动物的皮肤的发炎性疾病或病症的方法，所述方法包括对所述哺乳动物的皮肤施用本发明的化合物或其医药上可接受的盐或本发明的医药组合物。
本发明还提供一种治疗哺乳动物的皮肤t-细胞淋巴瘤的方法，所述方法包括对所述哺乳动物的皮肤施用包含本发明的化合物或其医药上可接受的盐的医药组合物。
在另一方面，本发明还提供本文中所述方法，其可用于制备本发明的化合物。
本发明还提供如本文中所述用于医学治疗的本发明的化合物或其医药上可接受的盐和本发明的化合物或其医药上可接受的盐或其晶型于制造用于治疗哺乳动物的胃肠发炎性疾病或皮肤发炎性疾病的调配物或药剂中的用途。
附图说明
本发明的各种方面通过参考附图来说明。
图1显示化合物3的晶型1(以下1型)的粉末x-射线衍射(pxrd)图。
图2显示晶型1的示差扫描量热法(dsc)温谱图。
图3显示晶型1的热重分析(tga)图。
图4显示在约25℃的温度下观察到的晶型1的动态水分吸附(dms)等温线。
图5显示化合物3的晶型2(以下2型)的粉末x-射线衍射(pxrd)图。
图6显示晶型2的示差扫描量热法(dsc)温谱图。
图7显示晶型2的热重分析(tga)图。
图8显示在约25℃的温度下观察到的晶型2的动态水分吸附(dms)等温线。
图9显示化合物1的晶型3(以下3型)的粉末x-射线衍射(pxrd)图。
图10显示晶型3的示差扫描量热法(dsc)温谱图。
图11显示晶型3的热重分析(tga)图。
图12显示在约25℃的温度下观察到的晶型3的动态水分吸附(dms)等温线。
图13显示化合物1的晶型4(以下4型)的粉末x-射线衍射(pxrd)图。
图14显示晶型4的示差扫描量热法(dsc)温谱图。
图15显示晶型4的热重分析(tga)图。
图16显示在约25℃的温度下观察到的晶型4的动态水分吸附(dms)等温线。
图17显示化合物3的脱水晶型(以下2b型)的粉末x-射线衍射(pxrd)图。
具体实施方式
本发明尤其提供式(i)的jak激酶抑制剂(其超过jak激酶家族的其它成员(例如jak1、jak2和tyk2)对jak3具选择性)、其医药上可接受的盐和制备其的中间体。
在一方面，本发明提供具有作为jak激酶抑制剂(特别是作为jak3激酶抑制剂)的活性的新颖化合物。
因此，本发明提供一种式(i)化合物：
或其医药上可接受的盐，其中
x1和x2各自独立地选自n和ch；
x3是选自由以下组成的群：n、ch、c-ch3、c-cf3、c-chf2、c-ch2-o-ch3、c-sme、c-nme2、c-nh-ch3、c-cl、c-cn和c-ome；
ra、rb、rc和rf各自独立地选自由h和c1-3烷基组成的群；
rd、re、rg、rh、ri、rj、rl、rm、rn和ro各自独立地选自由h和c1-3烷基组成的群，其中所述c1-3烷基可任选地经1到3个卤素取代；任选地rd和re能够结合以形成环丙基环；
a是选自由以下组成的群：
(a)含有一个氮原子和任选地含有选自n、s、s(o)2和o的一个额外杂原子的4到10元单环杂环基，和
(b)含有一个氮原子和任选地含有选自n、s和o的一个额外杂原子的6到10元多环杂环基，
其中l与a中的碳原子连接且a任选地经1到3个rk基团取代；
各rk是独立地选自由f、cn、c1-3烷氧基、环丙基和c1-3烷基组成的群，其中所述c1-3烷基可任选地经oh、ome或1到3个卤素取代；
r1是选自由以下组成的群：
其中rp和rq各自独立地选自由h、c3-5环烷基和c1-6烷基组成的群，其中所述c1-6烷基可任选地经独立地选自由c1-3烷氧基和-s-c1-3烷基组成的群的1到3个取代基取代，
或rp和rq形成含有一个氮原子和任选地含有选自n、s和o的一个额外杂原子的4到6元单环杂环基，其中所述4到6元单环杂环基任选地经独立地选自由c1-6烷基、c1-3烷氧基、-s-c1-3烷基和-c1-3烷基-c1-3烷氧基组成的群的1到3个取代基取代；
r2是选自由h、cl、ome、me和f组成的群；
r3是选自由h和f组成的群；
r4是选自由h和f组成的群；且
r5是选自由h、me和f组成的群。
在一些实施例中，x3为ch。
在一些实施例中，rp和rq各自独立地选自由h、环丁基和c1-4烷基组成的群，其中所述c1-4烷基可任选地经独立地选自由c1-2烷氧基和-s-c1-2烷基组成的群的1或2个取代基取代，
或rp和rq形成含有一个氮原子和任选地含有选自s和o的一个额外杂原子的4到6元单环杂环基，其中所述4到6元单环杂环基任选地经独立地选自由c1-3烷基、c1-2烷氧基、-s-c1-2烷基和-c1-3烷基-c1-2烷氧基组成的群的1或2个取代基取代。
在一些实施例中，rp和rq各自独立地选自由h、环丁基和c1-4烷基组成的群，其中所述c1-4烷基可任选地经独立地选自由ome和-set组成的群的1或2个取代基取代，
或rp和rq形成含有一个氮原子和任选地含有选自s和o的一个额外杂原子的4到6元单环杂环基，其中所述4到6元单环杂环基任选地经独立地选自由me、ome、ch2ome和-sme组成的群的1或2个取代基取代。
在一些实施例中，r1是选自由以下组成的群：
在一些实施例中，r1为
在一些实施例中，r1为
在一些实施例中，r1为
所述6到10元多环杂环基可为螺环、稠合和/或桥接。
在一些实施例中，所述6到10元多环杂环基为螺环杂环基。在一些实施例中，所述6到10元多环杂环基为稠合杂环基。在一些实施例中，所述6到10元多环杂环基为桥接杂环基。
在一些实施例中，a是选自由以下组成的群：
(a)含有一个氮原子和任选地含有选自n、s、s(o)2和o的一个额外杂原子的4到8元单环杂环基，和
(b)含有一个氮原子和任选地含有选自n、s和o的一个额外杂原子的6到10元多环杂环基，
其中l与a中的碳原子连接且a任选地经1到3个rk基团取代。
在一些实施例中，a是选自由以下组成的群：
(a)含有一个氮原子和任选地含有选自n、s、s(o)2和o的一个额外杂原子的4到6元单环杂环基，和
(b)含有一个氮原子和任选地含有选自n、s和o的一个额外杂原子的6到10元多环杂环基，
其中l与a中的碳原子连接且a任选地经1到3个rk基团取代。
在一些实施例中，a是选自由以下组成的群：
(a)含有一个氮原子和任选地含有选自n、s、s(o)2和o的一个额外杂原子的4到6元单环杂环基，和
(b)含有一个氮原子和任选地含有选自n、s和o的一个额外杂原子的7或8元多环杂环基，
其中l与a中的碳原子连接且a任选地经1到3个rk基团取代。
在一些实施例中，a是选自由氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、吗啉、2-氮杂螺[3.3]庚烷、硫代吗啉和降莨菪烷组成的群。
在一些实施例中，
在一些实施例中，
在一些实施例中，x1和x2均为ch。在一些实施例中，x1为n且x2为ch。在一些实施例中，x1和x2均为n。在一些实施例中，x1为ch且x2为n。
在一些实施例中，r2为h。在一些实施例中，r2为f。在一些实施例中，r2为cl。在一些实施例中，r2为ome。在一些实施例中，r2为me。在一些实施例中，r3为h。在一些实施例中，r3为f。在一些实施例中，r4为h。在一些实施例中，r4为f。在一些实施例中，r5为h。在一些实施例中，r5为f。在一些实施例中，r5为me。
在一些实施例中，
在一些实施例中，
本发明还提供一种式(ii)化合物：
或其医药上可接受的盐，其中
x1和x2均为ch，或x1和x2均为n，或x1为n且x2为ch；
rc、rd和re各自独立地选自由h和甲基组成的群；
a是选自由氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶和吗啉组成的群；
其中l与a中的碳原子连接且a任选地经1到2个rk基团取代；各rk是独立地选自由f、cn、甲基、乙基和c1-2卤烷基组成的群；r1为
r2是选自由h、cl和f组成的群。
在一些实施例中，
在一些实施例中，r1为
在一些实施例中，所述化合物具有下式：
在一些实施例中，
在一些实施例中，
本发明还提供式(ia)或(iia)化合物或其医药上可接受的盐：
其中变量如以上实施例中所定义。
本发明还提供式(ib)或(iib)化合物或其医药上可接受的盐：
其中变量如以上实施例中所定义。
本发明还提供式(ic)或(iic)化合物或其医药上可接受的盐：
其中变量如以上实施例中所定义。
本发明还提供式(id)或(iid)化合物或其医药上可接受的盐：
其中变量如以上实施例中所定义。
本发明还提供式(ie)或(iie)化合物或其医药上可接受的盐：
其中变量如以上实施例中所定义。
本发明还提供式(if)、(iif)、(iiif)、(ivf)、(vf)、(vif)、(viif)或(viiif)化合物或其医药上可接受的盐：
其中变量如以上实施例中所定义。
本发明还提供选自由以下组成的群的化合物或其医药上可接受的盐：
本发明还提供具有式(b)的化合物或其医药上可接受的盐：
或其医药上可接受的盐，其中
x1和x2各自独立地选自n和ch；
rd和re各自独立地选自由h和c1-3烷基组成的群；任选地rd和re能够结合以形成环丙基环；
rk1是选自由h、f、cn、ome和c1-3烷基组成的群；
rk2是选自由h和甲基组成的群；
r1为
r2是选自由h、cl和f组成的群。
在一些实施例中，rd和re各自独立地选自由h和甲基组成的群；任选地rd和re能够结合以形成环丙基环；且rk1是选自由h、f、cn、ome、甲基和乙基组成的群。
本发明还提供具有式(c)的化合物或其医药上可接受的盐：
或其医药上可接受的盐，其中
x1和x2均为ch，或x1和x2均为n，或x1为n且x2为ch；
rd和re各自独立地选自由h和甲基组成的群；
rk是选自由h、cn、甲基和乙基组成的群；
r1为
r2是选自由h、cl和f组成的群。
在一些实施例中，所述化合物或其医药上可接受的盐是选自由以下组成的群：
本发明还提供具有下式的化合物或其医药上可接受的盐：
本发明还提供具有下式的化合物或其医药上可接受的盐：
本发明还提供具有下式的化合物或其医药上可接受的盐：
本发明还提供一种医药组合物，其包含本发明的化合物或其医药上可接受的盐或其晶型和医药上可接受的载剂。在一些实施例中，所述医药组合物另外包含一或多种其它治疗剂。在一些实施例中，所述一或多种其它治疗剂可用于治疗胃肠发炎性疾病、皮肤发炎性疾病、肺发炎性疾病或眼睛发炎性疾病。在一些实施例中，所述一或多种其它治疗剂可用于治疗胃肠发炎性疾病。于一些实施例中，所述胃肠发炎性疾病为溃疡性结肠炎。在一些实施例中，所述胃肠发炎性疾病为克罗恩氏病。
此外，一些化合物有时可呈互变异构形式存在。应了解，虽然以特定形式显示或命名结构，但是本发明还包括其互变异构体。
本发明的化合物可以含有一或多个手性中心和因此，这些化合物(和其中间体)可以呈以下存在：外消旋混合物、纯立体异构体(即，对映异构体或非对映异构体)、立体异构体浓化的混合物等。除非另有指示，否则在手性中心无限定的立体化学的本文中显示或命名的手性化合物意欲包含在未限定的立体中心的任何或所有可能立体异构体变体。特定立体异构体的描述或命名意指所指示立体中心具有指定立体化学，应了解，除非另有指示，否则还可存在少量的其它立体异构体，只要所描绘或命名的化合物的功效未因存在另一种立体异构体而消除。
本发明还包括经同位素标记的本发明化合物，例如，经同位素标记的式(i)、(ii)、(b)、(c)化合物、化合物1、化合物3、化合物4，即，本发明的化合物和式(i)、(ii)、(b)、(c)化合物、化合物1、化合物3、化合物4中原子经具有相同原子数但是与天然占优势的原子量不同的原子量的原子置换或浓化。可并入本发明的化合物和式(i)、(ii)、(b)、(c)化合物、化合物1、化合物3、化合物4中的同位素的实例包括但不限于2h、3h、11c、13c、14c、13n、15n、15o、17o、18o、35s和18f。特别受关注的是经氚或c-14浓化的本发明的化合物和式(i)、(ii)、(b)、(c)化合物、化合物1、化合物3和化合物4，所述化合物可(例如)用于组织分布研究。还特别受关注的是尤其在代谢位点处经氘浓化的本发明的化合物和式(i)、(ii)、(b)、(c)化合物、化合物1、化合物3和化合物4，预期所述化合物具有更高代谢稳定性。此外，特定受关注的是经正电子发射同位素(例如11c、18f、15o和13n)浓化的本发明的化合物和式(i)、(ii)、(b)、(c)化合物、化合物1、化合物3和化合物4，所述化合物可(例如)用于正电子发射断层摄影术(pet)研究。
定义
当描述本发明包括其各种方面和实施例时，除非另有指示，否则下列术语具有下列含义。
术语“烷基”意指单价饱和烃基，其可为直链或分支链或其组合。除非另有指定，否则这些烷基通常含有1到10个碳原子。代表性烷基包括(举例而言)甲基(me)、乙基(et)、正丙基(n-pr)或(npr)、异丙基(i-pr)或(ipr)、正丁基(n-bu)或(nbu)、仲丁基、异丁基、叔丁基(t-bu)或(tbu)、正戊基、正己基、2,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2-乙基丁基、2,2-二甲基戊基、2-丙基戊基等。
术语“卤烷基”指经一或多个卤素取代的如上所定义的烷基，例如，三氟甲基、二氟甲基、三氯甲基、2,2,2-三氟乙基、1,2-二氟乙基、3-溴-2-氟丙基、1,2-二溴乙基等。
当碳原子的特定数目意欲用于特定术语时，在所述术语前显示碳原子的数目。例如，术语“c1-3烷基”意指具有1到3个碳原子的烷基，其中所述碳原子呈任何化学上可接受的构型(包括直链或分支链构型)。
术语“烷氧基”意指单价基团-o-烷基，其中烷基如上所定义。代表性烷氧基包括(举例而言)甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等。
术语“环烷基”意指单价饱和碳环基，其可为单环或多环。除非另有指定，否则这些环烷基通常含有3到10个碳原子。代表性环烷基包括(举例而言)环丙基(cpr)、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、金刚烷基等。
术语“杂环(heterocycle/heterocyclic/heterocyclicring”意指具有3到10个总环原子的饱和或部分不饱和环状非芳族基团，其中所述环含有2到9个环碳原子和选自氮、氧和硫的1到4个环杂原子。杂环基可为单环或多环(即，稠合、螺或桥接)。当杂环基为多环时，所述环基中至少一者但未必所有含有杂原子。代表性杂环基包括(举例而言)吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、咪唑啶基、吗啉基、硫代吗啉基、吲哚啉-3-基、2-咪唑啉基、四氢吡喃基、1,2,3,4-四氢异喹啉-2-基、喹宁环基、7-氮杂降莰烷基、降莨菪烷等，其中连接点在任何可得碳或氮环原子处。在上下文使杂环基的连接点明显的情况下，这些基团或者可称作无价种类，即，吡咯烷、哌啶、哌嗪、咪唑、四氢吡喃等。
术语“治疗上有效量”意指当对需要治疗的患者投与时足以有效治疗的量。
如本文中所用，术语“治疗”意指患者(例如哺乳动物，特别是人类)的疾病、病症或医学病状(例如胃肠发炎性疾病)的治疗，其包括下列中的一或多者：
(a)预防所述疾病、病症或医学病状发生，即，预防所述疾病或医学病状的再发生或预先有所述疾病或医学病状倾向性的患者的预防性治疗；
(b)改善所述疾病、病症或医学病状，即，消除患者的所述疾病、病症或医学病状或造成其的消退(包括抵消其它治疗剂的作用)；
(c)抑制所述疾病、病症或医学病状，即，减慢或阻止患者的所述疾病、病症或医学病状的发展；或
(d)减轻患者的所述疾病、病症或医学病状的症状。
术语“医药上可接受的盐”意指可接受用于对患者或哺乳动物(例如人类)投与的盐(例如，针对给定剂量方案具有可接受的哺乳动物安全性的盐)。代表性医药上可接受的盐包括以下的盐：乙酸、抗坏血酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、乙二磺酸、富马酸、龙胆酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘磺酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2,6-二磺酸、烟碱酸、硝酸、乳清酸、双羟萘酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸和羟萘甲酸等。
术语“其盐”意指当酸的氢经阳离子(例如金属阳离子或有机阳离子等)置换时形成的化合物。例如，阳离子可为式(i)化合物的质子化形式，即，一或多个氨基已经酸质子化的形式。通常，所述盐为医药上可接受的盐，虽然这对于非意欲投与给患者的中间体化合物的盐并非必需。
术语“氨基保护基”意指适用于防止氨基氮处的非所需反应的保护基。代表性氨基保护基包括但不限于甲酰基、酰基(例如，烷酰基，例如乙酰基和三氟乙酰基)、烷氧羰基(例如叔丁氧羰基(boc))、芳基甲氧羰基(例如芐氧羰基(cbz)和9-芴甲氧羰基(fmoc))、芳甲基(例如苄基(bn)、三苯甲基(tr)和1,1-二-(4’-甲氧基苯基)甲基)、甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基(tms)、三异丙基甲硅烷基(tips)、叔丁基二甲基甲硅烷基(tbs或tbdms)、[2-(三甲基甲硅烷基)-乙氧基]甲基(sem))等。众多保护基和其引入和移除述于t.w.greene和p.g.m.wuts，《有机合成中的保护基团》(protectinggroupsinorganicsynthesis)，第三版，威利(wiley)，纽约中。
一般合成程序
本发明的化合物和其中间体可根据下列一般方法和程序使用市面上可购得或常规制备的起始物质和试剂制备。除非另有指示，否则下列反应图中所用的取代基和变量(例如，a、x1、x2、r1、r2、r3、ra、rb等)具有与本文中其它地方所定义那些相同的含义。此外，除非另有指示，否则可使用或可制备呈盐的具有酸性或碱性原子或官能基的化合物(于一些情况下，于特定反应中使用盐将需要在进行反应之前使用常规程序将盐转化成非盐形式(例如，游离碱))。
虽然本发明的特定实施例可于下列程序中显示或描述，但是本领域技术人员将知晓还可使用这些程序或通过使用为本领域技术人员已知的其它方法、试剂和起始物质制备本发明的其它实施例或方面。特别是，应了解可通过各种方法途径制备本发明的化合物，其中将反应物以不同次序组合以在产生最终产物的途中提供不同中间体。
于反应图1中说明制备本发明的最终化合物的一般方法，其中l选自：
反应图1
将起始物质p1(其中rx和ry为可为相同或不同的卤素)用保护基pg(例如四氢吡喃)保护以得到p2。然后p2与p3反应以得到p4。
p3可为：
其中rz为第二保护基，例如，boc。于此情况下，将p3用碱(例如nah)去质子化并与p2反应以得到p4。
或者，p3可为：
其中rz为第二保护基，例如，boc。于此情况下，p3在布赫瓦尔德(buchwald)偶合条件下(例如在pd(0)和碱的存在下)与p2反应以得到p4。或者，p3在碱(例如dipea)的存在下与p2反应以得到p4。
或者，p3可为：
其中rz为第二保护基，例如，boc。于此情况下，p3在pd(0)、9-bbn和碱的存在下与p2反应以形成p4。
p4在pd(0)和碱的存在下与硼酸p5偶合(铃木(suzuki)偶合)以得到p6。将p6脱去保护基以得到p7(当pg为四氢吡喃且rz为boc时，胺的同时脱去保护基在强酸(例如tfa或hcl)的存在下发生)。最后，将p7通过酰胺偶合(在偶合剂(例如hatu或羟基苯并三唑(hobt))的存在下与酸反应)或在碱(例如亨尼氏(hunig’s)碱)的存在下与酰氯反应衍生成酰胺。
于此反应图中，可修改反应的次序。例如，可在引入含a环的部分之前进行铃木(suzuki)偶合。此可(例如)为将含a环的部分通过布赫瓦尔德偶合引入的情况。
于此反应图中，氨基中的一者或两者的保护为任选的。可使用相同合成反应图而无一或两个氨基的氨基保护但是可提供较低产率。
可通过(例如)利用过一硫酸氢钾和碱性氧化铝氧化对应硫化物获得磺酰基连接基团。
因此，于一方法方面中，本发明提供一种制备式(i)化合物或其医药上可接受的盐的方法，
所述方法包括：
使式(iii)化合物：
与以下反应
(i)cl-r1，或
(ii)ho-r1，
其中r1、r2、r3、r4、x1、x2、l和a如上所定义，和
任选地形成医药上可接受的盐
以提供式(i)化合物或其医药上可接受的盐。
于单独且不同方面中，本发明提供式(iii)化合物，其中变量采用上述值中的任一者。
晶型
于一方面中，本发明提供下式化合物的晶型：
1型
本发明的晶型1为化合物3的结晶无水游离形式。于一方面中，1型是通过具有尤其在5.65±0.20、14.22±0.20、15.16±0.20和19.31±0.20的2θ值处的显著衍射峰的粉末x-射线衍射(pxrd)图表征。1型可进一步通过具有在7.12±0.20、10.02±0.20、11.16±0.20、17.06±0.20和24.43±0.20的2θ值处的额外衍射峰的pxrd图表征。1型可进一步通过具有在选自以下的2θ值处的两个或更多个额外衍射峰(包括三个或更多个和四个或更多个额外衍射峰)的pxrd图表征：13.10±0.20、14.82±0.20、16.55±0.20、20.08±0.20、21.08±0.20、21.65±0.20、22.51±0.20、22.98±0.20、25.02±0.20、25.72±0.20、26.80±0.20、27.06±0.20、28.31±0.20、30.08±0.20、30.31±0.20和32.08±0.20。1型是通过具有在选自以下的2θ值处的三个、四个、五个或六个衍射峰的pxrd图表征：5.65±0.20、7.12±0.20、10.02±0.20、11.16±0.20、14.22±0.20、15.16±0.20、17.06±0.20、19.31±0.20和24.43±0.20。
如粉末x-射线衍射的领域中所熟知，pxrd图的峰位置相较于相对峰高度对实验细节(例如样品制备和仪器几何形状的细节)相对较不敏感。因此，于一方面中，晶型1是通过粉末x-射线衍射图表征，其中峰位置大体上与图1中所示峰位置一致。
于另一方面中，晶型1是通过暴露于高温时的其行为表征。如图2中所证实，以10℃/分钟的加热速率记录的示差扫描量热法(dsc)迹线展示经识别为熔体转变的吸热热流的峰，其具有在约154.9℃处开始和在约162.9℃处的峰。熔化后立即接着分解。
晶型是通过以10℃/分钟的加热速率记录的示差扫描量热法迹线表征，其显示具有在约162.9℃处的峰的最大吸热热流。所述晶型是通过以10℃/分钟的加热速率记录的示差扫描量热法迹线表征，其显示具有在162.9±3℃处的峰的最大吸热热流。
所述晶型是通过以10℃/分钟的加热速率记录的示差扫描量热法迹线表征，其显示在约154.9℃与约171℃之间或在158℃与167℃之间的温度下的最大吸热热流。
图3中显示1型结晶游离形式的代表性tga迹线。热重分析(tga)迹线显示在100℃下小幅重量损失约0.14％。化合物在约175℃的起始温度下分解。
图4中显示1型结晶游离形式的代表性dms迹线。1型证实于5％到90％相对湿度的湿度范围中重量增加约1.62％。认为1型轻微吸湿。
1型可通过以下制备：将呈非晶型的化合物3溶解于乙醇中，接着在约20℃与约25℃之间的温度下搅拌，接着过滤和干燥以得到1型。任选地，可在干燥之前将固体用乙醇洗涤。
1型可通过以下制备：将丙酮添加到呈非晶型的所述化合物中并在约20℃与约25℃之间的温度下搅拌，接着添加晶种。将所得浆液过滤和干燥以得到1型。
2型
本发明的晶型2为化合物3的结晶水合物游离形式。于一方面中，2型是通过具有尤其在6.90±0.20、9.15±0.20、10.00±0.20和18.31±0.20的2θ值处的显著衍射峰的粉末x-射线衍射(pxrd)图表征。2型可进一步通过具有在11.18±0.20、15.51±0.20和20.90±0.20的2θ值处的额外衍射峰的pxrd图表征。2型可进一步通过具有在选自以下的2θ值处的两个或更多个额外衍射峰(包括三个或更多个和四个或更多个额外衍射峰)的pxrd图表征：12.76±0.20、13.33±0.20、13.82±0.20、14.43±0.20、16.04±0.20、17.00±0.20、17.90±0.20、22.06±0.20、22.51±0.20、25.00±0.20、26.92±0.20、27.26±0.20、27.61±0.20、29.37±0.20、30.53±0.20和30.92±0.20。2型是通过具有在选自以下的2θ值处的三个、四个、五个或六个衍射峰的pxrd图表征：6.90±0.20、9.15±0.20、10.00±0.20、11.18±0.20、15.51±0.20、18.31±0.20和20.90±0.20。
如粉末x-射线衍射的领域中所熟知，pxrd图的峰位置相较于相对峰高度对实验细节(例如样品制备和仪器几何形状的细节)相对较不敏感。因此，于一方面中，晶型2是通过粉末x-射线衍射图表征，其中峰位置大体上与图5中所示峰位置一致。
于另一方面中，晶型2是通过暴露于高温时的其行为表征。如图6中所证实，以10℃/分钟的加热速率记录的示差扫描量热法(dsc)迹线展示具有在约52.7℃处开始和在约84.4℃处的峰的脱溶剂化吸热，和具有在约160.0℃处开始和在约167.6℃处的峰的熔化吸热。熔化后立即接着分解。
图7中显示本发明的2型结晶游离形式的代表性tga迹线。图7的热重分析(tga)迹线显示在75℃下重量损失约6.73％。所述化合物在约25℃的起始温度下脱溶剂化。化合物在约185℃的起始温度下分解。
图8中显示本发明的2型结晶游离形式的代表性dms迹线。2型在高于65％的rh下转化成水合物(2b型)。脱水在15％以下的rh下发生。在5％与90％之间的rh下的总吸湿率为7.99％。
2型可通过以下制备：将呈非晶型的化合物3溶解于甲醇中，接着添加抗溶剂(例如水，以约1:2甲醇:水的比率)。任选地，将混合物超音波处理。然后将混合物在约20℃与约25℃之间的温度下搅拌约12到24小时。然后将2型通过过滤单离并干燥。任选地，可将固体用甲醇洗涤。
2型还可通过以下制备：通过于约10份体积的醇中完全溶解接着缓慢添加约8到10份体积的水直到浊点，来溶解于乙醇和水或甲醇和水中。添加2型的晶种以随时间缓慢形成浆液。缓慢添加更多水(约10份体积)以得到固体，可将所述固体过滤和干燥以得到2型。
2b型
本发明的晶型2b为化合物3的结晶脱水游离形式。于一方面中，2b型是通过具有尤其在7.61±0.20、16.76±0.20、17.90±0.20和20.67±0.20的2θ值处的显著衍射峰的粉末x-射线衍射(pxrd)图表征。2b型可进一步通过具有在10.33±0.20、11.25±0.20、12.71±0.20、15.88±0.20的2θ值处的额外衍射峰的pxrd图表征。2b型可进一步通过具有在选自以下的2θ值处的两个或更多个额外衍射峰(包括三个或更多个和四个或更多个额外衍射峰)的pxrd图表征：13.23±0.20、13.66±0.20、13.90±0.20、15.02±0.20、15.27±0.20、16.33±0.20、18.26±0.20、21.37±0.20、21.92±0.20、22.31±0.20、22.90±0.20、23.22±0.20、23.61±0.20、24.74±0.20、25.78±0.20、26.23±0.20、26.73±0.20、27.57±0.20、29.10±0.20、29.39±0.20、30.72±0.20、30.94±0.20、31.69±0.20、32.06±0.20、33.76±0.20和34.35±0.20。2b型是通过具有在选自以下的2θ值处的三个、四个、五个或六个衍射峰的pxrd图表征：7.61±0.20、10.33±0.20、11.25±0.20、12.71±0.20、15.88±0.20、16.76±0.20、17.90±0.20和20.67±0.20。
如粉末x-射线衍射的领域中所熟知，pxrd图的峰位置相较于相对峰高度对实验细节(例如样品制备和仪器几何形状的细节)相对较不敏感。因此，于一方面中，晶型2b是通过粉末x-射线衍射图表征，其中峰位置大体上与图17中所示峰位置一致。
于另一方面中，本发明提供下式化合物的晶型：
3型
本发明的晶型3为化合物1的结晶无水游离形式。于一方面中，3型是通过具有尤其在9.67±0.20、11.61±0.20、17.61±0.20、18.88±0.20和23.33±0.20的2θ值处的显著衍射峰的粉末x-射线衍射(pxrd)图表征。3型可进一步通过具有在4.82±0.20、15.69±0.20和16.19±0.20的2θ值处的额外衍射峰的pxrd图表征。3型可进一步通过具有在选自以下的2θ值处的两个或更多个额外衍射峰(包括三个或更多个和四个或更多个额外衍射峰)的pxrd图表征：11.92±0.20、12.98±0.20、13.23±0.20、16.45±0.20、16.67±0.20、19.39±0.20、19.96±0.20、20.14±0.20、22.14±0.20、23.84±0.20、24.06±0.20、24.29±0.20、25.31±0.20、25.63±0.20、27.06±0.20、27.31±0.20、30.10±0.20和30.53±0.20。3型是通过具有在选自以下的2θ值处的三个、四个、五个或六个衍射峰的pxrd图表征：4.82±0.20、9.67±0.20、11.61±0.20、15.69±0.20、16.19±0.20、17.61±0.20、18.88±0.20和23.33±0.20。
如粉末x-射线衍射的领域中所熟知，pxrd图的峰位置相较于相对峰高度对实验细节(例如样品制备和仪器几何形状的细节)相对较不敏感。因此，于一方面中，晶型3是通过粉末x-射线衍射图表征，其中峰位置大体上与图9中所示峰位置一致。
于另一方面中，晶型3是通过暴露于高温时的其行为表征。如图10中所证实，以10℃/分钟的加热速率记录的示差扫描量热法(dsc)迹线展示经识别为熔体转变的吸热热流的峰，其具有在约197.7℃处开始和在约201.3℃处的峰。熔化后立即接着分解。
所述晶型是通过以10℃/分钟的加热速率记录的示差扫描量热法迹线表征，其显示具有在201.3℃±2℃处的峰的最大吸热热流。
