针对猪圆环病毒2型Cap蛋白的高亲和性多肽序列及其应用的制作方法

本发明涉及针对猪圆环病毒2型cap蛋白的高亲和性多肽序列及其应用，属于多肽设计及靶标蛋白分离纯化领域。

背景技术：

随着科技的不断发展，基于结构的分子对接虚拟筛选技术，作为一种亲和肽理性设计和筛选的重要手段，已成为近年来研究的热点。该方法主要是借助于计算机软件的快速运算实现小分子多肽在靶标蛋白活性位点上的逐一对接，这些小分子多肽来自于事先准备好的虚拟肽库，然后经过连续优化靶标蛋白的空间构象、氨基酸残基侧链等方面，找