所述晶型是通过以10℃/分钟的加热速率记录的示差扫描量热法迹线表征，其显示在198℃与204℃之间的温度下的最大吸热热流。
图11中显示本发明的3型结晶游离形式的代表性tga迹线。图11的热重分析(tga)迹线显示在约195℃的分解开始以下的温度下无显著重量损失。
图12中显示本发明的3型结晶游离形式的代表性dms迹线。3型证实于5％到90％相对湿度的湿度范围中重量增加约0.33％。认为3型为非吸湿性。
3型可通过以下制备：将呈非晶型的化合物1悬浮于乙腈和异丙醇的1:1混合物中。将所得悬浮液在约50℃下搅拌约1天，过滤，任选地用乙腈和异丙醇的1:1混合物洗涤和干燥几小时以得到3型。
3型可通过以下制备：在约20℃与约25℃之间的温度下，将呈非晶型游离碱的化合物1溶解于ipa中。添加等量乙腈。可添加更多化合物直到形成饱和溶液。添加晶种并将混合物搅拌过夜。将形成的所产生的白色浆液过滤和干燥以得到3型。
4型
本发明的晶型4为化合物1的结晶水合物游离形式。于一方面中，4型是通过具有尤其在6.26±0.20、16.55±0.20、16.94±0.20、18.33±0.20、23.61±0.20和24.24±0.20的2θ值处的显著衍射峰的粉末x-射线衍射(pxrd)图表征。4型可进一步通过具有在11.86±0.20、12.51±0.20、13.16±0.20和14.98±0.20的2θ值处的额外衍射峰的pxrd图表征。4型可进一步通过具有在选自以下的2θ值处的两个或更多个额外衍射峰(包括三个或更多个和四个或更多个额外衍射峰)的pxrd图表征：17.61±0.20、18.78±0.20、19.39±0.20、19.57±0.20、19.84±0.20、21.45±0.20、21.82±0.20、22.57±0.20、24.67±0.20、25.10±0.20、25.39±0.20、27.19±0.20、27.39±0.20、28.55±0.20和31.51±0.20。4型是通过具有在选自以下的2θ值处的三个、四个、五个或六个衍射峰的pxrd图表征：6.26±0.20、11.86±0.20、12.51±0.20、13.16±0.20、14.98±0.20、16.55±0.20、16.94±0.20、18.33±0.20、23.61±0.20和24.24±0.20。
如粉末x-射线衍射的领域中所熟知，pxrd图的峰位置相较于相对峰高度对实验细节(例如样品制备和仪器几何形状的细节)相对较不敏感。因此，于一方面中，晶型4是通过粉末x-射线衍射图表征，其中峰位置大体上与图13中所示峰位置一致。
于另一方面中，晶型4是通过暴露于高温时的其行为表征。如图14中所证实，以10℃/分钟的加热速率记录的示差扫描量热法(dsc)迹线展示具有在约60.9℃处开始和在约103.6℃处的峰的脱溶剂化吸热，和特征为在约167.6℃处开始的熔化吸热。化合物在熔化时分解和熔化吸热与分解吸热重迭。
图15中显示本发明的4型结晶游离形式的代表性tga迹线。图15的热重分析(tga)迹线显示在100℃下重量损失约3.54％。化合物在约50℃的起始温度下脱溶剂化。化合物在约165℃的起始温度下分解。
图16中显示本发明的4型结晶游离形式的代表性dms迹线。4型证实于5％到90％相对湿度的湿度范围下重量增加约5.01％。认为4型为中等吸湿性。
4型的制法可由化合物1悬浮于水中。将所得悬浮液在约50℃下搅拌约1到2天，过滤，任选地用水洗涤，和在约20℃与约25℃之间的温度下干燥约2到6小时以得到4型。
或者，4型可通过以下制备：通过于约10份体积的醇中完全溶解接着缓慢添加约8到10份体积的水直到浊点，将化合物1溶解于乙醇和水或甲醇和水中。添加4型的晶种并随时间缓慢形成所得浆液。然后缓慢添加更多水(约10份体积)并将固体过滤和干燥以得到4型。
医药组合物
本发明的化合物和其医药上可接受的盐通常以医药组合物或调配物的形式使用。这些医药组合物可通过任何可接受的投与途径对患者投与，所述途径包括但不限于口服、局部(包括经皮)、直肠、鼻、吸入和肠胃外的投与模式。
因此，于其组合物方面中的一者中，本发明是关于包含医药上可接受的载剂或赋形剂和式(i)、(ii)、(b)、(c)化合物、化合物1、化合物3或化合物4或其医药上可接受的盐的医药组合物。任选地，若所需，则这些医药组合物可以含有其它治疗剂和/或调配剂。当讨论组合物和其用途时，本文中“本发明的化合物(compoundoftheinvention/compoundofthedisclosure)”还可称作“活性剂”。如本文中所用，术语“本发明的化合物”意欲包括式(i)、(ii)、(b)、(c)、(ia)、(iia)、(ib)、(iib)、(ic)、(iic)、(id)、(iid)、(ie)、(iie)、(if)、(iif)、(iiif)、(ivf)、(vf)、(vif)、(viif)和(viiif)所涵盖的所有化合物和其医药上可接受的盐。
本发明的医药组合物通常含有治疗上有效量的本发明的化合物。然而，本领域技术人员将知晓医药组合物可以含有多于治疗上有效量(即，散装组合物)或少于治疗上有效量(即，针对多次投与设计的个别单位剂量)以达成治疗上有效量。
通常，这些医药组合物将含有约0.1到约95重量％的活性剂(包括约5到约70重量％的活性剂)。
于本发明的医药组合物中可使用任何习知载剂或赋形剂。特定载剂或赋形剂或载剂或赋形剂的组合的选择将取决于治疗特定患者或医学病状的类型或疾病状态所用的投与模式。就此而言，用于特定投与模式的适宜医药组合物的制法适当地于熟习医药技术者的范围内。此外，于本发明的医药组合物中所用的载剂或赋形剂可自市面上购得的。进一步说明而言，习知调配技术述于《雷明顿：药学科学与实践》(remington:thescienceandpracticeofpharmacy)，第20版，利平科特威廉姆斯.威尔金斯(lippincottwilliams&white)，巴尔的摩，马里兰州(2000)；和h.c.安塞尔等人，《药物剂型与给药系统》(pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems)，第7版，利平科特威廉姆斯.威尔金斯，巴尔的摩，马里兰州(1999)中。
可用作医药上可接受的载剂的物质的代表性实例包括但不限于下列：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素(例如微晶纤维素)和其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月硅酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液(ringer'ssolution)；乙醇；磷酸盐缓冲液；和于医药组合物中采用的其它无毒兼容性物质。
医药组合物通常通过将活性剂与医药上可接受的载剂和一或多种可选成分彻底且密切混合或掺合来制备。然后可使用习知程序和设备将所得均匀掺合的混合物整形或装载于锭剂、胶囊、丸剂等中。
本发明的医药组合物优选地呈单位剂型包装。术语“单位剂型”指适用于对患者给药的物理上离散单元，即，各单元含有经计算以单独或与一或多个额外单元组合产生所需治疗效果的预定量的活性剂。例如，这些单位剂型可为胶囊、锭剂、丸剂等或适用于肠胃外投与的单位包装。
于一实施例中，本发明的医药组合物适用于口服投与。用于口服投与的适宜医药组合物可为呈胶囊、丸剂、口含锭、扁囊剂、糖衣丸、粉剂、颗粒形式；或呈于水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或呈水包油或油包水乳液；或呈酏剂或糖浆等；各者含有预定量的本发明的化合物作为活性成分。
当意欲呈固体剂型(即，如胶囊、锭剂、丸剂等)用于口服投与时，本发明的医药组合物通常将包含活性剂和一或多种医药上可接受的载剂。任选地，这些固体剂型可包含：填料或增量剂，例如淀粉、微晶纤维素、乳糖、磷酸氢钙、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；保湿剂，例如甘油；崩解剂，例如交联羧甲基纤维素钠、琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和/或碳酸钠；溶液阻滞剂，例如石蜡；吸收促进剂，例如季铵化合物；润湿剂，例如鲸蜡醇和/或单硬脂酸甘油酯；吸收剂，例如高岭土和/或膨润土；润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠和/或其混合物；着色剂和缓冲剂。
释放剂、润湿剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂还可存在于本发明的医药组合物中。医药上可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸、山梨醇、酒石酸、磷酸等。用于锭剂、胶囊、丸剂等的包衣剂包括用于肠包衣的那些，例如邻苯二甲酸乙酸纤维素、聚乙烯乙酸邻苯二甲酸酯、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯共聚物、偏苯三甲酸乙酸纤维素、羧甲基乙基纤维素、琥珀酸乙酸羟丙基甲基纤维素等。
还可使用变化比例的(举例而言)羟丙基甲基纤维素或其它聚合物基质、脂质体和/或微球体调配本发明的医药组合物以提供活性剂的缓慢或可控释放。此外，本发明的医药组合物可任选地含有遮光剂和可经调配使得其任选地以延迟方式仅或优先地于胃肠道的某个部分中释放活性成分。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物和蜡。活性剂还可呈微胶囊形式，若适宜，则利用上述赋形剂中的一或多者。
用于口服投与的适宜液体剂型包括(说明而言)医药上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、浆液和酏剂。液体剂型通常包含活性剂和惰性稀释剂(例如，例如，水或其它溶剂)、增溶剂和乳化剂(例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(例如，棉籽油、花生油、玉米油、胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、油酸、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯和其混合物)。或者，某些液体调配物可(例如)通过喷雾干燥转变成粉末，所述粉末用于通过习知程序制备固体剂型。
悬浮液(除了活性成分外)可以含有悬浮剂，例如例如，乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶和其混合物。
本发明的化合物或其医药上可接受的盐还可以肠胃外投与(例如，通过静脉内、皮下、肌肉内或腹膜内注射)。针对肠胃外投与，通常将活性剂与用于肠胃外投与的适宜媒剂混合，所述媒剂包括(举例而言)无菌水溶液、盐水、低分子量醇(例如丙二醇)、聚乙二醇、植物油、明胶、脂肪酸酯(例如油酸乙酯)等。肠胃外调配物还可以含有一或多种抗氧化剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂或分散剂。还可使用无菌可注射介质、杀菌剂、过滤、照射或加热使这些调配物成为无菌的。
或者，本发明的医药组合物经调配用于通过吸入投与。通过吸入投与的适宜医药组合物通常将呈气溶胶或粉末形式。这些组合物一般使用熟知递送装置(例如定剂量吸入器、干粉吸入器、喷雾器或类似递送装置)投与。
当使用增压容器通过吸入投与时，本发明的医药组合物通常将包含活性成分和适宜推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适宜气体)。此外，医药组合物可呈胶囊或药筒(例如，自明胶制得)形式，其包含本发明的化合物和适用于粉末吸入器的粉末。适宜粉末基质包括(举例而言)乳糖或淀粉。
本发明的化合物或其医药上可接受的盐还可经调配呈软膏或乳霜用于对皮肤局部投与。软膏调配物为具有通常透明的油性或油脂物质基质的半固体制剂。用于软膏调配物的适宜油性物质包括石蜡脂(石油胶状物)、蜂蜡、可可脂、牛油树油脂和鲸蜡醇。若所需，则软膏任选地可另外包含润肤剂和渗透促进剂。
乳霜调配物可呈乳液制备，其包含油相和水相，通常包含纯化水。乳霜调配物的组分可包含：油基，例如石蜡脂、矿物油、植物油和动物油和三酸甘油酯；乳霜基，例如羊毛脂醇、硬脂酸和十六十八醇；凝胶基，例如聚乙烯醇；溶剂，例如丙二醇和聚乙二醇；乳化剂，例如聚山梨醇酯、硬脂酸酯(硬脂酸甘油酯、羟基硬脂酸辛酯、聚乙二醇硬脂酸酯、peg硬脂酸酯、棕榈酸异丙酯和单硬脂酸脱水山梨糖醇酯)；增溶剂，例如多醣和亚硫酸钠；润肤剂(即，保湿剂)，例如中链三酸甘油酯、豆蔻酸异丙酯和二甲基硅油；硬化剂，例如鲸蜡醇和硬脂醇；抗菌剂，例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯氧乙醇、山梨酸、重氮烷基脲和丁基化羟基茴香醚；渗透促进剂，例如n-甲基吡咯烷酮、丙二醇、单月桂酸聚乙二醇酯等；和螯合剂，例如乙二胺四乙酸二钠。
下列非限制性实例说明本发明的代表性医药组合物。
锭剂口服固体剂型
将本发明的化合物或其医药上可接受的盐与微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和交联羧甲基纤维素钠以4:5:1:1的比率干掺合和压实成锭剂以提供(例如)5mg、20mg或40mg活性剂/锭剂的单位剂量。
胶囊口服固体剂型
将本发明的化合物或其医药上可接受的盐与微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和交联羧甲基纤维素钠通过湿法造粒以4:5:1:1的比率组合和装入明胶或羟丙基甲基纤维素胶囊中以提供(例如)5mg、20mg或40mg活性剂/胶囊的单位剂量。
液体调配物
通过添加本发明的化合物到水和抗坏血酸的混合物中形成包含本发明的化合物(0.1％)、水(98.9％)和抗坏血酸(1.0％)的液体调配物。
经肠包衣的口服剂型
将本发明的化合物溶解于含有聚乙烯吡咯烷酮的水溶液中并以1:5w/w活性剂:珠粒的比率喷雾涂覆在微晶纤维素或糖珠上并且然后施覆约5％重量增加的包含丙烯酸共聚物(例如，以商标名称
经肠包衣的口服剂型
将包含
用于局部投与的软膏调配物
将本发明的化合物与石蜡脂、c8-c10三酸甘油酯、羟基硬脂酸辛酯和n-甲基吡咯烷酮以某一比率组合以提供含有0.05重量％到5重量％活性剂的组合物。
用于局部投与的软膏调配物
将本发明的化合物与白石蜡脂、丙二醇、单酸甘油酯和二酸甘油酯、石蜡、丁基化羟基甲苯和依地酸钙二钠以某一比率组合以提供含有0.05重量％到5重量％活性剂的组合物。
用于局部投与的软膏调配物
将本发明的化合物与矿物油、石蜡、碳酸丙二酯、白石蜡脂和白蜡组合以提供含有0.05重量％到5重量％活性剂的组合物。
用于局部投与的乳霜调配物
将矿物油与本发明的化合物、丙二醇、棕榈酸异丙酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡醇、单硬脂酸脱水山梨糖醇酯、聚乙二醇40硬脂酸酯、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯组合以形成油相，将其通过剪切掺合与纯化水组合以提供含有0.05重量％到5重量％活性剂的组合物。
用于局部投与的乳霜调配物
包含本发明的化合物、苄醇、鲸蜡醇、无水柠檬酸、单酸甘油酯和二酸甘油酯、油醇、丙二醇、鲸腊硬脂基硫酸钠、氢氧化钠、硬脂醇、三酸甘油酯和水的乳霜调配物含有0.05重量％到5重量％活性剂。
用于局部投与的乳霜调配物
包含本发明的化合物、鲸腊硬脂醇、豆蔻酸异丙酯、丙二醇、聚西托醇(cetomacrogol)1000、二甲基硅油360、柠檬酸、柠檬酸钠和纯化水的乳霜调配物(其中咪唑烷基脲、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂)含有0.05重量％到5重量％活性剂。
功效
jak3的抑制阻断许多关键促发炎性细胞因子的信号传导。因此期望本发明的化合物可用于治疗发炎性疾病。
本发明的化合物经设计为超过jak1、jak2和tyk2对jak3具选择性。预期超过jak1对jak3的选择性是有益的，因为存在jak3选择性允许保留以下潜在有益细胞因子的一些证据：例如涉及粘膜愈合的il-10、涉及粘液屏障保护和上皮再生的il-22和涉及肠上皮细胞增生的il-6。超过jak2对jak3的选择性允许保留红细胞生成素(epo)和血小板生成素(tpo)信号传导。
不希望受此理论限制，本发明的化合物具有可与存在于jak3中的半胱氨酸(cys909)形成共价键的亲电部分，cys909为在其它三种jak同功异型物中由丝氨酸置换的残基(哥德肯(goedken)等人，《生物化学杂志》(jbiolchem.),2015,290,8,4573-89)。与jak3的此共价结合可因提供扩展的靶接合而有益，其可在更佳功效方面转译。如实验部分中所述，已获得共价结合到人类jak3的化合物1、3和4的共晶体结构，其证实这些配体各者对jak3的不可逆结合性质。
本发明的一些化合物经设计以在作用位点具有其作用而无显著全身作用，从而避免潜在不利全身性免疫抑制作用。
胃肠发炎性疾病
除了提供jak3的强效抑制外，本发明的一些化合物经设计为差吸收以最小化全身暴露。这些化合物经设计以在作用位点(例如，于结肠中)具有其作用。如检定6中所述，某些化合物展示具有小于约5x10-6cm/sec的kp值的低渗透性，认为其有利于最小化全身暴露和靶向结肠。某些化合物具有小于约10x10-6cm/sec的kp值，其还可足以最小化全身暴露和靶向结肠。如下检定7中所述，化合物1、2、3、4、6、7、8、21和22展示口服投与后结肠中的暴露对血浆中的暴露的比率大于约1250。化合物9、5、19和20展示结肠对血浆比率超过约200。
恶唑酮诱发的结肠炎为具有组织上类似于人类溃疡性结肠炎的实验模型。如检定8中所述，化合物1、2、3、4、5、6、7、8、3-11、5-10、19、15-1、3-55、3-34、15-3、21、3-80、3-81、3-72、3-57、3-113和3-74证实于小鼠的恶唑酮诱发的结肠炎模型中的活性。另外，当于检定9(一种探测全身功能活性的小鼠的免疫抑制模型)中测试时，在证实恶唑酮模型的功效所需的相同或更高剂量下，脾nk细胞计数不受化合物1、2、4、5和8影响。
最后，显示化合物1、2、3、4、5、6、7和8证实于胸腺中的il-2诱导的pstat5诱导的鼠模型中缺少全身活性。
因此，这些化合物证实于临床前模型中的抗结肠炎活性而不展示全身作用。
预期高的结肠对血浆比率将提供稳健、鲁米那驱动的抗发炎活性而无相关全身性驱动的不良反应。这些化合物可用于各种胃肠发炎性适应症，其包括但不限于发炎性肠病、溃疡性结肠炎(直肠乙状结肠炎、全结肠炎、溃疡性直肠炎和左侧结肠炎)、克罗恩氏病、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、白塞氏病、乳糜泻、免疫检查点抑制剂剂诱发的结肠炎、回肠炎、嗜酸细胞性食道炎、移植物抗宿主病相关的结肠炎和感染性结肠炎。溃疡性结肠炎(雷蒙德(reimund)等人，《临床免疫学杂志》(jclinimmunology),1996,16,144-150)、克罗恩氏病(沃尔德(woywodt)等人，《欧洲胃肠病学肝病杂志》(eurjgastroenterologyhepatology),1999,11,267-276)、胶原性结肠炎(库马瓦特(kumawat)等人，《分子免疫学》(molimmunology),2013,55,355-364)、淋巴细胞性结肠炎(库马瓦特等人，2013)、嗜酸细胞性食道炎(威布朗-古奇伯格(weinbrand-goichberg)等人，《免疫反应》(immunolres),2013,56,249-260)、移植物抗宿主病相关的结肠炎(格希尔(coghill)等人，《血液》(blood),2001,117,3268-3276)、感染性结肠炎(施塔马赫(stallmach)等人，《国际大肠疾病杂志》(intjcolorectaldis),2004,19,308-315)、白塞氏病(周等人，《自身免疫综述》(autoimmunrev),2012,11,699-704)、乳糜泻(德尼托(denitto)等人，《世界胃肠病学》(worldjgastroenterol),2009,15,4609-4614)、免疫检查点抑制剂诱发的结肠炎(例如，ctla-4抑制剂诱发的结肠炎(矢野(yano)等人，《转化医学杂志》(jtranslationmed),2014,12,191)、pd-1抑制剂或pd-l1抑制剂诱发的结肠炎)和回肠炎(山本(yamamoto)等人，《消化系统和肝脏疾病》(digliverdis),2008,40,253-259)的特征在于某些促发炎性细胞因子水平的上升。因为许多促发炎性细胞因子经由jak激活信号传导，所以本申请案中所述化合物可减轻炎症且提供症状缓解。
特别是，本发明的化合物可用于诱导并维持溃疡性结肠炎的缓解并用于治疗克罗恩氏病、免疫检查点抑制剂诱发的结肠炎和移植物抗宿主病中的胃肠副作用。
因此，于一方面中，本发明提供一种治疗哺乳动物(例如，人类)的胃肠发炎性疾病的方法，所述方法包括对所述哺乳动物投与本发明的化合物或其医药上可接受的盐，或包含医药上可接受的载剂和本发明的化合物或其医药上可接受的盐的医药组合物。
本发明进一步提供一种治疗哺乳动物的溃疡性结肠炎的方法，所述方法包括对所述哺乳动物投与本发明的化合物或其医药上可接受的盐，或包含医药上可接受的载剂和本发明的化合物或其医药上可接受的盐的医药组合物。
当用于治疗溃疡性结肠炎时，本发明的化合物或其医药上可接受的盐通常将以单一每日剂量或以每天多个剂量口服投与，但是可使用其它投与形式。每剂量投与的活性剂的量或每天投与的总量通常将由医师根据相关情况确定，所述情况包括所治疗的病状、所选投与途径、投与的实际化合物和其相对活性、个别患者的年龄、体重和反应、患者的症状的严重度等。
预期用于治疗溃疡性结肠炎和其它胃肠发炎性病症的适宜剂量范围为针对平均70kg人类约1到约400mg/天的活性剂(包括约5到约300mg/天和约20到约70mg/天的活性剂)。
组合疗法
本发明的化合物或其医药上可接受的盐还可与一或多种药剂组合使用，所述一或多种药剂通过相同机理或不同机理作用以达到治疗胃肠发炎性病症。可依序或同时(于分开组合物中或于相同组合物中)投与不同药剂。用于组合疗法的有用药剂类别包括但不限于氨基水杨酸酯、类固醇、全身性免疫抑制剂、抗tnfα抗体、tnfα配体抑制剂、tnf结合剂、抗vla-4抗体、抗整合素α4β7抗体、抗细菌剂、糖皮质激素促效剂、核因子κb抑制剂、5-脂氧合酶抑制剂、整合素α-4/β-7拮抗剂、环氧合酶抑制剂、il-23拮抗剂、白细胞三烯blt受体拮抗剂、il-6拮抗剂、il-8拮抗剂、整合素拮抗剂、烟碱乙酰胆碱受体促效剂、pparγ促效剂、鞘胺醇-1-磷酸酯受体-1调节剂、b-淋巴细胞抗原cd20抑制剂、钙调神经磷酸酶抑制剂、cd3拮抗剂、细胞粘附分子抑制剂、嗜酸性粒细胞性过氧化酶抑制剂、肝素促效剂、icam1基因抑制剂、il-13拮抗剂、il-2受体α亚单位抑制剂、胰岛素增敏剂、干扰素β配体、干扰素γ受体拮抗剂、白细胞介素-1β配体调节剂、madcam抑制剂、pde4抑制剂、鞘胺醇-1-磷酸酯受体-1促效剂、tlr-9促效剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂、acth受体促效剂、活化素受体拮抗剂、ccr5趋化因子拮抗剂、ccr9趋化因子拮抗剂和抗腹泻药剂。
可与本发明jak抑制剂化合物组合使用的氨基水杨酸酯包括但不限于马色拉嗪(mesalamine)、奥色拉嗪(osalazine)和柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)。类固醇的实例包括但不限于泼尼松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)、羟基可的松(hydrocortisone)、布地奈德(budesonide)、倍氯米松(beclomethasone)和氟替卡松(fluticasone)。可用于治疗发炎性病症的全身性免疫抑制剂包括但不限于环孢霉素(cyclosporine)、咪唑硫嘌呤(azathioprine)、氨甲喋呤(methotrexate)、6-巯基嘌呤和他克莫司(tacrolimus)。另外，抗tnfα抗体(其包括但不限于英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、戈利木单抗(golimumab)和赛妥珠单抗(certolizumab))可用于组合疗法中。通过其它机理作用的有用化合物包括抗vla-4抗体(例如那他珠单抗(natalizumab))、抗整合素α4β7抗体(例如维多珠单抗(vedolizumab))、抗细菌剂(例如利福昔明(rifaximin))和抗腹泻药剂(例如洛派丁胺(loperamide))。(莫扎法里(mozaffari)等人，《生物治疗专家意见》(expertopin.biol.ther.)2014,14,583-600；丹尼斯(danese),《肠病学》(gut),2012,61,918-932；兰(lam)等人，《免疫疗法》(immunotherapy),2014,6,963-971。)
可与本发明jak抑制剂化合物组合使用的其它化合物包括但不限于奥帕加尼(opaganib)、阿巴西普(abatacept)、蒙格森(mongersen)、菲尔替尼(filgotinib)、lyc-30937、bi-655130、米瑞单抗(mirikizumab)、阿达木单抗、他克莫司、利妥昔单抗(rituximab)、gsk-2982772、安德昔单抗(andecaliximab)、纳曲酮(naltrexone)、瑞萨单抗(risankizumab)、qbeco、阿里卡福森(alicaforsen)、依曲利单抗(etrolizumab)、福拉木单抗(foralumab)、奥克里西单抗(ocrelizumab)、维多珠单抗、阿米莫德(amiselimod)、奥扎莫德(ozanimod)、朵堪那替(dolcanatide)、卡曲得考(catridecacog)、布地奈德、stnm-01、大麻二醇、特罗司他依替拉(telotristatetiprate)、shp-647、甲基卡特格拉斯特(carotegrastmethyl)、peg-伊洛白介素(ilodecakin)、top-1288、伊伯加斯特(iberogast)n、pf-06480605、培氟替尼(peficitinib)、倍氯米松、重组干扰素β-1a、英夫利昔单抗、戈利木单抗、曲洛单抗(tralokinumab)、乌司他单抗(ustekinumab)、塞妥珠单抗聚乙二醇、沙利度胺(thalidomide)、乌帕替尼(upadacitinib)、阿普斯特(apremilast)、那他珠单抗、干扰素β-1a、利福昔明、rbx-2660、艾曲莫德(etrasimod)、齐留通(zileuton)、芬戈莫德(fingolimod)、可必利莫(cobitolimod)、罗哌卡因(ropivacaine)、abx-464、pf-06700841、泼尼松龙、glpg-0974、缬更昔洛韦(valganciclovir)、环孢素(ciclosporin)、vb-201、妥仑西普(tulinercept)、mdgn-002、ptg-100、地塞米松(dexamethasone)、ged-0507-34-levo、柏替木单抗(bertilimumab)、布拉单抗(brazikumab)、khk-4083、罗西格列酮(rosiglitazone)、莫拉维莫德(mocravimod)、司曲吐瑞(sotrastaurin)、kag-308、pur-0110、e-6007、巴柳氮(balsalazide)、巴利昔单抗(basiliximab)、lp-02、asp-3291、猪鞭虫卵、k(d)pt、米地玛(midismase)、dnvx-078、伐他珠单抗(vatelizumab)、艾奎尔(alequel)、低分子量肝素、甲基脑啡肽(metenkefalin)、促皮质素(tridecactide)、hmpl-004、sb-012、奥色拉嗪(olsalazine)、巴柳氮、丙酰-l-肉毒碱、酪酸梭状芽胞杆菌(clostridiumbutyricum)、倍氯米松和乙酰吗喃(acemannan)。
因此，于另一方面中，本发明提供用于治疗胃肠发炎性病症的治疗组合，所述组合包含本发明的化合物或其医药上可接受的盐和可用于治疗胃肠发炎性病症的一或多种其它治疗剂，例如上述者。例如，本发明提供一种组合，其包含本发明的化合物或其医药上可接受的盐和选自以下的一或多种药剂：氨基水杨酸酯、类固醇、全身性免疫抑制剂、抗tnfα抗体、抗vla-4抗体、抗整合素α4β7抗体、抗细菌剂和抗腹泻药剂。第二药剂(当包含时)以治疗上有效量(即，当与本发明的化合物或其医药上可接受的盐共投与时，以产生治疗上有益效果的任何量)存在。
因此，还提供一种医药组合物，其包含本发明的化合物或其医药上可接受的盐或其晶型和可用于治疗胃肠发炎性病症的一或多种其它治疗剂。
另外，于一方法方面中，本发明提供一种治疗胃肠发炎性病症的方法，所述方法包括对哺乳动物投与本发明的化合物或其医药上可接受的盐或其晶型和可用于治疗胃肠发炎性病症的一或多种其它治疗剂。
当用于组合疗法时，所述药剂可于单一医药组合物中调配，如上所揭示，或所述药剂可于通过相同或不同投与途径同时或分开时间投与的分开组合物中提供。当分开投与时，所述药剂经足够近的时间投与以便提供所需治疗效果。这些组合物可分开包装或可呈试剂盒包装在一起。试剂盒中的两种或更多种治疗剂可通过相同投与途径或通过不同投与途径投与。
发炎性皮肤病
特应性皮肤炎和其它发炎性皮肤病与依靠jak-stat路径的促发炎性细胞因子的上升相关。因此，本发明的化合物或其医药上可接受的盐或其晶型于许多皮肤炎症或瘙痒病状中可为有益的，所述病症包括但不限于特应性皮肤炎、斑秃、白癜风、牛皮癣、皮肌炎、皮肤t细胞淋巴瘤(奈琴普洛克(netchiporouk)等人，《细胞周期》(cellcycle).2014；13,3331-3335)和亚型(塞扎里综合征(sezarysyndrome)、蕈样肉芽肿、佩吉特样网状细胞增多症(pagetoidreticulosis)、肉芽肿性皮肤松弛、淋巴瘤样丘疹病、慢性苔癣样糠疹、急性苔藓痘疮样糠疹、cd30+皮肤t-细胞淋巴瘤、继发性皮肤cd30+大细胞淋巴瘤、非蕈样肉芽肿cd30-皮肤大t-细胞淋巴瘤、多形性t-细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤(lennertlymphoma)、皮下t-细胞淋巴瘤、血管中心淋巴瘤、母细胞性nk-细胞淋巴瘤)、结节性痒疹、扁平苔藓、原发性局限性皮肤淀粉样变性、大疱性类天疱疮、移植物抗宿主病的皮肤表现、类天疱疮、盘状狼疮、环状肉芽肿、慢性单纯性苔藓、外阴/阴囊/肛周瘙痒、硬化性苔癣、疱疹后神经痛痒、毛发扁平苔癣和脱发性毛囊炎。特别是，特应性皮肤炎(包(bao)等人，jak-stat,2013,2,e24137)、斑秃(星(xing)等人，《自然医学》(natmed.)2014,20,1043-1049)、白癜风(克雷洛洛(craiglow)等人，《皮肤病学纪要》(jamadermatol.)2015,151,1110-1112)、结节性痒疹(桑科利(sonkoly)等人，《过敏与临床免疫学杂志》(jallergyclinimmunol.)2006,117,411-417)、扁平苔藓(韦尔茨-库比亚克(welz-kubiak)等人，《免疫研究杂志》(jimmunolres.)2015,id:854747)、原发性局限性皮肤淀粉样变性(田中(tanaka)等人，《英国皮肤病学杂志》(brjdermatol.)2009,161,1217-1224)、大疱性类天疱疮(费利西亚尼(feliciani)等人，《国际免疫病理与药理学杂志》(intjimmunopatholpharmacol.)1999,12,55-61)和移植物抗宿主病的真皮表现(衡山(okiyama)等人，《皮肤病学研究期刊》(jinvestdermatol.)2014,134,992-1000)的特征在于经由jak激活信号传导的某些细胞因子的上升。因此，本发明的化合物或其医药上可接受的盐或其晶型可减轻由这些细胞因子所致的相关皮肤炎症或搔痒症。特别是，可期望本发明的化合物或其医药上可接受的盐或其晶型可用于治疗特应性皮肤炎和其它发炎性皮肤病。
因此，于一方面中，本发明提供一种治疗哺乳动物(例如，人类)的发炎性皮肤病的方法，所述方法包括对所述哺乳动物的皮肤施覆包含本发明的化合物或其医药上可接受的盐或其晶型和医药载剂的医药组合物。于一方面中，所述发炎性皮肤病为特应性皮肤炎。
本发明的化合物或其医药上可接受的盐或其晶型还可与可用于治疗发炎性皮肤病的一或多种化合物组合使用。在一些实施例中，所述一或多种化合物为类固醇、组胺h1受体拮抗剂、钙调神经磷酸酶抑制剂、il-13拮抗剂、pde4抑制剂、g-蛋白偶合的受体-44拮抗剂、il-4拮抗剂、5-ht1a受体拮抗剂、5-ht2b受体拮抗剂、α2肾上腺素受体促效剂、大麻素cb1受体拮抗剂、ccr3趋化因子拮抗剂、胶原酶抑制剂、胞浆型磷脂酶a2抑制剂、嗜酸性细胞趋化因子(eotaxin)配体抑制剂、gata3转录因子抑制剂、组胺h4受体拮抗剂、il-10拮抗剂、il-12拮抗剂、il-17拮抗剂、il-2拮抗剂、il-23拮抗剂、il-4受体调节剂、il-5拮抗剂、免疫球蛋白e拮抗剂、免疫球蛋白e调节剂、干扰素γ受体拮抗剂、白细胞介素33配体抑制剂、白细胞介素-31受体拮抗剂、白三烯拮抗剂、肝脏x受体促效剂、肝脏x受体β促效剂、核因子κb抑制剂、ox-40受体拮抗剂、pgd2拮抗剂、磷脂酶a2抑制剂、sh2域肌醇磷酸酶1刺激剂、胸腺基质淋巴蛋白配体抑制剂、tlr调节剂、tnfα配体调节剂或香草酸vr1拮抗剂。在一些实施例中，所述一或多种化合物为革兰氏阳性抗生素，例如莫匹罗星(mupirocin)或夫西地酸(fusidicacid)。在一些实施例中，所述一或多种化合物为曲尼司特(tranilast)、他克莫司、依匹斯汀(epinastine)、sb-011、am-1030、zpl-521、mm-36、fb-825、pg-102、维诺美(viromed)、gbr-830、avx-001、amg-0101、e-6005、dmt-210、ax-1602、柏替木单抗、乙酸罗西普托(rosiptoracetate)、q-301、anb-020、vtp-38543、zpl-389、利勃珠单抗(lebrikizumab)、特西普鲁单抗(tezepelumab)、非索非那定(fexofenadine)、吡美莫司(pimecrolimus)、贝他斯汀(bepotastine)、可瑞博乐(crisaborole)、曲洛单抗、氟维哌仑(fevipiprant)、多西环素(doxycycline)、地氯雷他定(desloratadine)、alx-101、奈莫珠单抗(nemolizumab)、阿斯瓦特雷普(asivatrep)、环孢素、美泊利单抗(mepolizumab)、杜普单抗(dupilumab)、塞库单抗(secukinumab)、替马匹拉(timapiprant)或乌司他单抗。
因此，于一方面中，本发明提供一种治疗哺乳动物的发炎性皮肤病的方法，所述方法包括对所述哺乳动物的皮肤施覆本发明的化合物或其医药上可接受的盐或其晶型和革兰氏阳性抗生素。于另一方面中，本发明提供一种医药组合物，其包含本发明的化合物或其医药上可接受的盐或其晶型、革兰氏阳性抗生素和医药上可接受的载剂。
呼吸疾病
通过jak-stat路径信号传导的细胞因子，特别是，il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-9、il-11、il-13、il-23、il-31、il-27、胸腺基质淋巴生成素(tslp)、干扰素-γ(ifnγ)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)还与哮喘炎症和其它发炎性呼吸疾病有牵连。如上所述，已显示本发明的化合物为jak3的强效抑制剂和还已于细胞检定中证实il-2促发炎性细胞因子的强效抑制。
已于哮喘的临床前模型中有力证实jak抑制剂的抗发炎性活性(马拉维亚(malaviya)等人，《国际免疫药理学》(intimmunopharmacol),2010,10,829,-836；松永(matsunaga)等人，《生物化学与生物物理进展研究通讯》(biochemandbiophysrescommun),2011,404,261-267；库德拉茨(kudlacz)等人，《欧洲药理学杂志》(eurjpharmacol),2008,582,154-161)。因此，本发明的化合物或其医药上可接受的盐或其晶型可用于治疗发炎性呼吸病症(例如哮喘)。肺的炎症和纤维化为除了哮喘外的其它呼吸疾病的特征，所述呼吸疾病例如：慢性阻塞性肺病(copd)、囊性纤维化(cf)、肺炎、间质性肺病(包括特发性肺纤维化)、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、支气管炎、肺气肿和阻塞性细支气管炎。因此，本发明的化合物或其医药上接受的盐可用于治疗慢性阻塞性肺病、囊性纤维化、肺炎、间质性肺病(包括特发性肺纤维化)、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、支气管炎、肺气肿、阻塞性细支气管炎、阻塞性细支气管炎组织性肺炎(还称作cos)、原发性移植物功能障碍(pgd)、组织性肺炎(op)、急性排斥(ar)、淋巴细胞性细支气管炎(lb)、慢性肺同种异体移植物功能障碍(clad)、限制性clad(rclad或ras)、嗜中性白血球同种异体移植物功能障碍和结节病。
因此，于一方面中，本发明提供一种治疗哺乳动物(例如，人类)的呼吸疾病的方法，所述方法包括对所述哺乳动物投与本发明的化合物或其医药上可接受的盐或其晶型。
于一方面中，所述呼吸疾病为哮喘、慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化、肺炎、慢性阻塞性肺病(copd)、囊性纤维化(cf)、肺炎、间质性肺病(包括特发性肺纤维化)、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、支气管炎、肺气肿、阻塞性细支气管炎、阻塞性细支气管炎伴组织性肺炎(还称作cos)、原发性移植物功能障碍(pgd)、组织性肺炎(op)、急性排斥(ar)、淋巴细胞性细支气管炎(lb)、慢性肺同种异体移植物功能障碍(clad)、限制性clad(rclad或ras)、嗜中性白血球同种异体移植物功能障碍、过敏性鼻炎和结节病。于另一方面中，所述呼吸疾病为哮喘或慢性阻塞性肺病。
于又一方面中，所述呼吸疾病为肺感染、蠕虫感染、肺动脉高压、结节病、淋巴管平滑肌瘤病、支气管扩张或浸润性肺病。于又一方面中，所述呼吸疾病为药物诱发的肺炎、真菌诱发的肺炎、过敏性肺支气管曲霉菌病、超敏性肺炎、嗜酸性粒细胞性肉芽肿伴多血管炎、特发性急性嗜酸性粒细胞性肺炎、特发性慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、嗜酸性粒细胞增多综合征、吕弗琉综合征
本发明进一步提供一种治疗呼吸疾病的方法，所述方法包括对哺乳动物投与包含本发明的化合物或其医药上可接受的盐或其晶型和医药上可接受的载剂的医药组合物。
本发明的化合物或其医药上可接受的盐或其晶型还可与可用于呼吸疾病的一或多种化合物组合使用。
眼部疾病
已显示许多眼部疾病与依靠jak-stat路径的促发炎性细胞因子的上升相关。
因此，本发明的化合物或其医药上可接受的盐或其晶型可用于治疗许多眼部疾病，所述眼部疾病包括但不限于葡萄膜炎、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、干眼病、年龄相关的黄斑变性、视网膜静脉阻塞(rvo)和特应性角膜结膜炎。
特别是，葡萄膜炎(霍莱(horai)和卡斯皮(caspi)，《干扰素与细胞因子研究杂志》(jinterferoncytokineres),2011,31,733-744)、糖尿病性视网膜病变(阿布库维尔(abcouwer),《临床细胞免疫学杂志》(jclincellimmunol),2013,增刊1,1-12)、糖尿病性黄斑水肿(佐恩(sohn)等人，《美国眼科杂志》(americanjournalofopthamology),2011,152,686-694)、干眼病(史蒂文森(stevenson)等人，《眼科档案馆》(archophthalmol),2012,130,90-100)、视网膜静脉阻塞(舒子(shchuko)等人，《印度眼科杂志》(indianjournalofophthalmology),2015,63(12),905-911)和年龄相关的黄斑变性(尼克贝恩(knickelbein)等人，《国际眼科临床》(intophthalmolclin),2015,55(3),63-78)的特征在于经由jak-stat路径信号传导的某些促发炎性细胞因子的上升。因此，本发明的化合物或其医药上可接受的盐可减轻相关眼部炎症和扭转疾病进展或提供症状缓解。
因此，于一方面中，本发明提供一种治疗哺乳动物的眼部疾病的方法，所述方法包括对所述哺乳动物的眼睛投与包含本发明的化合物或其医药上可接受的盐或其晶型和医药载剂的医药组合物。于一方面中，所述眼部疾病为葡萄膜炎、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、干眼病、年龄相关的黄斑变性、视网膜静脉阻塞或特应性角膜结膜炎。于一方面中，所述方法包括通过玻璃体内注射投与本发明的化合物或其医药上可接受的盐或其晶型。
本发明的化合物或其医药上可接受的盐或其晶型还可与可用于眼部疾病的一或多种化合物组合使用。
其它疾病
本发明的化合物或其医药上可接受的盐或其晶型还可用于治疗其它疾病，例如其它发炎性疾病、自身免疫疾病或癌症。
本发明的化合物或其医药上可接受的盐或其晶型可用于治疗下列中的一或多者：关节炎、类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、移植排斥、干眼症、牛皮鲜性关节炎、糖尿病、胰岛素依赖性糖尿病、运动神经元病、脊髓发育不良综合征、疼痛、肌减少症、恶病质、脓毒性休克、全身性红斑狼疮、白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、强直性脊柱炎、骨髓纤维化、b-细胞淋巴瘤、肝细胞癌、霍奇金氏病(hodgkinsdisease)、乳癌、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢透明细胞癌、卵巢肿瘤、胰肿瘤、真性红细胞增多症、休格连综合征(sjoegrenssyndrome)、软组织肉瘤、肉瘤、脾肿大、t-细胞淋巴瘤和重型地中海贫血症。
已于酶结合检定中证实本发明的化合物为jak3酶的强效抑制剂且超过jak1、jak2和tyk2对jak3具选择性并于细胞检定中证实本发明的化合物对jak3具有强效功能活性，如下列实例中所述。
实例
提供下列合成和生物实例以说明本发明，且不以任何方式解释为限制本发明的范围。于下实例中，除非另有指示，否则下列缩略语具有下列含义。以下未定义的缩略语具有其通常接受的含义。
acn＝乙腈
calcd＝计算值
boc＝叔丁氧羰基
d＝天
dipea＝n,n-二异丙基乙胺
dmf＝n,n-二甲基甲酰胺
dmso＝二甲亚砜
etoac＝乙酸乙酯
etoh＝乙醇
h＝小时
hatu＝n,n,n',n'-四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲鎓六氟磷酸盐
ipa＝异丙醇
meoh＝甲醇
min＝分钟
rt或rt＝室温
sig＝硅胶
tea＝三乙胺
thf＝四氢呋喃
thp＝四氢吡喃
tfa＝三氟乙酸
反应物和溶剂购自市面供货商(aldrich、fluka、sigma等)且无需进一步纯化即可使用。通过薄层层析法(tlc)、分析型高效液相层析法(anal.hplc)和质谱法监测反应混合物的进行。将反应混合物如各反应中特定所述处理；通常将其通过萃取和其它纯化方法(例如温度依赖性结晶和溶剂依赖性结晶和沉淀)纯化。此外，将反应混合物通过管柱层析法或通过制备型hplc(通常使用c18或bds管柱填料和习知洗脱剂)常规纯化。以下描述典型制备型hplc条件。
通过质谱法和1h-nmr光谱法常规进行反应产物的表征。针对nmr分析，将样品溶解于氘代溶剂(例如cd3od、cdcl3或d6-dmso)中并在标准观察条件下利用variangemini2000仪器(400mhz)获得1h-nmr光谱。通过电喷雾电离方法(esms)利用耦合到自动纯化系统的appliedbiosystems(福斯特城(fostercity),ca)型号api150ex仪器或waters(米尔福德(milford),ma)3100仪器进行化合物的质谱识别。
除非另有指示，否则针对制备型hplc纯化使用下列条件。
管柱：c18，5μm21.2x150mm或c18，5μm21x250mm或c14，5μm21x150mm
管柱温度：室温
流速：20.0ml/min
流动相：a＝水+0.05％tfa
b＝acn+0.05％tfa，
注射体积：(100到1500μl)
检测器波长：214nm
将粗制化合物以约50mg/ml溶解于1:1水:乙酸中。使用2.1x50mmc18管柱进行4分钟分析级测试运行，接着使用100μl注射利用基于分析级测试运行的％b滞留的梯度进行15或20分钟制备级运行。精确梯度呈样品依赖性。利用21x250mmc18管柱和/或21x150mmc14管柱检查含有密切运行杂质的样品用于最佳分离。通过质谱分析识别含有所需产物的洗脱份。
分析型hplc条件
方法a
管柱：lunac18(2)，150x4.60mm，3μm
管柱温度：37℃
流速：1.0ml/min
注射体积：5μl
样品制备：溶解于1:1acn:水中
流动相：a＝水:acn:tfa(98:2:0.05)
b＝水:acn:tfa(2:98:0.05)
检测器波长：250nm
梯度：总共32min(时间(min)/％b)：0/2、10/20、24/90、29/90、30/2、32/2
方法b
管柱：lunac18(2)，150x4.60mm，3μm
管柱温度：37℃
流速：1.0ml/min
注射体积：10μl
样品制备：溶解于1:1acn:水中
流动相：a＝水:acn:tfa(98:2:0.05)
b＝水:acn:tfa(10:90:0.05)
检测器波长：254nm
梯度：总共35min(时间(min)/％b)：0/2、20/25、23/90、26/90、27/2、35/2
利用brukerd8-advancex-射线衍射仪使用具有45kv的输出电压和40ma的电流的cu-kα辐射
使用具有热分析控制器的tainstruments型号q-100模块进行示差扫描量热法(dsc)。使用tainstruments热分析软件收集和分析数据。将各晶型的样品于覆盖的铝盘中精确称重。在5℃下，于5分钟等温平衡期后，使用10℃/min的线性加热斜率将样品自0℃加热到300℃。
使用配备有高分辨能力的tainstruments型号q-50模块进行热重分析(tga)量测。使用tainstruments热分析控制器收集数据并使用tainstruments通用分析软件分析数据。将称重过的样品放置于铂盘中并以10℃的加热速率自环境温度到300-350℃扫描。在使用期间，将平衡室和炉室用氮气流净化。
使用vti大气微量天平、sga-100系统(vticorp.,海厄利亚(hialeah)，佛罗里达州33016)进行动态水分吸附(dms)量测。使用称重过的样品并在分析开始时，湿度为最低可能值(接近0％rh)。dms分析由以下组成：120分钟的初始干燥步骤(0％rh)，接着以5％rh/步骤的扫描速率在5％rh到90％rh的湿度范围内的两个循环的吸附和解吸附。在25℃下等温进行dms运行。
制备1：6-溴-4-氟-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑
将含于dcm(76ml)中的6-溴-4-氟-1h-吲唑(5g，23.25mmol)、3,4-二氢-2h-吡喃(6.38ml，69.8mmol)和对甲苯磺酸一水合物(0.442g，2.325mmol)的混合物在室温下搅拌过夜。将反应浓缩并将所得残余物通过急骤管柱层析法使用0到60％etoac/己烷梯度纯化，以得到所需产物(6.08g，87％产率)。
制备2：3-(((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
在0℃下，在n2氛围下，将氢化钠(1.003g，41.8mmol)缓慢添加到正搅拌的含于dmf(60ml)中的1-boc-氮杂环丁烷-3-基-甲醇(6.89g，36.8mmol)的溶液中并允许反应升温到室温。将起泡反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后再次冷却到0℃。将含于dmf(20ml)中的6-溴-4-氟-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑(5.00g，16.71mmol)的溶液缓慢导管插入反应混合物中，将反应升温到室温并在室温下搅拌2小时。利用缓慢添加h2o(150ml)和etoac(100ml)将反应中止并允许搅拌5分钟。添加额外水(100ml)并将两相混合物用etoac(3x100ml)萃取。然后将合并的有机部分用1:1h2o:盐水(3x100ml)洗涤并经na2so4干燥。将所得澄清微粉红色油通过急骤管柱层析法使用0到100％etoac/己烷梯度纯化，以得到呈澄清无色粘性油的所需产物(7.34g，15.74mmol，94％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c21h28brn3o4计算值466.13，实测值466.1。
制备3：3-(((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
将二氯[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]钯(ii)二氯甲烷加合物(1.93g，2.36mmol)添加到含于1,4-二恶烷(63.0ml)和水(15.74ml)中的4-羟基苯基硼酸(3.26g，23.61mmol)、3-(((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(7.34g，15.74mmol)和磷酸钾(10.02g，47.2mmol)的溶液中。将反应混合物用n2脱气10分钟并且然后在110℃下搅拌2小时。将反应混合物于真空中浓缩到约5ml的体积。添加饱和氯化铵水溶液(20ml)并将混合物用二氯甲烷(3x20ml)萃取。合并二氯甲烷萃取物，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩以得到棕色液体。将粗制液体经由急骤管柱层析法使用50％乙酸乙酯/己烷纯化以得到3-(((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(7.55g，15.74mmol，100％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c27h33n3o5计算值480.24，实测值480.1。
制备4：4-(4-(氮杂环丁烷-3-基甲氧基)-1h-吲唑-6-基)苯酚
将tfa(10.90ml)缓慢添加到含于二氯甲烷(21.80ml)中的3-(((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(7.84g，16.35mmol)的溶液中。将澄清溶液在室温下搅拌5小时。将反应于真空中浓缩以得到呈tfa盐的4-(4-(氮杂环丁烷-3-基甲氧基)-1h-吲唑-6-基)苯酚(6.69g，16.35mmol，100％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c17h17n3o2计算值296.13，实测值296.1。
实例1a：(e)-4-(二甲氨基)-1-(3-(((6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-基)丁-2-烯-1-酮
将hatu(2-(7-氮杂-1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐，817mg，2.150mmol)添加到含于dmf(2.00ml)中的(e)-4-(二甲氨基)丁-2-烯酸盐酸盐(405mg，2.44mmol)的溶液中并将反应混合物在室温下搅拌5分钟。添加4-(4-(氮杂环丁烷-3-基甲氧基)-1h-吲唑-6-基)苯酚tfa盐(800mg，1.954mmol)，接着添加dipea(1.707ml，9.77mmol)并将反应混合物在室温下搅拌15分钟并且然后于真空中浓缩以得到黄色液体。将粗制液体经由制备级c18管柱层析法使用20到80％乙腈/含有0.05％三氟乙酸的水的梯度纯化，以得到呈tfa盐的(e)-4-(二甲氨基)-1-(3-(((6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-基)丁-2-烯-1-酮(235.0mg，0.578mmol，29.6％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c23h26n4o3计算值407.20，实测值407.2。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.07(s,1h),10.33(s,1h),7.93(s,1h),7.55(d,j＝7.9hz,2h),7.21(s,1h),6.86(d,j＝8.6hz,2h),6.79(s,1h),6.66-6.58(m,1h),6.45(d,j＝15.5hz,1h),4.45-4.36(m,2h),4.17-4.07(m,2h),3.91-3.83(m,3h),3.22-3.10(m,2h),2.75(s,6h)。
实例1b：结晶(e)-4-(二甲氨基)-1-(3-(((6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-基)丁-2-烯-1-酮4型
步骤1
向含于200mldcm中的6-溴-4-氟-1h-吲唑(20.0g，93mmol)的悬浮液中添加对甲苯磺酸一水合物(1.769g，9.30mmol)。反应混合物保持为悬浮液。然后添加3,4-二氢-2h-吡喃(16.97ml，186mmol)。于5分钟后观察到固体完全溶解。将反应混合物在室温下搅拌过夜以形成黑色溶液。添加200ml碳酸氢盐水溶液，将相分离并将有机层用200ml盐水洗涤并经硫酸钠干燥。将溶液通过二氧化硅塞过滤以移除黑色并将二氧化硅用300mldcm洗涤。将溶剂蒸发以得到25g呈灰白色固体的产物。
步骤2a
于500ml圆底烧瓶中添加3-(羟甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(22.53g，120mmol)和100ml二甲基乙酰胺(dmac)。将烧瓶用氮气净化。添加碳酸铯(39.2g，120mmol)。添加6-溴-4-氟-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑(24g，80mmol)并将反应混合物在70℃下搅拌2天。添加额外0.5eq的3-(羟甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯和碳酸铯并将反应在70℃下加热过夜以得到完全转化。将反应混合物冷却到室温并且然后缓慢倒入经搅拌的冰冷水(700ml)中。将所得浆液搅拌20分钟并且然后过滤和干燥以得到32g产物。通过缓慢添加作为抗溶剂的水直到混浊将产物自甲醇-水结晶。随时间形成白色浆液。将固体过滤和干燥以得到28g高于98％纯度的物质。
步骤2b
或者，在0℃下，将叔丁醇钾添加到含于dmac中的3-(羟甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯的溶液中。于60分钟后，在0℃下，添加6-溴-4-氟-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑并将反应混合物升温到室温，于少于6小时内得到彻底完全转化。
步骤3
于250ml舒伦克(schlenk)瓶中添加3-(((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(10.0g，21.44mmol)和80ml二恶烷。添加(4-羟基苯基)硼酸(4.44g，32.2mmol)。利用20ml水添加无水磷酸三钾(13.65g，64.3mmol)并将反应混合物用氮气净化。添加pdcl2(dppf)-ch2cl2加合物(0.876g，1.072mmol)并将带有冷凝器的烧瓶用氮气再填充三次。将反应混合物在110℃下加热2小时30分钟以显示通过hplc完全转化。将反应混合物冷却到室温，接着移除大部分二恶烷。添加150ml饱和氯化铵，接着添加150ml乙酸乙酯。将ph用1mhcl水溶液调整到中性。将相分离并将有机层经硫酸钠干燥，接着移除溶剂。将粗产物溶解于150mldcm中和装载于300gsig管柱上，用20到50％乙酸乙酯/己烷洗脱。合并纯洗脱份和蒸发溶剂。添加100mlmethf，接着添加晶种。随时间形成浆液。添加100mldiipe并将浆液搅拌过夜。过滤和干燥得到7.9g纯物质(>99％)。
步骤4
于50ml圆底烧瓶中添加含于400ml甲醇中的3-(((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(85g，177mmol)。添加对甲苯磺酸一水合物(101g，532mmol)并将反应混合物在室温下搅拌，于2天后得到约90％转化。将反应混合物在室温下再搅拌24小时以得到约96％转化。添加400ml二异丙基醚并将所得浆液在室温下搅拌过夜，和过夜形成结晶盐。过滤并在氮气下干燥，得到100g呈双ptsa盐的>99％纯物质。
步骤5
于100ml圆底烧瓶中添加(e)-4-(二甲氨基)丁-2-烯酸、hcl(1.899g，11.46mmol)和20mldmf。添加hctu(o-(1h-6-氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)(4.91g，11.46mmol)并将反应混合物在室温下搅拌20分钟。于另一个烧瓶中添加4-(4-(氮杂环丁烷-3-基甲氧基)-1h-吲唑-6-基)苯酚，2tfa(5.0g，9.55mmol)和20mldmf。将所得溶液冷却到0℃，接着缓慢添加dipea(5ml，38.2mmol，3eq)。将上述溶液(历经5分钟)添加到经预先活化的酸反应混合物中并将反应混合物在室温下搅拌15分钟。再滴加一份等量的dipea。在室温下，于20分钟后，通过hplc观察到完全转化。将反应混合物倒入200ml经搅拌的水中。粘性固体在约ph7下沉淀出来。将ph用氨水小心调整到约8。将溶液用100mlmethf萃取三次。将合并的有机层经硫酸钠干燥，接着移除溶剂。将粗制游离碱产物溶解于25ml10％甲醇的dcm溶液中，装载于125g硅胶管柱上并用等组成10％甲醇/含0.5％氨水的dcm洗脱。合并纯洗脱份和蒸发溶剂。自丙酮再结晶得到>98％纯物质(50％产率)。
将25mg化合物1悬浮于1ml水中。将所得悬浮液在50℃下搅拌2天，过滤，用2ml水洗涤并在环境条件下干燥几小时以得到4型。
或者，通过于10份体积的醇中完全溶解，接着缓慢添加约8到10份体积的水直到浊点，使化合物1溶解于乙醇和水或甲醇和水中。添加4型的晶种，并随时间缓慢形成浆液。然后缓慢添加更多水(约10份体积)并将固体过滤和干燥，以得到4型。
实例1c：结晶(e)-4-(二甲氨基)-1-(3-(((6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-基)丁-2-烯-1-酮3型
3型为化合物1的无水游离碱晶型。
将150mg化合物1悬浮于2ml乙腈和异丙醇的1:1混合物中。将所得悬浮液在50℃下搅拌1天，过滤，用2ml乙腈和异丙醇的1:1混合物洗涤并在环境条件下干燥几小时以得到3型，确定其为结晶无水游离碱。
或者，在室温下，将200mg呈非晶型游离碱的化合物1溶解于2mlipa中。添加等量乙腈。添加更多化合物(总计0.5g)直到饱和溶液形成。添加晶种并将混合物搅拌过夜。随时间形成白色浆液。过滤和干燥得到400mg呈3型的产物，确定其为无水游离碱。
实例1d：3型的表征
通过粉末x-射线衍射(pxrd)、示差扫描量热法(dsc)、热重分析(tga)和动态水分吸附(dms)分析3型的样品。
粉末x-射线衍射
图9中显示3型的粉末x-射线衍射图。
以下显示观察到的pxrd2θ峰位置和d-间距。
热分析
图10中显示本发明的3型结晶游离形式的代表性dsc温谱图。以10℃/分钟的加热速率记录的示差扫描量热法(dsc)迹线展示经识别为熔体转变的吸热热流峰，其具有在约197.7℃开始和在约201.3℃处的峰。熔化后立即接着分解。
所述晶型通过以10℃/分钟的加热速率记录的示差扫描量热法迹线表征，其显示具有在约201.3℃处的峰的最大吸热热流。
所述晶型通过以10℃/分钟的加热速率记录的示差扫描量热法迹线表征，其显示在约197.7℃与约204℃之间的温度下的最大吸热热流。
图11中显示本发明的3型结晶游离形式的代表性tga迹线。图11的热重分析(tga)迹线显示在约195℃的分解开始以下的温度下无显著重量损失。
动态水分吸附评估
图12中显示本发明的3型结晶游离形式的代表性dms迹线。
3型证实于5％到90％相对湿度的湿度范围内重量增加约0.33％。认为3型为非吸湿性。
实例1e：4型的表征
通过粉末x-射线衍射(pxrd)、示差扫描量热法(dsc)、热重分析(tga)和动态水分吸附(dms)分析4型的样品。
粉末x-射线衍射
图13中显示4型的粉末x-射线衍射图。
以下显示观察到的pxrd2θ峰位置和d-间距。
热分析
图14中显示4型结晶游离形式的代表性dsc温谱图。以10℃/分钟的加热速率记录的示差扫描量热法(dsc)迹线展示具有在约60.9℃开始和在约103.6℃处的峰的脱溶剂化吸热，和特征为在约167.3℃开始的熔化吸热。化合物在熔化时分解和熔化吸热和分解放热重迭。
图15中显示4型结晶游离形式的代表性tga迹线。图15的热重分析(tga)迹线显示在100℃下重量损失约3.54％。化合物在约50℃的起始温度下脱溶剂化。化合物在约165℃的起始温度下分解。
动态水分吸附评估
图16中显示4型结晶游离形式的代表性dms迹线。
4型证实于5％到90％相对湿度的湿度范围内重量增加约5.01％。认为4型为中等吸湿性。
制备5：(3s)-3-((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在0℃下，在n2氛围下，将氢化钠(0.201g，8.36mmol)添加到含于dmf(12ml)中的(s)-n-boc-3-吡啶醇(1.25g，6.69mmol)的溶液中并将反应混合物在室温下搅拌20分钟。添加6-溴-4-氟-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑(1.0g，3.34mmol)并将反应混合物在室温下搅拌1小时。添加水(1ml)并将反应于真空中浓缩。将粗物质经由急骤管柱层析法使用40％乙酸乙酯/己烷纯化，以得到(3s)-3-((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.40g，3.00mmol，90％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c21h28brn3o4，计算值466.13，实测值466.1。
制备6：(3s)-3-((6-(3-氯-4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
将乙酸钯(0.135g，0.600mmol)添加到含于1,4-二恶烷(12ml)和水(3.00ml)中的3-氯-4-羟基苯基硼酸(0.776g，4.50mmol)、(3s)-3-((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.40g，3.00mmol)、1,1'-双(二叔丁基膦基)二茂铁(0.285g，0.600mmol)和磷酸钾(1.912g，9.01mmol)的溶液中。将反应混合物用氮气脱气10分钟并且然后在110℃下搅拌2小时。将反应混合物于真空中浓缩到约5ml的体积。添加饱和氯化铵水溶液(20ml)并将混合物用二氯甲烷(3x20ml)萃取。合并二氯甲烷萃取物，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩以得到棕色液体。将粗制液体经由急骤管柱层析法使用50％乙酸乙酯/己烷纯化，以得到呈澄清黄色液体的(3s)-3-((6-(3-氯-4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.35g，2.63mmol，87％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c27h32cln3o5计算值514.20，实测值514.2。
制备7：(s)-2-氯-4-(4-(吡咯烷-3-基氧基)-1h-吲唑-6-基)苯酚
将4.0nhcl的二恶烷溶液(13.13ml，52.5mmol)添加到含于二恶烷(6ml)中的(3s)-3-((6-(3-氯-4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.35g，2.63mmol)的溶液中，并将反应混合物在60℃下搅拌30分钟。将反应混合物于真空中浓缩以得到呈hcl盐的(s)-2-氯-4-(4-(吡咯烷-3-基氧基)-1h-吲唑-6-基)苯酚(0.962g，2.63mmol，100％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c17h16cln3o2计算值330.09，实测值330.2。
实例2：(s)-1-(3-((6-(3-氯-4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮
在0℃下，将n,n-二异丙基乙胺(4.59ml，26.3mmol)添加到含于dmf(13.0ml)中的(s)-2-氯-4-(4-(吡咯烷-3-基氧基)-1h-吲唑-6-基)苯酚hcl盐(0.962g，2.63mmol)的溶液中，接着添加丙烯酰氯(0.277ml，3.41mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15分钟，然后浓缩到约2ml的体积。将粗制液体经由制备级c18管柱层析法使用20到80％乙腈/含有0.05％三氟乙酸的水的梯度纯化以得到呈tfa盐的(s)-1-(3-((6-(3-氯-4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮(344mg，0.691mmol，26.3％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c20h18cln3o3计算值384.10，实测值384.1。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.03(s,1h),10.33(s,1h),7.98(s,1h),7.74-7.67(m,1h),7.57-7.49(m,1h),7.24(s,1h),7.07(d,j＝0.5hz,1h),6.80(s,1h),6.69-6.56(m,1h),6.18-6.11(m,1h),5.71-5.62(m,1h),4.01-3.60(m,5h),2.35-2.14(m,2h)。
制备8：3-(2-((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
向经n2净化的干燥闪烁小瓶中添加溶解于2.4mldmf中的3-(2-羟基丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(374mg，1.74mmol)并将溶液冷却到0℃。将含60重量％氢化钠的矿物油(134mg，3.34mmol)缓慢添加到正搅拌的溶液中并允许于添加后将反应升温到室温。将起泡反应搅拌30分钟，然后再次冷却到0℃。将含于1mldmf中的6-溴-4-氟-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑(400mg，1.34mmol)的溶液缓慢添加到含有有机钠溶液的闪烁小瓶中。于添加后，将反应升温到室温和搅拌2小时，此时lcms指示起始物质完全转化成所需产物。利用缓慢添加1mlh2o和1mletoac将反应中止，允许将其搅拌5分钟。然后将两相溶液转移到分液漏斗中并添加额外5mlh2o。将混合物用10mletoac萃取3次并将水层丢弃。然后将合并的有机部分用3x10ml1:1h2o:盐水洗涤以移除残留dmf。然后将有机物经na2so4干燥，过滤并浓缩成浅黄色油。然后将油通过急骤管柱层析法使用0到40％etoac:己烷梯度纯化。将产物单离纯化呈澄清无色粘性油(288mg，44％产率)。
制备9：3-(2-((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
将乙酸钯(26.2mg，0.116mmol)和1,1’-双(二叔丁基膦基)二茂铁(55.3mg，0.116mmol)的1:1混合物添加到含于1,4-二恶烷(2.0ml)和水(0.50ml)中的3-氯-4-羟基苯硼酸(151mg，0.874mmol)、3-(2-((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(288mg，0.582mmol)和磷酸钾(371mg，1.747mmol)的溶液中。将反应混合物用氮气脱气10分钟并且然后在110℃下搅拌2小时。将反应混合物于真空中浓缩到约5ml的体积。添加饱和氯化铵水溶液(5ml)并将混合物用乙酸乙酯(2x5ml)萃取。合并乙酸乙酯萃取物，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩以得到棕色液体。将粗制液体经由急骤管柱层析法使用40％乙酸乙酯/己烷纯化以得到3-(2-((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(230mg，0.424mmol，73％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c29h36n3o5计算值542.24，实测值542.3。
制备10：4-(4-((2-氮杂环丁烷-3-基)丙-2-基)氧基)-1-h-吲唑-6-基)-2-氯苯酚
将3-(2-((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(230mg，0.424mmol)溶解于二氯甲烷(1ml)中并缓慢添加tfa(1ml)。将澄清溶液在室温下搅拌5小时，此时lcms指示良好转化成所需产物。将反应浓缩以得到呈tfa盐的4-(4-((2-氮杂环丁烷-3-基)丙-2-基)氧基)-1-h-吲唑-6-基)-2-氯苯酚(100％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c19h20n3o2计算值358.13，实测值358.1。
实例3a：(e)-1-(3-(2-((6-(3-氯-4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-基)-4-(二甲氨基)丁-2-烯-1-酮
将hatu(2-(7-氮杂-1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐，100mg，0.263mmol)添加到含于dmf(1ml)中的(e)-4-(二甲氨基)丁-2-烯酸盐酸盐(34mg，0.263mmol)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，然后添加4-(4-((2-氮杂环丁烷-3-基)丙-2-基)氧基)-1-h-吲唑-6-基)-2-氯苯酚tfa盐(118mg，0.251mmol)，接着添加dipea(0.438ml，2.507mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15分钟并且然后于真空中浓缩以得到黄色液体。将粗制液体经由制备级sfc(超临界流体层析法)使用甲醇利用液体二氧化碳纯化以得到(e)-1-(3-(2-((6-(3-氯-4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-基)-4-(二甲氨基)丁-2-烯-1-酮(41.3mg，0.084mmol，33％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c25h29cln4o3计算值469.20，实测值469.2。1hnmr(400mhz,dmso-d6)13.07(s,1h),10.33(s,1h),7.95(s,1h),7.62(d,j＝2.3hz,1h),7.47(dd,j＝8.5,2.3hz,1h),7.34(s,1h),7.04(d,j＝8.5hz,1h),6.85(d,j＝1.1hz,1h),6.63-6.53(m,1h),6.39(d,j＝15.3hz,1h),4.37-4.23(m,2h),4.11-3.91(m,2h),3.69(d,j＝6.4hz,2h),3.02-2.90(m,1h),2.62(s,9h),1.32(s,9h)。
实例3b：结晶(e)-1-(3-(2-((6-(3-氯-4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-基)-4-(二甲氨基)丁-2-烯-1-酮1型
1型为化合物3的无水游离碱晶型。
将80mg呈非晶型游离碱的化合物3溶解于0.5ml乙醇中。将所得混合物在室温下搅拌一天并产生沉淀。将固体通过过滤单离，用1ml乙醇洗涤并在环境条件下干燥几小时以得到1型。
或者，于50ml圆底烧瓶中，添加通过sig纯化的化合物3(1.3g，2.77mmol)。添加10ml丙酮并将混合物在室温下搅拌。添加结晶游离碱1型的晶种。随时间形成厚的白色浆液。过滤和干燥产生1g具有>98％纯度的结晶游离碱1型。
实例3b：结晶(e)-1-(3-(2-((6-(3-氯-4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-基)-4-(二甲氨基)丁-2-烯-1-酮2型
2型为化合物3的游离碱水合物晶型。
将55mg化合物3的非晶型游离碱溶解于0.25ml甲醇中。在此阶段时，以约1:2甲醇:水的比率添加水作为抗溶剂。在室温下，将所得混合物超音波处理若干分钟以产生沉淀。将所得悬浮液在室温下搅拌1天，过滤，用1ml甲醇洗涤和干燥以得到2型。
或者，通过于10份体积的醇中完全溶解接着缓慢添加约8到10份体积的水直到浊点将化合物3溶解于乙醇和水或甲醇和水中。添加2型的晶种并随时间缓慢形成浆液。然后缓慢添加更多水(约10份体积)并将所得固体过滤和干燥以得到2型。
实例3c：1型的表征
通过粉末x-射线衍射(pxrd)、示差扫描量热法(dsc)、热重分析(tga)和动态水分吸附(dms)分析1型的样品。
粉末x-射线衍射
图1中显示1型的粉末x-射线衍射图。
以下显示观察到的pxrd2θ峰位置和d-间距。
热分析
图2中显示本发明的1型结晶游离形式的代表性dsc温谱图。以10℃/分钟的加热速率记录的示差扫描量热法(dsc)迹线展示经识别为熔体转变的吸热热流峰，其具有在约154.9℃开始和在约162.9℃处的峰。熔化后立即分解。
所述晶型通过以10℃/分钟的加热速率记录的示差扫描量热法迹线表征，其显示具有在约162.9℃处的峰的最大吸热热流。晶型通过以10℃/分钟的加热速率记录的示差扫描量热法迹线表征，其显示具有在162.9±3℃处的峰的最大吸热热流。
所述晶型通过以10℃/分钟的加热速率记录的示差扫描量热法迹线表征，其显示在约154.9℃与约171℃之间的温度下的最大吸热热流。
图3中显示1型结晶游离形式的代表性tga迹线。图3的热重分析(tga)迹线显示在100℃下小幅重量损失约0.14％。化合物在约175℃的起始温度下分解。
动态水分吸附评估
图4中显示1型结晶游离形式的代表性dms迹线。
1型证实于5％到90％相对湿度的湿度范围内重量增加约1.62％。认为1型为轻微吸湿。
实例3d：2型的表征
通过粉末x-射线衍射(pxrd)、示差扫描量热法(dsc)、热重分析(tga)和动态水分吸附(dms)分析2型的样品。
粉末x-射线衍射
图5中显示2型的粉末x-射线衍射图。
以下显示观察到的pxrd2θ峰位置和d-间距。
热分析
图6中显示2型结晶游离形式的代表性dsc温谱图。以10℃/分钟的加热速率记录的示差扫描量热法(dsc)迹线展示具有在约52.7℃开始和在约84.4℃处的峰的脱溶剂化吸热和在约160.0℃开始和在约167.6℃处的峰的熔化吸热。熔化后立即接着分解。
图7中显示本发明的2型结晶游离形式的代表性tga迹线。图7的热重分析(tga)迹线显示在75℃下重量损失约6.73％。化合物在约25℃的起始温度下脱溶剂化。化合物在约185℃的起始温度下分解。
动态水分吸附评估
图8中显示本发明的2型结晶游离形式的代表性dms迹线。2型在高于约65％的rh下转化成水合物(2b型)。脱水在15％以下的rh下发生。在5％与90％之间的rh下的总吸湿率为7.99％。
实例3e：2b型的表征
通过粉末x-射线衍射(pxrd)分析2b型的样品。
粉末x-射线衍射
图17中显示2b型的粉末x-射线衍射图。
以下显示观察到的pxrd2θ峰位置和d-间距。
制备11：4,6-二氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶
将4,6-二氯-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶(2.50g，13.23mmol)添加到烧瓶中并溶解于1,4-二恶烷(52.9ml)中。然后将对甲苯磺酸一水合物(ptsoh，0.25g，1.32mmol)添加到澄清浅黄色溶液中，接着添加3,4-二氢-2h-吡喃(1.8ml，19.84mmol)并将反应加热到40℃和搅拌过夜。然后将所得混合物冷却并于真空中浓缩。将粗制物通过急骤管柱层析法使用0到100％etoac:己烷梯度纯化，以得到4,6-二氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶(2.6g，9.52mmol，72.0％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c10h10cl2n4o计算值274.0，实测值188.9(失去thp部分)。
制备12：3-(((6-氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
向干燥圆底烧瓶中添加1-boc-氮杂环丁烷-3-基-甲醇(1.96g，10.47mmol)并溶解于dmf(20.0ml)中。将正搅拌的溶液冷却到0℃并且然后添加氢化钠(0.762g，19.04mmol)。将反应升温到室温和搅拌30分钟，导致浅粉色起泡混合物。将混合物冷却到0℃并经由套管添加含于dmf(10ml)中的4,6-二氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶(2.6g，9.52mmol)的溶液。将反应升温到室温和搅拌3小时。然后将反应用120mlh2o中止并用30mletoac萃取3次。然后将有机溶液用100ml盐水:h2o溶液(1:1)洗涤3次。将有机物经na2so4干燥，过滤并浓缩成浅黄色油。将粗制物通过急骤管柱层析法使用0到50％etoac:己烷梯度纯化以得到3-(((6-氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(1.95g，4.60mmol，48％产率)。
制备13：3-(((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
于圆底烧瓶中，将3-(((6-氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(1.95g，4.60mmol)溶解于1,4-二恶烷(23.0ml)中。添加4-羟基苯基硼酸(0.95g，6.90mmol)，接着添加水(7.7ml)。添加二氯[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]钯(0.56g，0.69mmol)并将烧瓶配备回流冷凝器，设置在氮气下，加热到110℃，和搅拌过夜。然后将反应冷却到室温并于真空中移除有机溶剂。将h2o(20ml)添加到残余物中并用dcm(30ml)萃取三次。将有机物经na2so4干燥，过滤并浓缩成黑色油。将粗制物通过急骤管柱层析法使用0到100％etoac:己烷梯度纯化，以得到呈黄色/橙色油的3-(((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(2.03g，4.22mmol，92％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c25h31n5o5计算值482.2，实测值482.2。
制备14：4-(4-(氮杂环丁烷-3-基甲氧基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)苯酚
于圆底烧瓶中，在室温下，将3-(((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(2.03g，4.22mmol)溶解于dcm(10.0ml)中并缓慢添加tfa(5.0ml)。将反应搅拌18小时以得到橙色/紫色溶液。将反应于真空中浓缩以得到灰色/橙色固体。将标题化合物单离呈tfa盐，100％产率(1.25g，4.22mmol)。(m/z)：[m+h]+针对c15h15n5o2计算值298.1，实测值298.3.。
实例4：1-(3-(((6-(4-羟基苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-基)丙-2-烯-1-酮
于圆底烧瓶中，将4-(4-(氮杂环丁烷-3-基甲氧基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)苯酚三氟乙酸(1.25g，4.20mmol)溶解于dmf(21.0ml)中并添加二异丙基乙胺(3.67ml，21.0mmol)。将反应冷却到0℃和搅拌5分钟，然后缓慢添加丙烯酰氯(0.273ml，3.36mmol)，然后在0℃下将其搅拌15分钟。将反应升温到室温并于真空中浓缩。将粗制物溶解于1:1mecn:h2o中并通过反相制备型hplc使用20到80％mecn:h2o梯度纯化。将所需洗脱份合并和冻干以得到标题化合物(434mg，1.235mmol，29％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c18h17n5o3计算值352.1，实测值352.2。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.32-8.23(dappt,2h),8.07(s,1h),6.89-6.81(dappt,2h),6.30(dd,j＝17.0,10.3hz,1h),6.07(dd,j＝17.0,2.3hz,1h),5.63(dd,j＝10.3,2.3hz,1h),4.81(d,j＝6.5hz,2h),4.36(t,j＝8.6hz,1h),4.12(dd,j＝8.6,5.4hz,1h),4.06(t,1h),3.82(dd,j＝10.2,5.5hz,1h),3.24-3.10(m,1h)。
制备15：3-(((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
将1-boc-氮杂环丁烷-3-基-甲醇(3.44g，18.39mmol)添加到经烘箱干燥的烧瓶中并溶解于dmf(41.8ml)中。将溶液冷却到0℃和搅拌10分钟，然后添加氢化钠(0.50g，20.89mmol)。将起泡混合物升温到室温和搅拌30分钟。然后将反应冷却到0℃并经由套管添加含于dmf(10ml)中的6-溴-4-氟-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑(2.5g，8.36mmol)的溶液。将反应升温到室温和搅拌1.5小时。将反应通过添加120mlh2o中止并用50mletoac萃取3次。合并有机相并用100ml盐水:h2o溶液(1:1)洗涤3次。然后收集有机相并经na2so4干燥，过滤并浓缩成澄清浅黄色油(3.9g，8.36mmol)。粗产物无需任何进一步纯化即可使用。(m/z)：[m+h]+针对c21h28brn3o4计算值466.14，实测值466.1。
制备16：3-(((6-(3-氟-4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
将3-(((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(3.9g，8.36mmol)添加到烧瓶中并溶解于1,4-二恶烷(44.6ml)中。添加3-氟-4-羟基苯基硼酸(1.96g，12.54mmol)，接着添加水(11.2ml)和磷酸三钾(5.33g，25.09mmol)。添加二氯[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]钯(1.02g，1.25mmol)并将烧瓶配备回流冷凝器和放置于氮气氛围下。将反应加热到110℃和搅拌18小时。一旦冷却到室温，将有机溶剂于真空中移除以得到黑色油。向所述油中添加10mlh2o并将溶液用40mldcm萃取3次。收集有机物并经na2so4干燥，过滤并浓缩成黑色油。将所述油经由急骤管柱层析法使用0到100％etoac:hex梯度纯化，以得到呈澄清黄色油的3-(((6-(3-氟-4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(2.58g，5.19mmol，62％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c27h32fn3o5计算值498.2，实测值498.2。
制备17：4-(4-(氮杂环丁烷-3-基甲氧基)-1h-吲唑-6-基)-2-氟苯酚
于50ml圆底烧瓶中，将3-(((6-(3-氟-4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(2.58g，5.19mmol)溶解于dcm(10.0ml)中。在室温下，将tfa(5.00ml)缓慢添加到澄清黄色溶液中。将反应搅拌24小时并将所得暗黄色/紫色溶液于真空中浓缩以得到呈灰色/黄色固体的4-(4-(氮杂环丁烷-3-基甲氧基)-1h-吲唑-6-基)-2-氟苯酚(3.46g)的tfa盐(100％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c17h16fn3o2计算值314.1，实测值314.2。
实例5：(e)-4-(二甲氨基)-1-(3-(((6-(3-氟-4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-基)丁-2-烯-1-酮
将(2e)-4-(二甲氨基)丁-2-烯酸(464mg，2.80mmol)和hatu(976mg，2.57mmol)添加到圆底烧瓶中，溶解于dmf(5.5ml)中和搅拌15分钟。然后将含于dmf(5.5ml)中的4-(4-(氮杂环丁烷-3-基甲氧基)-1h-吲唑-6-基)-2-氟苯酚(1.0g，2.34mmol)的溶液缓慢添加到正搅拌的反应中，接着添加二异丙基乙胺(2.0ml，11.70mmol)。将反应搅拌24小时并且然后于真空中浓缩。将粗制物溶解于1:1mecn:h2o中并通过反相制备型hplc使用20到80％mecn:h2o梯度纯化。将所需洗脱份合并和冻干，以得到标题化合物的tfa盐(271mg，0.50mmol，21％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c23h25fn4o3计算值425.2实测值425.2。1hnmr(400mhz,meod-d4)δ7.94(d,j＝0.8hz,1h),7.39(dd,j＝12.5,2.2hz,1h),7.35-7.28(m,1h),7.24(t,j＝1.0hz,1h),7.03-6.93(m,1h),6.80-6.68(m,2h),6.53(dt,j＝15.2,1.1hz,1h),4.53(t,j＝8.7hz,1h),4.47-4.34(m,2h),4.35-4.22(m,2h),4.09(dd,j＝10.8,5.6hz,1h),3.93(dd,j＝7.2,1.1hz,2h),3.27-3.19(m,1h),2.88(s,6h)。
制备18：6-溴-4-硝基-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑
将含于dcm(41.3ml)中的6-溴-4-硝基-1h-吲唑(3.00g，12.4mmol)、3,4-二氢-2h-吡喃(97％(3.40ml，37.2mmol))和对甲苯磺酸一水合物(ptsoh，0.236g，1.24mmol)的混合物在室温下搅拌过夜。将反应通过硅藻土垫过滤并浓缩。认为反应呈100％转化(4.05g)并并将其用于随后反应中，无需进一步纯化。
制备19：6-(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-4-硝基-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑
将含于二恶烷(14.9ml)和h2o(4.98ml)中的6-(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-4-硝基-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑(1.00g，3.07mmol)、4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)苯基硼酸(1.16g，4.60mmol)和磷酸三钾(1.30g，6.13mmol)的混合物用n2净化10分钟。然后添加[1,1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(ii)(0.224g，0.307mmol)，之后将烧瓶密封。将反应加热到110℃和搅拌1小时。于经由lcms确认完全转化成所需产物后，将反应用20mlh2o和20mletoac中止。将两层通过硅藻土垫过滤和转移到分液漏斗。将混合物用20mletoac萃取3次，并丢弃水层。将合并的有机部分浓缩并随后通过急骤管柱层析法使用0到10％etoac:己烷梯度纯化。将产物单离纯化呈浅黄色油(1.03g，74.4％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c24h31n3o4si计算值454.61,实测值454.3。
制备20：6-(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-胺
将6-(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-4-硝基-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑(0.980g，2.16mmol)和10重量％碳载钯(湿)(0.980g)溶解于thf(2.8ml)和异丙醇(11.2ml)中。将反应容器用n2回填5分钟，之后将其密封和放置于氢气氛围下。将反应混合物留待在室温下搅拌3小时。于lcms指示完全转化成所需产物后，将反应混合物过滤。然后将滤液用额外thf洗涤。于浓缩并通过急骤管柱层析法(40g)使用0到25％etoac:己烷梯度纯化后，将产物单离(0.562g，61.5％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c24h33n3o2si计算值424.63，实测值424.4。
制备21：(2r)-2-((6-(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氨甲酰基)吗啉-4-甲酸叔丁酯
将(r)-n-boc-2-吗啉甲酸(0.819g，3.54mmol)和1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓六氟磷酸盐3-氧化物(hatu，2.69g，7.08mmol)溶解于dmf(11.8ml)中并留在室温下搅拌5分钟。然后添加6-(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-胺(1.00g，2.36mmol)，并将反应混合物留在室温下搅拌2小时。lcms指示完全转化成所需产物。将反应用10mlh2o和10mldcm中止。于转移到分液漏斗后，将混合物用10mldcm萃取三次，并丢弃水层。将合并的有机部分浓缩并随后通过急骤管柱层析法(40g)使用0到45％etoac:己烷梯度纯化。将产物单离呈浅黄色油(1.01g，67％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c34h48n4o6si计算值637.87，实测值637.6。
制备22：(r)-n-(6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)吗啉-2-甲酰胺
将(2r)-2-((6-(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氨甲酰基)吗啉-4-甲酸叔丁酯(1.00g，1.58mmol)溶解于meoh(2.0ml)中。当搅拌时，缓慢添加含于4.0m二恶烷(12.1ml，48.5mmol)中的hcl溶液。将反应混合物加热到60℃和搅拌30分钟，之后lcms指示完全转化成所需产物。将混合物浓缩以得到呈橙色油的产物。认为反应100％转化(0.533g)并将其用于随后反应中无需进一步纯化。
实例6：(r)-4-丙烯酰基-n-(6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)吗啉-2-甲酰胺
将(r)-n-(6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)吗啉-2-甲酰胺(0.533g，1.58mmol)溶解于dmf(7.9ml)中。添加n,n-二异丙基乙胺(dipea，2.75ml，15.8mmol)，接着缓慢添加丙烯酰氯(0.0900ml，1.10mmol)。将反应在室温下搅拌10分钟，然后通过lcms监测到转化。于经由lcms指示完全转化后，将反应混合物浓缩并经由反相制备型hplc使用10到50％acn:h2o梯度纯化。收集所需产物洗脱份并经由冻干浓缩。将产物单离(130mg，21％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c21h20n4o4计算值393.42，实测值393.4。1hnmr(400mhz，甲醇-d4)δ8.13(s,1h),7.74(d,j＝16.3hz,1h),7.56(d,j＝6.0hz,2h),7.51(s,1h),6.91(dd,j＝8.7,2.9hz,3h),6.30(dt,j＝16.8,2.3hz,1h),5.84(d,j＝10.6hz,1h),4.45-4.25(m,2h),4.21(d,j＝11.8hz,1h),4.12-4.02(m,1h),3.78(t,j＝11.5hz,1h),3.53(m,1h),3.29-2.99(m,1h)。
制备23：(3s)-3-(((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在n2氛围下，在0℃下，将氢化钠(0.072g，3.01mmol)添加到含于dmf(6ml)中的(ss)-n-boc-吡咯烷-3-甲醇(0.444g，2.21mmol)的溶液中并将反应混合物在室温下搅拌20分钟。添加6-溴-4-氟-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑(0.600g，2.01mmol)并将反应混合物在室温下搅拌1小时。添加水(1ml)并将反应于真空中浓缩。将粗物质经由急骤管柱层析法使用40％乙酸乙酯/己烷纯化，以得到(3s)-3-(((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(0.964g，1.87mmol，93％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c22h30brn3o4计算值480.15，实测值480.1。
制备24：(3s)-3-(((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
将乙酸钯(0.084g，0.375mmol)添加到含于1,4-二恶烷(12ml)和水(3.00ml)中的4-羟基苯基硼酸(0.388g，2.81mmol)、(3s)-3-(((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(0.900g，1.87mmol)、1,1'-双(二叔丁基膦基)二茂铁(0.178g，0.375mmol)和磷酸钾(1.193g，5.62mmol)的溶液中。将反应混合物用氮气脱气10分钟并且然后在110℃下搅拌2小时。将反应混合物于真空中浓缩到约5ml的体积。添加饱和氯化铵水溶液(10ml)并将混合物用二氯甲烷(3x10ml)萃取。将二氯甲烷萃取物合并，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩以得到棕色液体。将粗制液体经由急骤管柱层析法使用50％乙酸乙酯/己烷纯化，以得到呈澄清黄色液体的(3s)-3-(((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(0.800g，1.62mmol，87％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c28h35n3o5计算值494.27，实测值494.2。
制备25：(s)-4-(4-(吡咯烷-3-基甲氧基)-1h-吲唑-6-基)苯酚
将4.0nhcl的二恶烷溶液(8.10ml，32.4mmol)添加到含于二恶烷(6ml)中的(3s)-3-(((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(0.800g，1.62mmol)的溶液中，并将反应混合物在60℃下搅拌30分钟。将反应混合物于真空中浓缩以得到呈hcl盐的(s)-4-(4-(吡咯烷-3-基甲氧基)-1h-吲唑-6-基)苯酚(0.501g，1.62mmol，100％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c18h19n3o2计算值310.16，实测值310.3。
实例7：(s)-1-(3-((6-(3-氯-4-羟苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮
在0℃下，将n,n-二异丙基乙胺(2.83ml，16.2mmol)添加到含于dmf(5ml)中的(s)-4-(4-(吡咯烷-3-基甲氧基)-1h-吲唑-6-基)苯酚hcl盐(0.560g，1.62mmol)的溶液中，接着添加丙烯酰氯(0.171ml，2.11mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15分钟，然后浓缩到约2ml的体积。将粗制液体经由制备级c18管柱层析法使用30到90％乙腈/含有0.05％三氟乙酸的水的梯度纯化，以得到呈tfa盐的(s)-1-(3-(((6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮(226mg，0.473mmol，29.2％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c21h21n3o3计算值364.17，实测值364.2。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.00(s,1h),10.31(s,1h),8.04-7.94(m,1h),7.59-7.48(m,1h),7.18(s,1h),6.89-6.79(m,1h),6.76-6.70(m,1h),6.65-6.54(m,1h),6.13(dd,j＝16.6,1.7hz,1h),5.69-5.62(m,1h),4.25-3.78(m,4h),3.76-3.28(m,2h),2.88-2.63(m,1h),2.22-1.72(m,2h)。
制备26：3-(2-((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
向经n2净化的干燥闪烁小瓶中添加溶解于5mldmf中3-氰基-3-(羟甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(851mg，4.01mmol)并将溶液冷却到0℃。向经搅拌的溶液中缓慢添加含60重量％氢化钠的矿物油(267mg，6.69mmol)并允许于添加后将反应升温到室温。将起泡反应搅拌30分钟，然后再次冷却到0℃。将含于2mldmf中的6-溴-4-氟-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑(800mg，2.67mmol)的溶液缓慢添加到含有有机钠溶液的闪烁小瓶中。于添加后，将反应升温到室温和搅拌2小时，此时lcms指示起始物质完全转化成所需产物。利用缓慢添加2mlh2o和2mletoac将反应中止，允许将其搅拌5分钟。然后将两相溶液转移到分液漏斗并添加额外10mlh2o。将混合物用20mletoac萃取3次并丢弃水层。然后将合并的有机部分用3x10ml1:1h2o:盐水洗涤以移除残留dmf。然后将有机物经na2so4干燥，过滤并浓缩成浅黄色油。然后将所述油通过急骤管柱层析法使用0到40％etoac:己烷梯度纯化。将产物单离纯化呈澄清无色粘性油(1.096g，83％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c22h27brn4o4计算值491.13，实测值491.1。
制备27：3-氰基-3-(((6-(3-氟-4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
将乙酸钯(25.1mg，0.112mmol)和1,1’-双(二叔丁基膦基)二茂铁98％(53.1mg，0.112mmol)的1:1混合物添加到含于1,4-二恶烷(4.5ml)和水(1ml)中的3-氟-4-羟基苯基硼酸(262mg，1.679mmol)、3-(2-((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(550mg，1.119mmol)和磷酸钾(713mg，3.36mmol)的溶液中。将反应混合物用氮气脱气10分钟并且然后在110℃下搅拌2小时。将反应混合物于真空中浓缩。添加饱和氯化铵水溶液(5ml)并将混合物用乙酸乙酯(2x5ml)萃取。将乙酸乙酯萃取物合并，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩以得到棕色液体。将粗制液体经由急骤管柱层析法使用40％乙酸乙酯/己烷纯化，以得到3-氰基-3-(((6-(3-氟-4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(267mg，0.511mmol，46％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c28h31fn4o5计算值523.24，实测值523.4。
制备28：3-(((6-(3-氟-4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-3-甲腈
将3-氰基-3-(((6-(3-氟-4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(267mg，0.511mmol)溶解于二氯甲烷(1ml)中并缓慢添加tfa(1ml)。将澄清溶液在室温下搅拌5小时，此时lcms指示良好转化成所需产物。将反应浓缩以得到呈tfa盐的3-(((6-(3-氟-4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-3-甲腈(100％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c18h15fn4o2计算值339.13，实测值339.2。
实例8：(e)-1-(4-(二甲氨基)丁-2-烯酰基)-3-(((6-(3-氟-4-羟基苯基)-1h吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-3-甲腈
将hatu(2-(7-氮杂-1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(121mg，0.318mmol)添加到含于dmf(2ml)中的(e)-4-(二甲氨基)丁-2-烯酸盐酸盐(41.1mg，0.318mmol)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，然后添加3-(((6-(3-氟-4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-3-甲腈tfa盐(160mg，0.354mmol)，接着添加dipea(0.618ml，3.54mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15分钟并且然后于真空中浓缩以得到黄色液体。将粗制液体经由制备级zorbaxbonus-rp(2.1x30mm，1.8μm)管柱层析法使用15到75％乙腈/含有0.05％三氟乙酸的水纯化，以得到(e)-1-(4-(二甲氨基)丁-2-烯酰基)-3-(((6-(3-氟-4-羟基苯基)-1h吲唑-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-3-甲腈(56.2mg，0.121mmol，34％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c24h24fn5o3计算值450.19，实测值450.0。1hnmr(400mhz,dmso-d6)9.94(s,1h),9.77(s,1h),7.85(s,1h),7.47(dd,j＝12.8,2.2hz,1h),7.31(dd,j＝8.4,1.7hz,1h),7.22(s,1h),6.99-6.90(m,1h),6.78(s,1h),6.59-6.48(m,1h),6.31(d,j＝15.4hz,1h),4.67-4.60(m,3h),4.40(d,j＝9.1hz,1h),4.27(d,j＝10.5hz,1h),4.12(d,j＝10.4hz,1h),3.78(d,j＝6.8hz,2h),2.66(s,6h)。
制备29：4-((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)-4-甲基哌啶-1-甲酸叔丁酯
向经n2净化的干燥闪烁小瓶中添加溶解于3mldmf中的1-boc-4-甲基哌啶-4-醇(567mg，2.63mmol)并将溶液冷却到0℃。向经搅拌的溶液中缓慢添加含60重量％氢化钠的矿物油(175mg，4.39mmol)并允许于添加后将反应升温到室温。将起泡反应搅拌30分钟，然后再次冷却到0℃。将含于1mldmf中的6-溴-4-氟-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑(525mg，1.755mmol)的溶液缓慢添加到含有有机钠溶液的闪烁小瓶中。于添加后，将反应升温到室温和搅拌2小时，此时lcms指示起始物质完全转化成所需产物。利用缓慢添加2mlh2o和2mletoac将反应中止，允许将其搅拌5分钟。然后将两相溶液转移到分液漏斗并添加额外10mlh2o。将混合物用20mletoac萃取3次并丢弃水层。然后将合并的有机部分用3x10ml1:1h2o:盐水洗涤以移除残留dmf。然后将有机物经na2so4干燥，过滤并浓缩成浅黄色油。然后将所述油通过急骤管柱层析法使用0到40％etoac:己烷梯度纯化。将产物单离纯化呈澄清无色粘性油(389mg，45％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c23h32brn3o4计算值494.17，实测值494.4。
制备30：4-((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)-4-甲基哌啶-1-甲酸叔丁酯
将乙酸钯(9.1mg，0.040mmol)和1,1’-双(二叔丁基膦基)二茂铁98％(19.2mg，0.040mmol)的1:1混合物添加到含于1,4-二恶烷(2ml)和水(0.5ml)中的4-羟基苯硼酸(42mg，0.30mmol)、4-((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)-4-甲基哌啶-1-甲酸叔丁酯(100mg，0.202mmol)和97％无水磷酸三钾(129mg，0.607mmol)的溶液中。将反应混合物用氮气脱气10分钟并且然后在110℃下搅拌2小时。将反应混合物于真空中浓缩。添加饱和氯化铵水溶液(5ml)并将混合物用乙酸乙酯(2x5ml)萃取。将乙酸乙酯萃取物合并，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩以得到棕色液体。将粗制液体经由combiflash管柱层析法(12g)使用40％乙酸乙酯/己烷纯化，以得到4-((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)-4-甲基哌啶-1-甲酸叔丁酯(96mg，0.189mmol，94％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c29h37n3o5计算值5098.28，实测值508.3。
制备31：4-(4-((4-甲基哌啶-4-基)氧基)-1h-吲唑-6-基)苯酚
将4-((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)-4-甲基哌啶-1-甲酸叔丁酯(96mg，0.189mmol)溶解于1,4-二氯甲烷(1ml)中并缓慢添加4nhcl的1,4-二恶烷溶液(1.18ml，4.73mmol)。将澄清溶液在室温下搅拌5小时，此时lcms指示良好转化成所需产物。将反应浓缩以得到呈hcl盐的4-(4-((4-甲基哌啶-4-基)氧基)-1h-吲唑-6-基)苯酚(100％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c19h21n3o2计算值324.17，实测值324.3。
实例9：(e)-4-(二甲氨基)-1-(4-((6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)-4-甲基哌啶-1-基)丁-2-烯-1-酮
将hatu(2-(7-氮杂-1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐，72mg，0.189mmol)添加到含于dmf(1ml)中的(e)-4-(二甲氨基)丁-2-烯酸盐酸盐(24mg，0.186mmol)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，然后添加4-(4-((4-甲基哌啶-4-基)氧基)-1h-吲唑-6-基)苯酚hcl盐(68.0mg，0.189mmol)，接着添加dipea(0.618ml，3.54mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15分钟并且然后于真空中浓缩以得到黄色液体。将粗制液体经由制备级zorbaxbonus-rp(2.1x30mm，1.8μm)管柱层析法使用5到65％乙腈/含有0.05％三氟乙酸的水纯化，以得到(e)-4-(二甲氨基)-1-(4-((6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)-4-甲基哌啶-1-基)丁-2-烯-1-酮(39.0mg，0.063mmol，34％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c25h30fn4o3计算值435.24，实测值435.2。1hnmr(400mhz,dmso-d6)12.99(s,1h),9.66(s,1h),8.02(d,j＝0.9hz,1h),7.52-7.44(m,2h),7.27(s,1h),6.90(d,j＝15.0hz,1h),6.86-6.78(m,3h),6.58-6.47(m,1h),3.99-3.86(m,1h),3.83(d,j＝7.2hz,2h),3.78-3.55(m,2h),2.74(s,6h),1.40(s,3h)。
制备32：4,6-二氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶
将3,4-二氢-2h-吡喃(2.0g，24.07mmol)添加到含于二氯甲烷(30ml)中的4,6-二氯-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶(2.50g，13.23mmol)的溶液中，接着添加对甲苯磺酸一水合物(0.275g，1.60mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌1小时。添加水(50ml)并将混合物用二氯甲烷(3x50ml)萃取。将二氯甲烷萃取物合并，用盐水(1x50ml)洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩以得到澄清黄色液体。将粗制液体经由急骤管柱层析法使用10％etoac/己烷纯化，以得到4,6-二氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶(3.0g，11.1mmol，67％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c11h11cl2n3o计算值272.04，实测值272.21。
制备33：3-(((6-氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
在0℃下，将nah(于矿物油中的60％分散体，160mg，4.0mmol)添加到含于dmf(5ml)和乙醚(5ml)中的1-boc-氮杂环丁烷-3-基-甲醇(760mg，4.0mmol)的溶液中并将反应混合物在0℃下搅拌15分钟。添加4,6-二氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶(1.0g，3.7mmol)并将反应混合物在室温下搅拌1小时。添加水(10ml)并将反应混合物用二氯甲烷(3x10ml)萃取。将二氯甲烷萃取物合并，用盐水(1x10ml)洗涤，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩以得到澄清黄色液体。将粗制液体经由急骤管柱层析法使用30％etoac/己烷纯化，以得到3-(((6-氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(1.1g，2.60mmol，70％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c20h27cln4o4计算值423.18，实测值423.25。
制备34：3-(((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
将含于水(4ml)中的碳酸钠(500mg，4.72mmol)的溶液添加到含于二恶烷(20ml)中的4-羟基苯基硼酸(392mg，2.84mmol)和3-(((6-氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(1.0g，2.36mmol)中并将反应混合物用氮气脱气10分钟。添加pdcl2(dppf).dcm(196mg，0.24mmol)并将反应混合物再脱气5分钟并且然后在110℃下搅拌4小时。将反应混合物冷却到室温并且然后通过硅藻土床过滤。将所过滤物质用二氯甲烷洗涤并将滤液合并并用水(1x10ml)、盐水(1x10ml)洗涤，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩以得到澄清棕色液体。将粗制液体经由急骤管柱层析法使用50％etoac/己烷纯化，以得到3-(((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(1.02g，2.12mmol，76％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c26h32n4o5计算值481.25，实测值481.65。
制备35：4-(4-(氮杂环丁烷-3-基甲氧基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚
在0℃下，将tfa(4.0ml)缓慢添加到含于二氯甲烷(10ml)中的3-(((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(500mg，1.04mmol)的溶液中并将反应混合物在室温下搅拌3小时。将反应混合物于真空中浓缩并将所得固体用5％甲醇:二氯甲烷研磨，以得到呈tfa盐的标题化合物(330mg，0.804mmol，77％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c16h16n4o2计算值297.14，实测值297.15。
实例10：1-(3-(((6-(4-羟基苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-基)丙-2-烯-1-酮
向含于dmf(1ml)中的4-(4-(氮杂环丁烷-3-基甲氧基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚tfa盐(35.5mg，0.087mmol)的溶液中添加dipea(0.151ml，0.865mmol)，接着添加丙烯酰氯(7.0μl，0.087mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15分钟并且然后于真空中浓缩以得到黄色液体。将粗制液体经由制备级zorbaxbonus-rp(2.1x30mm，1.8μm)管柱层析法使用5到75％乙腈/含有0.05％三氟乙酸的水纯化，以得到1-(3-(((6-(4-羟基苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-基)丙-2-烯-1-酮(13.4mg，0.028mmol，33％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c19h28n4o3计算值351.15，实测值351.1。1hnmr(400mhz,dmso-d6)(s,1h),9.80(s,1h),7.98(d,j＝8.9hz,3h),7.13(s,1h),6.85(d,j＝8.7hz,2h),6.32(dd,j＝17.0,10.3hz,1h),6.09(dd,j＝17.0,2.3hz,1h),5.64(dd,j＝10.3,2.3hz,1h),4.55(d,j＝6.7hz,1h),4.38(t,j＝8.5hz,1h),4.15-4.02(m,2h),3.80(dd,j＝10.0.5.4hz,2h),3.22-3.07(m,1h)。
制备36：6-溴-4-氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑
在0℃下，将3,4-二氢-2h-吡喃(19.79ml，216.5mmol)添加到含于乙酸乙酯(200ml)中的6-溴-4-氯-1h-吲唑(10.0g，43.3mmol)的溶液中，接着添加对甲苯磺酸一水合物(1.64g，8.66mmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌4小时。添加饱和碳酸氢钠水溶液(100ml)并将混合物用乙酸乙酯(3x100ml)萃取。将乙酸乙酯萃取物合并，用水(1x100ml)、盐水(1x100ml)洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩以得到黄色固体。将粗制液体经由于正戊烷中研磨，以得到6-溴-4-氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑(13.0g，41.2mmol，95％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c12h12brcln2o计算值314.99，实测值314.93。
制备37：4-(4-氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-6-基)苯酚
将含于二恶烷(200ml)和水(50ml)中的碳酸钠(8.77g，82.8mmol)、4-羟基苯基硼酸(6.85g，49.7mmol)和6-溴-4-氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑(13.0g，41.4mmol)的溶液用氮气脱气15分钟。添加pdcl2(dppf).dcm(3.37g，4.14mmol)并将反应混合物再脱气5分钟并且然后在125℃下搅拌2小时。将反应混合物冷却到室温，添加乙酸乙酯并将反应混合物通过硅藻土床过滤。添加水(100ml)并将混合物用乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯萃取物合并，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩以得到澄清棕色液体。将粗制液体经由急骤管柱层析法使用0到30％etoac/己烷梯度纯化，以得到4-(4-氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-6-基)苯酚(7.5g，22.9mmol，55％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c18h17cln2o2计算值329.11，实测值329.08。
制备38：3-(((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)(甲基)氨基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
将乙酸钯(68.3mg，0.304mmol)和2-(二叔丁基膦基)联苯(182.0mg，0.608mmol)的1:2混合物添加到含于甲苯(15ml)中的4-(4-氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-6-基)苯酚(500mg，1.521mmol)、3-((甲基氨基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(457mg，2.281mmol)和叔丁醇钠(>99.9％，731mg，7.60mmol)的溶液中。将反应混合物用氮气脱气10分钟并且然后在110℃下搅拌16小时。将反应混合物于真空中浓缩到约5ml的体积。添加饱和氯化铵水溶液(5ml)并将混合物用乙酸乙酯(2x5ml)萃取。将乙酸乙酯萃取物合并，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩以得到棕色液体。将粗制液体经由combiflash管柱层析法(24g)使用50％乙酸乙酯/己烷纯化，以得到3-(((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)(甲基)氨基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(368mg，0.747mmol，49％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c28h36n4o4计算值493.28，实测值493.4。
制备39：4-(4-((氮杂环丁烷-3-基甲基)(甲基)氨基)-1h-吲唑-6-基)苯酚
将3-(((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)(甲基)氨基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(368mg，0.747mmol)溶解于二氯甲烷(1.5ml)中并缓慢添加tfa(1.5ml)。将澄清溶液在室温下搅拌5小时，此时lcms指示良好转化成所需产物。将反应浓缩以得到呈tfa盐的4-(4-((氮杂环丁烷-3-基甲基)(甲基)氨基)-1h-吲唑-6-基)苯酚(100％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c18h20n4o计算值309.17，实测值309.2。
实例11：(e)-4-(二甲氨基)-1-(3-(((6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)(甲基)氨基)甲基)氮杂环丁烷-1-基)丁-2-烯-1-酮
将hatu(2-(7-氮杂-1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐，59.5mg，0.157mmol)添加到含于dmf(1ml)中的(e)-4-(二甲氨基)丁-2-烯酸盐酸盐(34mg，0.263mmol)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，然后添加4-(4-((氮杂环丁烷-3-基甲基)(甲基)氨基)-1h-吲唑-6-基)苯酚tfa盐(63mg，0.149mmol)，接着添加dipea(0.260ml，1.491mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15分钟并且然后于真空中浓缩以得到黄色液体。将粗制液体经由制备级zorbaxbonus-rp(2.1x30mm，1.8μm)管柱层析法使用5到65％乙腈/含有0.05％三氟乙酸的水纯化，以得到(e)-4-(二甲氨基)-1-(3-(((6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)(甲基)氨基)甲基)氮杂环丁烷-1-基)丁-2-烯-1-酮(47.6mg，0.086mmol，96％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c24h29n5o2计算值420.24，实测值420.2。
制备40：(3s)-3-((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)硫代)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
向经搅拌的含于dmso(5ml)中的6-溴-4-氟-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑(600mg，2.0mmol)和(s)-3-巯基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(488mg，2.20mmol)的溶液中添加cs2co3(1.30mg，4.0mmol)。将反应混合物在120℃下搅拌16小时。添加水并将反应混合物用etoac(3×50ml)萃取。将etoac萃取物合并，用水接着盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并于真空中浓缩以得到呈澄清粘性液体的粗制中间体产物。
向经搅拌的含于二恶烷(20ml)和水(4ml)中的粗制中间体的溶液中添加4-羟基苯基硼酸(240mg，1.74mmol)和na2co3(461mg，4.35mmol)并将反应混合物用氮气脱气15分钟。添加pd(dppf)cl2.dcm(118mg，0.0145mmol)并将反应混合物再脱气5分钟并且然后在110℃下搅拌4小时。将反应混合物冷却到室温，添加水并将反应混合物用乙酸乙酯(3x50ml)萃取。合并乙酸乙酯萃取物，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩以得到澄清棕色液体。将粗制液体经由急骤管柱层析法使用30到50％etoac/己烷梯度纯化，以得到(3s)-3-((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)硫代)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(600mg，1.21mmol，61％)。(m/z)：[m+h]+针对c27h33cln3o4s计算值496.23，实测值496.42。
制备41：(s)-4-(4-(吡咯烷-3-基硫代)-1h-吲唑-6-基)苯酚
将4.0nhcl的二恶烷溶液(10.0ml，40.0mmol)添加到含于甲醇(6ml)中的(3s)-3-((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)硫代)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(400mg，0.808mmol)的溶液中，并将反应混合物在40℃下搅拌16小时。将反应混合物于真空中浓缩并将所得残余物经由制备级c18管柱层析法使用20到80％乙腈/含0.05％三氟乙酸的水的梯度纯化，以得到呈tfa盐的(s)-4-(4-(吡咯烷-3-基硫代)-1h-吲唑-6-基)苯酚(175mg，0.411mmol，51％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c17h17n3os计算值312.12，实测值312.22。
实例12：(s)-1-(3-((6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)硫代)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮
在0℃下，将n,n-二异丙基乙胺(0.079ml，0.450mmol)添加到含于dmf(0.2ml)中的(s)-4-(4-(吡咯烷-3-基硫代)-1h-吲唑-6-基)苯酚tfa盐(38.5mg，0.091mmol)的溶液中，接着添加丙烯酰氯(8.0μl，0.099mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15分钟并将粗制液体经由制备级c18管柱层析法使用乙腈/含有0.05％三氟乙酸的水的梯度纯化，以得到呈tfa盐的(s)-1-(3-((6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)硫代)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮(17.1mg，0.046mmol，51％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c20h19n3o2s计算值366.13，实测值366.1。
制备42：(3s)-3-((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)磺酰基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
将碱性氧化铝(200mg)和oxone(744mg，2.42mmol)添加到含于氯仿(50ml)和水(1ml)中的(3s)-3-((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)硫代)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(400mg，0.80mmol)的溶液中并将反应混合物在65℃下搅拌12小时。将反应混合物通过硅藻土床过滤，并将所过滤物质用氯仿洗涤。合并滤液，添加水并将混合物用氯仿(3x100ml)萃取。将氯仿萃取物合并，用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩。将粗制液体经由急骤管柱层析法使用30％etoac/己烷纯化，以得到(3s)-3-((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)磺酰基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(200mg，0.379mmol，47％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c27h33cln3o6计算值528.22，实测值528.48。
制备43：(s)-4-(4-(吡咯烷-3-基磺酰基)-1h-吲唑-6-基)苯酚
将4.0nhcl的二恶烷溶液(10.0ml，40.0mmol)添加到含于甲醇(2ml)中的(3s)-3-((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)磺酰基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(200mg，0.379mmol)的溶液中，并将反应混合物在室温下搅拌8小时。将反应混合物于真空中浓缩并将所得残余物用乙醚研磨，以得到呈hcl盐的(s)-4-(4-(吡咯烷-3-基磺酰基)-1h-吲唑-6-基)苯酚(140mg，0.369mmol，97％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c17h17n3o3s计算值344.11，实测值344.04。
实例13：(s)-1-(3-((6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)磺酰基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮
在0℃下，将n,n-二异丙基乙胺(0.079ml，0.450mmol)添加到含于dmf(0.2ml)中的(s)-4-(4-(吡咯烷-3-基磺酰基)-1h-吲唑-6-基)苯酚hcl盐(31.0mg，0.082mmol)的溶液中，接着添加丙烯酰氯(8.0μl，0.099mmol)。将反应混合物在室温下搅拌10分钟并将粗制液体经由制备级c18管柱层析法使用乙腈/含有0.05％三氟乙酸的水的梯度纯化以得到呈tfa盐的(s)-1-(3-((6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)磺酰基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮(3.1mg，0.0061mmol，7％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c20h19n3o4s计算值398.12，实测值398.0。
制备44：4-((6-氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
将0.5m9-bbn的thf溶液(7.92ml，3.96mmol)添加到4-亚甲基哌啶-1-甲酸叔丁酯(468mg，2.37mmol)并将反应混合物在80℃下搅拌2小时。将反应混合物冷却到室温并且然后导管插入含于dmf(10.0ml)和h2o(2.0ml)中的4-溴-6-氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑(500mg，1.58mmol)、碳酸钾(548mg，3.96mmol)和pd(dppf)cl2.dcm(129mg，0.15mmol)的预制溶液中。将反应混合物在80℃下搅拌16小时。将反应混合物通过硅藻土床过滤，并将所过滤物质用乙酸乙酯洗涤。合并滤液，添加水(100ml)并将混合物用乙酸乙酯(2x150ml)萃取。将乙酸乙酯萃取物合并，用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩。将粗制液体经由急骤管柱层析法使用30％etoac/己烷纯化，以得到4-((6-氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(460mg，1.06mmol，67％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c23h32cln3o3计算值434.22，实测值434.47。
制备45：4-((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
将4-羟基苯基硼酸(195mg，1.41mmol)添加到含于二恶烷(10.0ml)和水(2.0ml)中的4-((6-氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(410mg，0.94mmol)的悬浮液中，接着添加磷酸钾(401mg，1.88mmol)并将反应混合物用氮气脱气15分钟。添加2'-(二甲氨基)-2-联苯基-氯化钯(ii)二降莰基膦络合物(52mg，0.07mmol)并将反应混合物在微波照射下在100℃下加热1小时。将反应混合物冷却到室温并且然后通过硅藻土床过滤。将水(100ml)添加到滤液中，然后将其用乙酸乙酯(3x100ml)萃取。将乙酸乙酯萃取物合并，用水、盐水洗涤，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩。将粗制液体经由急骤管柱层析法使用50％etoac/己烷纯化，以得到4-((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(300mg，0.610mmol，65％)。(m/z)：[m+h]+针对c29h37n3o4计算值492.29，实测值492.46。
制备46：4-(4-(哌啶-4-基甲基)-1h-吲唑-6-基)苯酚
将4.0nhcl的二恶烷溶液(10.0ml，40.0mmol)添加到含于甲醇(2ml)中的4-((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(300mg，0.610mmol)的溶液中，并将反应混合物在室温下搅拌8小时。将反应混合物于真空中浓缩并将所得残余物用乙醚研磨，以得到呈hcl盐的4-(4-(哌啶-4-基甲基)-1h-吲唑-6-基)苯酚(195mg，0.567mmol，93％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c19h21n3o计算值308.18，实测值308.10。
实例14：1-(4-((6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)甲基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮
在0℃下，将n,n-二异丙基乙胺(0.079ml，0.450mmol)添加到含于dmf(0.2ml)中的4-(4-(哌啶-4-基甲基)-1h-吲唑-6-基)苯酚hcl盐(27.5mg，0.080mmol)的溶液中，接着添加丙烯酰氯(8.0μl，0.099mmol)。将反应混合物在室温下搅拌10分钟并将粗制液体经由制备级c18管柱层析法使用乙腈/含有0.05％三氟乙酸的水的梯度纯化，以得到呈tfa盐的1-(4-((6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)甲基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮(7.2mg，0.015mmol，19％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c22h23n3o2计算值362.19，实测值362.1。
制备47：(r,e)-2-(3-乙氧基-3-氧代丙-1-烯-1-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在0℃下，将3-(三苯基亚膦基)丙酸乙酯(3.64g，10.0mmol)添加到含于二氯甲烷(40ml)中的(r)-2-甲酰基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(2.0g，10.0mmol)的溶液中并将反应混合物在室温下搅拌4小时。添加水(200ml)并将反应混合物用二氯甲烷(2x100ml)萃取。将二氯甲烷萃取物合并，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩。将粗制液体经由急骤管柱层析法使用5％乙酸乙酯/己烷纯化，以得到(r,e)-2-(3-乙氧基-3-氧代丙-1-烯-1-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.70g，6.31mmol，63％产率)。
制备48：(r,e)-3-(1-甲基吡咯烷-2-基)丙烯酸乙酯
将4mhcl的二恶烷溶液(7.20ml，28.8mmol)添加至tfa溶液(10.90ml)缓慢添加到含于二恶烷(40ml)中的(r,e)-2-(3-乙氧基-3-氧代丙-1-烯-1-基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1.70g，6.31mmol)的溶液中并将反应混合物在室温下搅拌2小时。将反应于真空中浓缩以得到粗制中间体。在0℃下，将含于水(4.19ml，41.4mmol)中的37％甲醛溶液添加到含于二氯甲烷(50ml)中的粗制中间体的溶液中，接着添加三乙酰氧基硼氢化钠(5.26g，24.8mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌16小时。添加冰冷水(20ml)并将反应混合物用二氯甲烷(2x100ml)萃取。将二氯甲烷萃取物合并，用盐水洗涤，经硫酸干燥并于真空中浓缩以得到(r,e)-3-(1-甲基吡咯烷-2-基)丙烯酸乙酯(0.900g，4.915mmol，78％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c10h17no2计算值184.14，实测值184.0。
制备49：(r,e)-3-(1-甲基吡咯烷-2-基)丙烯酸
将氢氧化钠(294mg，7.36mmol)添加到含于2:1thf/水(15ml)中的乙基(r,e)-3-(1-甲基吡咯烷-2-基)丙烯酸乙酯(0.900g，4.915mmol，78％产率)的溶液中并将反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应混合物于真空中浓缩，以得到乙基(r,e)-3-(1-甲基吡咯烷-2-基)丙烯酸(668mg，4.30mmol，88％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c8h13no2计算值156.10，实测值156.26。
实例15：(e)-1-((s)-3-((6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)吡咯烷-1-基)-3-((r)-1-甲基吡咯烷-2-基)丙-2-烯-1-酮
将含于dmf(0.1ml)中的hatu(0.031g，0.083mmol)的溶液添加到乙基(r,e)-3-(1-甲基吡咯烷-2-基)丙烯酸(14.0mg，0.090mmol)中，接着添加(s)-4-(4-(吡咯烷-3-基氧基)-1h-吲唑-6-基)苯酚盐酸盐(0.025g，0.075mmol)和dipea(0.065ml，0.375mmol)的溶液，将反应混合物在室温下搅拌15分钟并将粗制液体经由制备级c18管柱层析法使用乙腈/含0.05％三氟乙酸的水的梯度纯化，以得到呈tfa盐的(e)-1-((s)-3-((6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)吡咯烷-1-基)-3-((r)-1-甲基吡咯烷-2-基)丙-2-烯-1-酮(7.8mg，0.014mmol，19％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c25h28n4o3计算值433.23，实测值433.1。
制备50：2-((二甲氨基)甲基)丙烯酸叔丁酯
将多聚甲醛(1.20g，43.2mmol)添加到含于1,4-二恶烷(20ml)中的丙二酸(2.0g，19.3mmol)的溶液中，接着添加2m二甲胺的thf溶液(9.60ml，19.2mmol)并将反应混合物在70℃下搅拌1小时。将反应混合物于真空中浓缩并使用乙醚和丙酮将粗产物再结晶，以得到呈白色固体的中间体。将中间体白色固体溶解于t-buoh(100ml)中并将二碳酸二叔丁酯(4.60ml，20.7mmol)添加到反应混合物中，接着添加4-二甲氨基吡啶(511mg，4.18mmol)并将反应混合物在室温下搅拌4小时。添加二氯甲烷(500ml)并将反应混合物用水(2x500ml)洗涤，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩。将粗制残余物经由急骤管柱层析法使用2％甲醇/二氯甲烷纯化，以得到2-((二甲氨基)甲基)丙烯酸叔丁酯(220mg，1.19mmol，6％产率)。
制备51：2-((二甲氨基)甲基)丙烯酸
将1nhcl水溶液(5.0ml，5mmol)添加到2-((二甲氨基)甲基)丙烯酸叔丁酯(220mg，1.19mmol)中并将反应混合物在100℃下搅拌15分钟。将反应混合物于真空中浓缩并将所得残余物与甲苯共沸并进一步用乙醚研磨以得到呈hcl盐的2-((二甲氨基)甲基)丙烯酸(119mg，0.719mmol，60％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c6h11no2计算值130.09，实测值130.22。
实例16：(s)-2-((二甲氨基)甲基)-1-(3-((6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮
将含于dmf(0.1ml)中的hatu(0.031g，0.083mmol)的溶液添加到2-((二甲氨基)甲基)丙烯酸盐酸盐(14.9mg，0.090mmol)中，接着添加(s)-4-(4-(吡咯烷-3-基氧基)-1h-吲唑-6-基)苯酚盐酸盐(0.025g，0.075mmol)和dipea(0.065ml，0.375mmol)的溶液，将反应混合物在室温下搅拌15分钟并将粗制液体经由制备级c18管柱层析法使用乙腈/含0.05％三氟乙酸的水的梯度纯化，以得到呈tfa盐的(s)-2-((二甲氨基)甲基)-1-(3-((6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮(2.6mg，0.005mmol，7％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c23h26n4o3计算值407.21，实测值407.1。
实例17：(s)-1-(3-((6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)吡咯烷-1-基)丙-2-炔-1-酮
将含于dmf(0.1ml)中的hatu(0.031g，0.083mmol)的溶液添加到丙炔酸(6.0mg，0.090mmol)中，接着添加(s)-4-(4-(吡咯烷-3-基氧基)-1h-吲唑-6-基)苯酚盐酸盐(0.025g，0.075mmol)和dipea(0.065ml，0.375mmol)的溶液，将反应混合物在室温下搅拌15分钟并将粗制液体经由制备级c18管柱层析法使用乙腈/含0.05％三氟乙酸的水的梯度纯化，以得到呈tfa盐的(s)-1-(3-((6-(4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)吡咯烷-1-基)丙-2-炔-1-酮(2.4mg，0.005mmol，7％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c20h17n3o3计算值348.14，实测值348.0。
实例18：(s)-4-(4-((1-(乙烯基磺酰基)吡咯烷-3-基)氧基)-1h-吲唑-6-基)苯酚
在0℃下，将n,n-二异丙基乙胺(0.052ml，0.301mmol)添加到含于dmf(0.2ml)中的(s)-4-(4-(吡咯烷-3-基氧基)-1h-吲唑-6-基)苯酚盐酸盐(0.020g，0.060mmol)的溶液中，接着添加乙烯磺酰氯(8.4ml，0.066mmol)。将反应混合物在室温下搅拌10分钟并将粗制液体经由制备级c18管柱层析法使用乙腈/含有0.05％三氟乙酸的水的梯度纯化，以得到呈tfa盐的(s)-4-(4-((1-(乙烯基磺酰基)吡咯烷-3-基)氧基)-1h-吲唑-6-基)苯酚(8.2mg，0.016mmol，27％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c19h19n3o4计算值386.12，实测值386.3。
制备52：3-(2-((6-氟-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
将碳酸铯(6.33g，19.42mmol)添加到含于1,4-二恶烷(20.71ml)和水(5.18ml)中的3-(2-((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(3.20g，6.47mmol)和3-氟-4-羟基苯硼酸(1.514g，9.71mmol)的溶液中并将反应混合物用氮气脱气10分钟。
添加二氯[1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]钯(ii)(0.793g，0.971mmol)并将反应混合物在110℃下搅拌2小时。将反应混合物于真空中浓缩到约5ml的体积。添加饱和氯化铵水溶液(20ml)并将混合物用二氯甲烷(2x20ml)萃取。将二氯甲烷萃取物合并，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩以得到棕色液体。将粗制液体经由急骤管柱层析法使用50％乙酸乙酯/己烷纯化，以得到3-(2-((6-氟-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(2.30g，4.38mmol，68％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c29h37fn3o5计算值526.27，实测值526.3。
制备53：4-(4-((2-氮杂环丁烷-3-基)丙-2-基)氧基)-1-h-吲唑-6-基)-2-氟苯酚
将3-(2-((6-氟-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(3.10g，5.90mmol)溶解于二氯甲烷(10ml)中并缓慢添加tfa(10ml)。将澄清溶液在室温下搅拌2小时，此时lcms指示良好转化成所需产物。将反应浓缩以得到呈tfa盐的4-(4-((2-氮杂环丁烷-3-基)丙-2-基)氧基)-1-h-吲唑-6-基)-2-氟苯酚(100％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c19h21fn3o2计算值342.16，实测值342.3。
实例19：(e)-1-(3-(2-((6-(3-氟-4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-基)-4-(二甲氨基)丁-2-烯-1-酮
将hatu(2-(7-氮杂-1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐，2.92g，7.07mmol)添加到含于dmf(10ml)中的(e)-4-(二甲氨基)丁-2-烯酸盐酸盐(1.07g，6.48mmol)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌10分钟，然后添加4-(4-((2-氮杂环丁烷-3-基)丙-2-基)氧基)-1-h-吲唑-6-基)-2-氟苯酚tfa盐(2.01g，5.89mmol)，接着添加dipea(3.08ml，17.7mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15分钟并且然后于真空中浓缩以得到黄色液体。将粗制液体经由制备级c18管柱层析法使用20到80％乙腈/含有0.05％三氟乙酸的水的梯度纯化，以得到呈tfa盐的(e)-4-(二甲氨基)-1-(3-(2-((6-(3-氟-4-羟基苯基)-1h-吲唑-4-基)氧基)丙-2-基)环丁基)丁-2-烯-1-酮(1.65g，3.65mmol，61.9％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c25h30fn4o3计算值453.23，实测值453.3。
制备54：3-(2-((2,6-二氯吡啶-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
将含于dmso(10ml)中的3-(2-羟基丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(6.5g，30.21mmol)的溶液逐滴添加到含于dmso(15ml)中的含60重量％氢化钠的矿物油(1.65g，41.20mmol)的溶液中并将反应混合物在室温下搅拌10分钟。将含于dmso(25ml)中的2,4,6-三氯吡啶(5.0g，27.62mmol)的溶液逐滴添加到所得悬浮液中，并将反应混合物在60℃下搅拌16小时。使用饱和氯化铵水溶液将反应混合物中止并用乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯萃取物合并，用饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩以得到粗制液体。将粗制液体经由急骤管柱层析法使用5％乙酸乙酯/己烷纯化，以得到3-(2-((2,6-二氯吡啶-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(2.10g，5.80mmol，21.1％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c16h23cl2n2o3计算值361.11，实测值361.11。
制备55：3-(2-((6-氯-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
在-78℃下，将2mnbuli的己烷溶液(3.05ml，6.11mmol)逐滴添加到含于thf(40ml)中的3-(2-((2,6-二氯吡啶-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(2.0g，5.55mmol)的溶液中。以一份式添加dmf(0.64ml，8.33mmol)并将反应混合物在-78℃下搅拌10分钟。添加5％乙酸/乙醚并将混合物进一步用水稀释。将水层用乙酸乙酯萃取(3次)。将乙酸乙酯萃取物合并，用饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩以得到粗制中间体3-(2-((2,6-二氯-3-甲酰基吡啶-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯。在0℃下，将水合肼(1.0ml，20.56mmol)逐滴添加到含于thf(40ml)中的粗制3-(2-((2,6-二氯-3-甲酰基吡啶-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯的溶液中，并将反应混合物在室温下搅拌2小时。添加三乙胺(1.45ml，10.28mmol)并将反应混合物在60℃下搅拌16小时。将反应混合物于真空中浓缩并将所得残余物用水稀释并用乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯萃取物合并，用饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩以得到粗制液体。将粗制液体经由急骤管柱层析法使用20％乙酸乙酯/己烷纯化，以得到3-(2-((6-氯-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(1.20g，3.27mmol，58.9％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c17h23cln4o3计算值367.15，实测值367.00。
制备56：3-(2-((6-(4-羟基苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
将碳酸钠(636mg，6.00mmol)添加到含于4:1二恶烷/水(15ml)中的3-(2-((6-氯-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(1.1g，3.00mmol)的溶液中，接着添加苯酚硼酸(496mg，3.60mmol)并将反应混合物用氩气脱气10分钟。添加二氯[1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]钯(ii)二氯甲烷加合物(245mg，0.3mmol)，将反应混合物进一步用氩气脱气5分钟并将反应混合物在微波照射下在130℃下搅拌1小时。将反应混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯萃取物合并，用饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩以得到粗制液体。将粗制液体经由急骤管柱层析法使用50％乙酸乙酯/己烷纯化，以得到3-(2-((6-(4-羟基苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(650mg，1.53mmol，51.0％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c23h29n4o4计算值425.22，实测值425.21。
制备57：4-(4-((2-(氮杂环丁烷-3-基)丙-2-基)氧基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚
将3-(2-((6-(4-羟基苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(630mg，1.48mmol)溶解于二氯甲烷(10ml)中并缓慢添加tfa(6.3ml)。将澄清溶液在室温下搅拌4小时，此时lcms指示良好转化成所需产物。将反应于真空中浓缩并将残余物用乙腈/乙醚研磨，以得到呈tfa盐的4-(4-((2-(氮杂环丁烷-3-基)丙-2-基)氧基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(100％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c18h21n4o2计算值325.17，实测值325.13。
实例20：1-(3-(2-((6-(4-羟基苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-基)丙-2-烯-1-酮
在0℃下，将二异丙基乙胺(0.298ml，1.711mmol)添加到含于dmf(3.0ml)中的4-(4-((2-(氮杂环丁烷-3-基)丙-2-基)氧基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚tfa盐(150mg，0.342mmol)的溶液中，接着添加丙烯酰氯(0.031ml，0.376mmol)并将反应混合物在室温下搅拌15分钟。将反应混合物于真空中浓缩以得到棕色液体。将粗制液体经由制备级c18管柱层析法使用10到70％乙腈/含有0.05％三氟乙酸的水的梯度纯化，以得到呈tfa盐的1-(3-(2-((6-(4-羟基苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)丙-2-基)氮杂环丁烷-1-基)丙-2-烯-1-酮(80.5mg，0.163mmol，47.8％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c21h23n4o3计算值379.18，实测值379.3。
制备58：3-(((6-氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)氧基)甲基)-3-甲基氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
在0℃下，将氢化钠(211mg，8.79mmol)添加到含于dmf(4.4ml)中的3-(羟甲基)-3-甲基氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(973mg，4.83mmol)的溶液中并将反应混合物在室温下搅拌30分钟。然后在0℃下将反应混合物逐滴添加到含于dmf(4.4ml)中的4,6-二氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶(1.20g，4.39mmol)的溶液中并将反应混合物在室温下搅拌2小时。利用添加水(1ml)将反应中止并将所得混合物于真空中浓缩以得到浅棕色液体。添加水(10ml)并将混合物用乙酸乙酯(3x20ml)萃取。将乙酸乙酯萃取物合并，用饱和氯化钠水溶液(5ml)洗涤并经硫酸钠干燥以得到棕色液体。将粗制液体经由急骤管柱层析法使用40％乙酸乙酯/己烷纯化，以得到3-(((6-氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)氧基)甲基)-3-甲基氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(1.06g，4.39mmol，54.9％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c20h29cln5o4计算值438.19，实测值438.6。
制备59：3-(((6-(3-氟-4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)氧基)甲基)-3-甲基氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
将磷酸三钾(218mg，1.03mmol)添加到含于4:1二恶烷/水(1.71ml)中的3-(((6-氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)氧基)甲基)-3-甲基氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(150mg，0.343mmol)的溶液中，接着添加3-氟-4-羟基苯基硼酸(80.0mg，0.514mmol)并将反应混合物用氮气脱气10分钟。添加乙酸钯(15.4mg，0.069mmol)和1,1’-双(二叔丁基膦基)二茂铁(32.5mg，0.069mmol)并将反应混合物在110℃下搅拌过夜。将反应混合物于真空中浓缩到约5ml的体积。添加饱和氯化铵水溶液(20ml)并将混合物用乙酸乙酯(3x20ml)萃取。将乙酸乙酯萃取物合并，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩以得到棕色液体。将粗制液体经由急骤管柱层析法使用40％乙酸乙酯/己烷纯化，以得到3-(((6-(3-氟-4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)氧基)甲基)-3-甲基氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(65mg，0.343mmol，37.0％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c26h33fn5o5计算值514.25，实测值514.7。
制备60：2-氟-4-(4-((3-甲基氮杂环丁烷-3-基)甲氧基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)苯酚
将3-(((6-(3-氟-4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)氧基)甲基)-3-甲基氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(65mg，0.127mmol)溶解于二氯甲烷(0.56ml)中并添加tfa(0.56ml)并将反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应于真空中浓缩以得到呈tfa盐的2-氟-4-(4-((3-甲基氮杂环丁烷-3-基)甲氧基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)苯酚(100％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c16h17fn5o2计算值330.14，实测值330.3。
实例21：1-(3-(((6-(3-氟-4-羟基苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)氧基)甲基)-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)丙-2-烯-1-酮
在0℃下，将二异丙基乙胺(0.210ml，1.20mmol)添加到含于dmf(0.60ml)中的2-氟-4-(4-((3-甲基氮杂环丁烷-3-基)甲氧基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)苯酚tfa盐(53.2mg，0.12mmol)的溶液中，接着添加丙烯酰氯(9.75μl，0.120mmol)并将反应混合物在室温下搅拌15分钟。将反应混合物于真空中浓缩以得到粗制液体。将粗制液体经由制备级c18管柱层析法使用10到60％乙腈/含0.05％三氟乙酸的水的梯度纯化，以得到呈tfa盐的1-(3-(((6-(3-氟-4-羟基苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)氧基)甲基)-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)丙-2-烯-1-酮(10.5mg，0.120mmol，21.7％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c19h19fn5o3计算值384.15，实测值384.3。
制备61：3-(((6-氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)甲基)-3-乙基氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
在0℃下，将含60重量％氢化钠的矿物油(353mg，8.82mmol)添加到含于dmf(10ml)中的3-乙基-3-(羟甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(1.1g，4.85mmol)的溶液中并将反应混合物在室温下搅拌40分钟。在0℃下，含于dmf(5ml)中的4,6-二氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶(1.20g，4.41mmol)的溶液并将反应混合物在室温下搅拌1小时。利用添加水将反应中止并将混合物用乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯萃取物合并，用水和饱和氯化钠水溶液洗涤并且然后经硫酸钠干燥以得到粗制残余物。将粗制残余物经由急骤管柱层析法使用5％乙酸乙酯/己烷纯化以得到3-(((6-氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)甲基)-3-乙基氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(900mg，4.39mmol，45.2％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c22h32cln4o4计算值451.21，实测值451.13。
制备62：3-乙基-3-(((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
将含于水(2ml)中的苯酚硼酸(413mg，2.99mmol)和碳酸钠(421mg，3.98mmol)的溶液添加到含于二恶烷(8ml)中的3-(((6-氯-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)甲基)-3-乙基氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(900mg，1.99mmol)的溶液中并将反应用氩气脱气5分钟。
添加二氯[1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]钯(ii)二氯甲烷加合物(162mg，0.19mmol)，将反应混合物进一步用氩气脱气5分钟并将反应混合物在110℃下搅拌1小时。将反应混合物用乙酸乙酯稀释并通过硅藻土过滤。添加水，将乙酸乙酯层分离并将水层用乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯萃取物合并，用饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩以得到粗制液体。将粗制液体经由急骤管柱层析法使用30％乙酸乙酯/己烷纯化，以得到3-乙基-3-(((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(800mg，1.57mmol，79.0％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c28h37n4o5计算值509.28，实测值509.29。
制备63：4-(4-((3-乙基氮杂环丁烷-3-基)甲氧基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚
将3-乙基-3-(((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(800mg，1.57mmol)溶解于二氯甲烷(10ml)中并在0℃下添加tfa(10ml)并将反应混合物在室温下搅拌3小时。将反应于真空中浓缩并将所得残余物用乙醚研磨。将粗制残余物溶解于少量乙腈中并用乙醚沉淀，以得到呈tfa盐的4-(4-((3-乙基氮杂环丁烷-3-基)甲氧基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(287mg，0.885mmol，56.3％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c18h21n4o2计算值325.17，实测值325.07。
实例22：1-(3-乙基-3-(((6-(4-羟基苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-基)丙-2-烯-1-酮
在0℃下，将二异丙基乙胺(0.246ml，1.41mmol)添加到含于dmf(2.0ml)中的4-(4-((3-乙基氮杂环丁烷-3-基)甲氧基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚tfa盐(124mg，0.283mmol)的溶液中，接着添加丙烯酰氯(25μl，0.311mmol)并将反应混合物在室温下搅拌15分钟。将反应混合物于真空中浓缩以得到棕色液体。将粗制液体经由制备级c18管柱层析法使用20到80％乙腈/含0.05％三氟乙酸的水的梯度纯化，以得到呈tfa盐的1-(3-乙基-3-(((6-(4-羟基苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-4-基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-基)丙-2-烯-1-酮(44.8mg，0.118mmol，41.9％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c21h23n4o3计算值379.18，实测值379.3。
制备64：6-溴-4-氟-1h-苯并[d][1,2,3]三唑
将含于水(50ml)中的亚硝酸钠(1.85g，26.8mmol)的溶液添加到含于水(50ml)和乙酸(18.0ml)中的5-溴-3-氟苯-1,2-二胺(5.00g，24.4mmol)的溶液中并将反应混合物在室温下搅拌15分钟并且然后在85℃下搅拌1小时。将反应混合物于真空中浓缩，添加水到所得残余物中。将混合物用乙酸乙酯(2x300ml)萃取，将乙酸乙酯萃取物合并，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩以得到6-溴-4-氟-1h-苯并[d][1,2,3]三唑(5.0g，23.1mmol，94.0％产率)。(m/z)：[m-h]-针对c6h3brfn3计算值213.94，实测值213.94。
制备65：6-溴-4-氟-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-苯并[d][1,2,3]三唑
将对甲苯磺酸(796mg，4.62mmol)添加到含于四氢呋喃(200ml)中的6-溴-4-氟-1h-苯并[d][1,2,3]三唑(5.0g，23.1mmol)的溶液中，接着添加3,4-二氢-2h-吡喃(7.7g，92.6mmol)并将反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应混合物于真空中浓缩并将所得残余物经由急骤管柱层析法使用10％乙酸乙酯/己烷纯化，以得到6-溴-4-氟-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-苯并[d][1,2,3]三唑(3.8g，12.7mmol，55.4％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c11h12brfn3o计算值300.01，实测值300.09。
制备66：(3s)-3-(((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-苯并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
在0℃下，将碳酸铯(1.50g，4.64mmol)添加到含于dmso(15ml)中的(s)-3-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(564mg，2.80mmol)的溶液中，接着添加6-溴-4-氟-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-苯并[d][1,2,3]三唑(700mg，2.34mmol)并将反应混合物在80℃下搅拌3小时。添加水并将混合物用乙酸乙酯萃取(3x)。将乙酸乙酯萃取物合并，用水和饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩以得到粗制残余物。将粗制残余物经由急骤管柱层析法使用30％乙酸乙酯/己烷纯化，以得到(3s)-3-(((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-苯并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(500mg，1.04mmol，45.6％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c21h30brn4o4计算值481.15，实测值481.2。
制备67：(3s)-3-(((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-苯并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
将苯酚硼酸(192mg，1.40mmol)添加到含于二恶烷(10ml)和水(2ml)中的(3s)-3-(((6-溴-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-苯并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(450mg，0.93mmol)的溶液中，接着添加磷酸钾(394mg，1.86mmol)并将反应用氩气脱气15分钟。添加2'-(二甲氨基)-2-联苯基-氯化钯(ii)二降莰基膦络合物(52mg，0.093mmol)并将反应混合物在微波照射下在110℃下搅拌40分钟。将反应混合物通过硅藻土过滤。添加水并将混合物用乙酸乙酯萃取(3x)。将乙酸乙酯萃取物合并，用饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸钠干燥并于真空中浓缩以得到粗制残余物。将粗制残余物经由急骤管柱层析法使用30％乙酸乙酯/己烷纯化，以得到(3s)-3-(((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-苯并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(300mg，0.607mmol，65.0％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c27h35n4o5计算值495.26，实测值495.06。
制备68：(s)-4-(4-(吡咯烷-3-基甲氧基)-1h-苯并[d][1,2,3]三唑-6-基)苯酚
将4m盐酸的二恶烷溶液(10.0ml，40mmol)添加到含于甲醇(2.ml)中的(3s)-3-(((6-(4-羟基苯基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-苯并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基)甲基)吡咯烷-1-甲酸(230mg，0.465mmol)的溶液中并将反应混合物在室温下搅拌5小时。将反应于真空中浓缩并将所得残余物用乙醚研磨，以得到呈盐酸盐的(s)-4-(4-(吡咯烷-3-基甲氧基)-1h-苯并[d][1,2,3]三唑-6-基)苯酚(225mg，0.649mmol，85.0％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c17h19n4o2计算值311.15，实测值311.06。
实例23：(s)-1-(3-(((6-(4-羟基苯基)-1h-苯并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基)甲基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮
在0℃下，将二异丙基乙胺(0.083ml，0.475mmol)添加到含于dmf(0.475ml)中的(s)-4-(4-(吡咯烷-3-基甲氧基)-1h-苯并[d][1,2,3]三唑-6-基)苯酚盐酸盐(32.9mg，0.095mmol)的溶液中，接着添加丙烯酰氯(7.7μl，0.095mmol)并将反应混合物在室温下搅拌15分钟。将反应混合物于真空中浓缩以得到棕色液体。将粗制液体经由制备级c18管柱层析法使用5到75％乙腈/含0.05％三氟乙酸的水的梯度纯化，以得到呈tfa盐的(s)-1-(3-(((6-(4-羟基苯基)-1h-苯并[d][1,2,3]三唑-4-基)氧基)甲基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮(2.5mg，0.068mmol，7.2％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c20h21n4o3计算值365.16，实测值365.1。
制备69：6-溴-4-氟-3-甲基-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑
将对甲苯磺酸(236mg，1.24mmol)添加到含于二氯甲烷(41ml)中的6-溴-4-氟-3-甲基-1h-吲唑(2.84g，12.4mmol)的溶液中，接着添加3,4-二氢-2h-吡喃(3.13g，37.2mmol)并将反应混合物在室温下搅拌3天。将反应混合物通过硅胶垫过滤并将滤液于真空中浓缩以得到6-溴-4-氟-3-甲基-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑(3.3g，10.5mmol，85％产率)。(m/z)：[m+na]+针对c13h14brfn2nao计算值335.02，实测值335.4。
实例24：(s)-1-(3-((6-(3-氯-4-羟基苯基)-3-甲基-1h-吲唑-4-基)氧基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮
在0℃下，将含60重量％氢化钠的矿物油(319mg，7.98mmol)添加到含于dmf(16ml)中的(s)-1-boc-3-羟基吡咯烷(1.3g，6.94mmol)的溶液中并将反应混合物在室温下搅拌20分钟。添加6-溴-4-氟-3-甲基-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑(1.00g，3.19mmol)并将反应混合物在室温下搅拌过夜。利用添加水将反应中止并将混合物于真空中浓缩以得到粗制中间体(3s)-3-((6-溴-3-甲基-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
将3-氯-4-羟基苯基硼酸(0.484g，2.81mmol)和磷酸三钾(1.19g，5.62mmol)添加到含于2:1二恶烷/水(9.5ml)中的粗制(3s)-3-((6-溴-3-甲基-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯的溶液中，并将反应混合物用氮气脱气10分钟。添加(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯基)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯基)]甲磺酸钯(ii)(xphos-g3-钯环)(95mg，0.112mmol)并将反应混合物在微波照射下在110℃下搅拌3小时。添加水并将混合物用乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯萃取物合并并于真空中浓缩以得到粗制中间体(3s)-3-((6-(3-氯-4-羟基苯基)-3-甲基-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
将4.0nhcl的二恶烷溶液(3.75ml，15.0mmol)添加到含于甲醇(0.5ml)中的粗制(3s)-3-((6-(3-氯-4-羟基苯基)-3-甲基-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吲唑-4-基)氧基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯的溶液中，并将反应混合物在60℃下搅拌30分钟。将反应混合物于真空中浓缩以得到粗制中间体(s)-2-氯-4-(3-甲基-4-(吡咯烷-3-基氧基)-1h-吲唑-6-基)苯酚。
将n,n-二异丙基乙胺(4.59ml，26.3mmol)添加到含于二氯甲烷(3.75ml)中的粗制中间体(s)-2-氯-4-(3-甲基-4-(吡咯烷-3-基氧基)-1h-吲唑-6-基)苯酚的溶液中，接着添加丙烯酰氯(60.9μl，0.750mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后于真空中浓缩以得到粗制残余物。将粗制残余物经由制备级c18管柱层析法使用0到40％乙腈/含0.05％三氟乙酸的水的梯度纯化，以得到呈tfa盐的(s)-1-(3-((6-(3-氯-4-羟基苯基)-3-甲基-1h-吲唑-4-基)氧基)吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮(7.6mg，0.015mmol，0.98％产率)。(m/z)：[m+h]+针对c21h21cln3o3计算值398.13，实测值398.3。
使用类似合成方法制备表1到12的化合物。
表1
表2
表3
表4
表5
表6
表7
表8
表9
表10
表11
表12
表13
表14
表15
表16
表17
表18
生物学检定
已于下列生物学检定中的一或多者中表征本发明的化合物。
检定1：生物化学jak和tyk2激酶检定
于常见激酶反应缓冲液(50mmhepes，ph7.5，0.01％brij-35，10mmmgcl2和1mmegta)中进行一组四个lanthascreenjak生物化学检定(jak1、2、3和tyk2)。重组gst标记的jak酶和gfp标记的stat1肽受质获自生命技术公司(lifetechnologies)。
在环境温度下，将经连续或离散稀释的化合物于白色384孔微量盘(corning)中用四种jak酶和受质各者预培育1小时。随后添加atp以于1％dmso的10μl总体积中引发激酶反应。jak1、2、3和tyk2的最终酶浓度分别为4.2nm、0.1nm、1nm和0.25nm；使用的对应kmatp浓度为25μm、3μm、1.6μm和10μm；而用于所有四个检定的受质浓度为200nm。允许在环境温度下进行激酶反应1小时，然后添加含于tr-fret稀释缓冲液(生命技术公司)中的edta(10mm最终浓度)和tb-抗-pstat1(ptyr701)抗体(生命技术公司，2nm最终浓度)的10μl制剂。允许将盘在环境温度下培育1小时，然后在envision读取器(珀金埃尔默(perkinelmer))上读取。记录和利用发射比信号(520nm/495nm)以计算基于dmso和背景对照的抑制％值。
针对剂量-反应分析，将抑制％数据相对于化合物浓度绘图，并自4-参数稳健拟合模型利用prism软件(格拉夫帕德软件公司(graphpadsoftware))测定ic50值。将结果表示为pic50(ic50的负对数)并随后使用cheng-prusoff方程式转化成pki(解离常数(ki)的负对数)。
检定2：细胞jak3效能检定：经il-2刺激的pstat5于tall-1t细胞中的抑制
于tall-1人类t细胞株(dsmz)中使用alphalisa量测测试化合物抑制经白细胞介素-2(il-2)刺激的stat5磷酸化的效能。因为il-2通过jak3信号传导，所以此检定提供jak3细胞效能的量度。
将经磷酸化的stat5经由alphalisasurefireultrapstat5(tyr694/699)试剂盒(珀金埃尔默)量测。
将来自tall-1细胞株的人类t细胞于37℃、5％co2加湿培育箱中于补充有以下的rpmi(生命技术公司)中培养：15％热失活胎牛血清(fbs，生命技术公司)、2mmglutamax(生命技术公司)、25mmhepes(生命技术公司)和1xpen/strep(生命技术公司)。将化合物于dmso中连续稀释并以声学方式分配到空孔中。将检定培养基(补充有10％fbs(atcc)的不含酚红的dmem(生命技术公司))分配(4μl/孔)并将盘以900rpm振荡10分钟。将细胞于检定培养基(4μl/孔)中以45,000个细胞/孔接种，并在37℃、5％co2下培育1小时，接着添加含于预加温检定培养基(4μl)中的il-2(r&dsystems；最终浓度300ng/ml)持续30分钟。于细胞因子刺激后，将细胞用含有1xphosstop和全锭剂(罗氏(roche))的6μl3xalphalisa裂解缓冲液(珀金埃尔默)裂解。将裂解物在室温下(rt)以900rpm振荡10分钟。将经磷酸化的stat5经由pstat5alphalisa试剂盒(珀金埃尔默)量测。在经绿光滤波的<100lux光下，将新制备的受体珠混合物分配到裂解物(5μl)。将盘以900rpm振荡2分钟，短暂旋转并在室温下于黑暗中培育2小时。在经绿光滤波的<100lux光下，将供体珠分配(5μl)。将盘以900rpm振荡2分钟，短暂旋转并在室温下于黑暗中培育过夜。在经绿光滤波的<100lux光下，使用envision盘读取器(珀金埃尔默)利用689nm处的激发和570nm处的发射量测发光。
为测定测试化合物响应于il-2的抑制效能，于人类t细胞株中量测结合到pstat5的珠的平均发射强度。自分析信号强度相对于化合物浓度的抑制曲线测定ic50值。将数据表示为pic50(负十进制对数ic50)值(平均值±标准偏差)。
检定3：经il-2刺激的pstat5于自鼠脾细胞分离的cd4+t细胞中的抑制
于自鼠脾细胞分离的cd4+t细胞中，使用alphalisa量测测试化合物抑制经白细胞介素-2(il-2)刺激的stat5磷酸化的效能。因为il-2通过jak3信号传导，所以此检定提供小鼠中的jak3细胞效能的量度。
将经磷酸化的stat5经由alphalisasurefireultrapstat5(tyr694/699)试剂盒(珀金埃尔默)量测。
将cd4+t细胞经由在磁性管柱(miltnyibiotec)上的负选择自鼠脾细胞分离和再悬浮于检定培养基(补充有10％fbs(atcc)的不含酚红的dmem(生命技术公司))中。将细胞于检定培养基(2μl/孔)中以50,000个细胞/孔接种。将化合物于dmso中连续稀释和稀释到检定培养基中的2x最终浓度。添加化合物(4μl/孔)并将细胞在37℃、5％co2下培育1小时，接着于预加温检定培养基(2μl)中添加il-2(r&dsystems；最终浓度7ng/ml)持续30分钟。于细胞因子刺激后，将细胞用2μl5xalphalisa裂解缓冲液(珀金埃尔默)裂解。将裂解物在室温下(rt)以900rpm振荡10分钟。将经磷酸化的stat5经由pstat5alphalisa试剂盒(珀金埃尔默)量测。在经绿光滤波的<100lux光下，将新制备的受体珠混合物分配到裂解物(5μl)。将盘以900rpm振荡2分钟，短暂旋转并在室温下于黑暗中培育2小时。在经绿光滤波的<100lux光下，将供体珠分配(5μl)。将盘以900rpm振荡2分钟，短暂旋转并在室温下于黑暗中培育过夜。在经绿光滤波的<100lux光下，使用envision盘读取器(珀金埃尔默)利用689nm处的激发和570nm处的发射量测发光。
为测定测试化合物响应于il-2的抑制效能，于自鼠脾细胞分离的原发性cd4+t细胞中量测结合到pstat5的珠的平均发射强度。自分析信号强度相对于化合物浓度的抑制曲线确定ic50值。将数据表示为pic50(负十进制对数ic50)值(平均值±标准偏差)。
于此检定中，化合物1到10、19、20、21和22全部具有超过6.0的pic50。
检定4：经il-2刺激的pstat5于人类pbmccd4+t细胞中的抑制
于人类外周血单核细胞(pbmc)cd4+t细胞中使用流式细胞计量测测试化合物抑制经白细胞介素-2(il-2)刺激的stat5磷酸化的效能。因为il-2通过jak3信号传导，所以此检定提供人类原发性细胞中的jak3细胞效能的量度。
将经磷酸化的stat5经由流式细胞计通过量测cd4+t细胞中的pstat5反应(碧迪(bectondisckinson)，alexafluor647小鼠抗人类stat5(py694)和pe小鼠抗人类cd4)量测。
将人类pbmc经由ficoll梯度自供体分离且在-80℃下冷冻。将经冷冻的pbmc解冻并于37℃、5％co2加湿培育箱中于补充有以下的rpmi(生命技术公司)中培养1小时：10％热失活胎牛血清(fbs，生命技术公司)、2mmglutamax(生命技术公司)、25mmhepes(生命技术公司)和1xpen/strep(生命技术公司)。将细胞以4e6个细胞/ml接种于2ml深的孔板中(50μl/孔)。将化合物于dmso中连续稀释和稀释到检定培养基中的2x最终浓度。添加化合物(100μl/孔)并将细胞在37℃、5％co2下培育1小时，接着于预加温检定培养基(50μl/孔)中添加il-2(r&dsystems；最终浓度100ng/ml)持续30分钟。于细胞因子刺激后，将细胞在37℃下固定10分钟(bectondickinson)。将细胞洗涤和再悬浮于杜贝克氏(dulbecco’s)磷酸盐缓冲盐水(dpbs，生命技术公司)中。将细胞用冰冷perm缓冲液iii(碧迪)渗透30分钟，并且然后洗涤并用含有2％胎牛血清的dpbs(染色缓冲液，生命技术公司)再悬浮。将细胞于染色缓冲液中用50x稀释的cd4表面标志物(pe小鼠抗人类cd4)和5x稀释的pstat5抗体(碧迪，alexafluor647小鼠抗人类stat5(py694))染色1小时。将细胞洗涤和再悬浮于染色缓冲液中，然后在4℃下储存。
为测定测试化合物响应于il-2的抑制效能，于人类pbmc中利用bdlsrii利用fcsexpress6中的分析量测cd4+闸控细胞中的pstat5的平均荧光强度。自分析信号强度相对于化合物浓度的抑制曲线确定ic50值。将数据表示为pic50(负十进制对数ic50)值(平均值±标准偏差)。
化合物1到6、8和9于此检定中经测试且展示极类似于检定2(经il-2刺激的pstat5于tall-1t细胞中的检定)中获得者的值。
检定5：jak细胞毒性检定
在正常生长条件下，于beas-2b人类肺上皮细胞(atcc)中进行celltiter-glo发光细胞活力/细胞毒性检定。
使细胞在37℃下于5％co2加湿培育箱中于补充有以下的50％dmem/50％f-12培养基(生命技术公司)中生长：10％fbs(hyclone)、100u/ml盘尼西林(penicillin)、100μg/ml链霉素(streptomycin)(生命技术公司)和2mmglutamax(生命技术公司)。在检定的第1天，将细胞于具有25μl培养基的白色384孔组织培养板(corning)中以500个细胞/孔密度接种，并允许于培育箱中粘附过夜。在检定的第2天，添加5μl含有剂量-反应的测试化合物的培养基并在37℃下培育48小时。随后添加30μlcelltiter-glo检测溶液(promega)，在定轨振荡器上混合5分钟，和再培育10分钟，然后在envision读取器上读取。记录发光信号和计算dmso对照％值。
对于剂量-反应分析，将dmso对照％数据相对于化合物浓度绘图以通过连接各数据点的线得到剂量-反应曲线。将各曲线与15％抑制临限值相交处的浓度定义为cc15。将结果表示为cc15值的负对数(pcc15)。
预期于此检定中展示更低pcc15值的测试化合物不太可能造成细胞毒性。于此检定中测试的本发明的化合物通常展示在5与约6之间的pcc15值。
检定6：caco-2渗透检定
进行caco-2渗透检定以模拟测试化合物于口服投与后穿过肠和进入血流的能力。测定溶液中测试化合物渗透经设计以模拟紧密连接的人类小肠单层的细胞单层的速率。
cacoready24孔转移盘板获自admecell(加利福尼亚州阿拉米达(alameda,ca))。在来自10mmdmso储备溶液的5μm的浓度下一式两份(n＝2)评价化合物。使用caco-2细胞单层连同维拉帕米(verapamil)(25μm)评价测试化合物的被动渗透性以抑制底外侧(a-b)方向顶端的p-gp转运蛋白。于37℃、5％co2培育箱中进行实验。caco-2培养基由经标准过滤的dmem、fcs10％、l-谷氨酰胺1％和penstrep1％组成。通过添加750μl转运缓冲液到a-b孔中制备基础检定板。通过自顶端孔移除caco-2培养基并用新鲜转运培养基((200μl重复总共3次洗涤))替换，制备cacoreadytm板。然后将空白培养基(200μl)用经稀释的化合物替换用于a-b孔。为开始培育，将基础板自培育箱移除并在其顶部添加顶端部分。在时间零点(t0)自顶端和基底室收集样本(40μl)。于120分钟后(t120)自顶端和基底室再次收集样本。将所有样本稀释和准备好用于通过lc-ms/ms的生物分析。以dq(流量)/(dtx面积x浓度)计算渗透系数(kp，意指a到b+维拉帕米p表观)(单位cm/sec)。
于此检定中，认为小于约5x10-6cm/sec的kp值有利于最小化全身性暴露和靶向结肠。小于约10x10-6cm/sec的kp值还可足以最小化全身性暴露和靶向结肠。相比之下，pf-06651600(全身可用的jak3抑制剂)(2-丙烯-1-酮，1-[(2s,5r)-2-甲基-5-(7h-吡唑并[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)-1-哌啶基])展示25的kp值。
体外检定结果
于上述检定中的一或多者中测试实例1到18和表1到12的所有化合物。
于下表13中，针对jak1、jak2、jak3和tyk2酶检定，a表示pki值≥10(ki≤0.1nm)，b表示pki值在9与10之间(ki在1nm与0.1nm之间)，c表示pki值在8与9之间(ki在10nm与1nm之间)，d表示pki值在7与8之间(ki在100nm与10nm之间)和e表示7或以下的pki值(100nm或更高的ki)。针对所有tall-1效能检定，a表示pic50值≥7.5(ic50≤32nm)，b表示pic50值在6.7(包含端值)与7.5之间(ic50在200nm与32nm之间)和c表示pic50值在6与6.7之间(ic50在1μm与200nm之间)。针对jak3(pki)-jak1(pki)值，a表示3或更高的值，b表示2.3到3的值和c表示1.8到2.3的值。针对caco检定，a表示低于5x10-6cm/sec的值，b表示在5x10-6与10x10-6cm/sec之间的值，c表示在10x10-6与22x10-6cm/sec之间的值。
表13
检定7：结肠和血浆小鼠药物动力学
通过po投与对6只雄性balb/c小鼠投与含于1％hpmc+0.1％tween-80中的10mg/kg的化合物。于剂量投与后的0.5、2和6小时，将动物麻醉，并通过心脏穿刺收集末梢血液样本，接着收集结肠内容物和结肠组织。
将血液样本收集到k2edta中并在湿冰上储存直到通过离心(在4℃下12000rpm)加工成血浆。将血浆样本转移到簇状管和放置在干冰上，然后冷冻储存。在各末梢血液收集时间点收集来自各动物的结肠内容物。将结肠组织用盐水冲洗并拍干。使用含有0.1％甲酸的无菌水9:1(水:组织，v/w)将结肠和结肠内容物组织均质化。将经均质化的组织和结肠内容物转移到簇状管和放置在干冰上，然后冷冻储存。使用lc/ms/ms对照分析标准分析所有样本。
通过非隔间分析使用phoenixwinnonlin版本6(certara,st.louis,mo)并使用2只动物/时间点的平均值测定化合物的复合药物动力学参数。对于低于定量限制(bql)的血浆浓度，使用可量测的最低浓度或bloq(低于定量限制)。
以结肠auc对血浆auc的比率测定结肠对血浆比率。化合物1、2、3、4、6、7、8、21和22展示超过约1250的结肠对血浆比率。化合物9、5、19和20展示超过约200的结肠对血浆比率。
相反，参考化合物(pf-06651600，全身可用的jak3抑制剂)(2-丙烯-1-酮，1-[(2s,5r)-2-甲基-5-(7h-吡唑并[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)-1-哌啶基])展示2.8的结肠对血浆比率。
检定8：经恶唑酮诱发的结肠炎的小鼠模型
经恶唑酮诱发的结肠炎为具有与人类溃疡性结肠炎组织学相似的实验模型(海勒(heller)等人，《免疫学》(immunology),2002,17,629-638)。于所述检定中，使用来自harlan的成年balb/c小鼠。在第1天，将动物用异氟醚轻度麻醉并小心移除肩膀之间的毛发，然后缓慢施加恶唑酮(4％，150μl，4:1丙酮:橄榄油调配物)或媒剂溶液用于皮肤敏化。于皮肤敏化后七天，将小鼠禁食约6小时，然后利用克他命(ketamine)/甲苯噻嗪(xylazine)注射麻醉并将配备有3.5-f导液管的填充有恶唑酮溶液的1ml注射器小心插入小鼠的结肠中约4cm。插入后，将50μl恶唑酮溶液(0.8％含于1:1乙醇:水调配物中)极缓慢注射(使用注射泵历经30秒)入结肠中。在恶唑酮直肠内(ir)激发之前一天启动药物治疗(po、qd或bid或tid)或媒剂。在恶唑酮直肠内激发后两天，由治疗盲选实验者针对各小鼠根据下列标准评分评估疾病：粪便性状评分(0，正常；2，松散；4，腹泻)、总出血评分(0，不存在；2，血染；4，存在)；组合粪便评分终点＝粪便性状评分+便血评分。
于所述检定中测试选定化合物。通过与来自经媒剂治疗的动物的评分相比组合粪便评分终点的统计上显著减少证明所述模型中的功效。
化合物1、2、3、4、5、6、7、8、3-11、5-10、19、15-1、3-55、3-34、15-3、21、3-80、3-81、3-72和3-57展示于恶唑酮模型中在3mg/kg(po，bid)的剂量下与经媒剂治疗的动物相比组合粪便评分终点的统计上显著减少。化合物3-113和3-74展示于恶唑酮模型中仅在1和10mg/kg(po，bid)的剂量下与经媒剂治疗的动物相比组合粪便评分终点的统计上显著减少。
检定9：小鼠脾自然杀手(nk)细胞中的免疫抑制作用
小鼠脾细胞的耗尽为免疫抑制的实验模型(库德拉茨等人，《美国移植杂志》(am.j.oftransplantation),2004,4,51-57)。于恶唑酮诱发的结肠炎模型(检定8)中使用的相同治疗范例后于小鼠脾细胞模型中评估选定化合物。
使用来自harlan的成年雄性balb/c小鼠用于所述研究。将测试化合物和作为阳性对照的jak3共价抑制剂标准2-丙烯-1-酮，1-[(2s,5r)-2-甲基-5-(7h-吡唑并[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)-1-哌啶基](30mg/kg，bid)对初始小鼠口服给药三天。在最后剂量达4小时后收获脾和立即压碎用于细胞亚型染色。在固定前，将用于cd19(fitc；b细胞)、cd3e(pe；泛t细胞)和cd49e(apc；nk细胞)的荧光团标记的抗体用来自各动物的脾细胞样本培育以允许在流式细胞计上同时多个亚型％分析。通过sceptertm2.0手持自动细胞计数器量测各动物的总脾细胞数目。
自各亚型的百分比乘以总脾细胞计算各动物的淋巴细胞亚型种群(例如，脾b、t和nk细胞)的绝对数目。使用单因子anova利用fisher的lsd事后测试来比较媒剂和测试化合物组的脾淋巴细胞数目。在p<0.05下设置α水平。针对各组，将数据表示为平均值±sem。
阳性对照pf-06651600(全身可用的jak3抑制剂)(2-丙烯-1-酮，1-[(2s,5r)-2-甲基-5-(7h-吡唑并[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)-1-哌啶基])(30mg/kgpo，bid)显著减少脾nk细胞计数。在多达300mg/kg(所测试的最大剂量)的(po，bid)剂量下，脾nk细胞计数不受化合物1影响。在多达100mg/kg(所测试的最大剂量)的(po，bid)剂量下，脾nk细胞计数不受化合物4、6和8影响。在多达85mg/kg(所测试的最大剂量)的(po,bid)剂量下，脾nk细胞计数不受化合物3影响。在多达30mg/kg(所测试的最大剂量)的(po，bid)剂量下，脾nk细胞计数不受化合物2影响。在多达80mg/kg(所测试的最大剂量)的(po,bid)剂量下，脾nk细胞计数不受化合物5影响。针对b和t细胞群体利用所测试化合物中的任一者未观察到治疗效果。
检定10：全身靶接合检定：胸腺中的经il-2诱导的pstat5诱导的鼠科模型
il-2为胃肠疾病(例如大肠激躁症)(ibd；关(guan)和张(zhang.)《炎症介质》(mediatorsinflamm),2017；4810258)的病理生理学根本的重要细胞因子。il-2结合到激活詹纳斯激酶家族(jak)成员(特别是jak3)的细胞表面受体，其然后使stat5磷酸化并随后激活其它转录路径。于此模型中，对小鼠全身性递送il-2的剂量以诱导stat5的磷酸化(pstat5)，然后量测所述磷酸化为终点。相较于经媒剂治疗的经il-2激发的对照动物，此检定中测试的化合物未展示经il-2诱导的pstat5的显著抑制，此证实缺少全身活性。
于所述检定中使用来自harlan的成年雄性balb/c小鼠。在研究前当日的下午并于研究日的上午经由口服管饲(po，针对单一剂量研究10或30mg/kg；针对剂量反应研究10到60mg/kg)对动物投与测试化合物。于第二po剂量投与后两小时，对小鼠腹膜内(i.p.)注射100μl适宜il-2剂量(取决于il-2批次，总计1到5μg/小鼠；r&dsystems)。于il-2刺激后90到120分钟，收获胸腺样本。于胸腺中使用alphalisa
在10mg/kg下测试化合物6和7和相较于媒剂治疗的经il-2激发的对照动物，未展示经il-2诱导的pstat5的显著抑制；因此证实缺少全身活性。在10、30、60和100mg/kg下测试化合物1和相较于媒剂，未展示经il-2诱导的pstat5的显著抑制。在10、30和60mg/kg下测试化合物2和相较于媒剂，未展示经il-2诱导的pstat5的显著抑制。在30和100mg/kg下测试化合物3和相较于媒剂，未展示经il-2诱导的pstat5的显著抑制。在30mg/kg下测试化合物8、5和4和相较于媒剂，未展示经il-2诱导的pstat5的显著抑制。
相反，参考化合物(pf-06651600，全身可用的jak3抑制剂)(2-丙烯-1-酮，1-[(2s,5r)-2-甲基-5-(7h-吡唑并[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)-1-哌啶基])在10、30和50mg/kg下展示胸腺中的pstat5诱导的显著抑制，其证实全身活性。
晶体结构
获得与人类jak3结合的化合物1、3和4各者的共晶体结构。复杂结构的分辨针对化合物1、化合物3和化合物4分别在
虽然已参考特定方面或其实施例描述本发明，但是一般技术者应了解，在不背离本发明的真正精神和范围下可作出各种改变或可取代等效物。此外，在适用专利法规和条例允许的范围内，本文中引用的所有公开案、专利和专利申请案的全文以引用的方式并入本文中，并入程度如同各文献个别地以引用的方式并入本文中般。
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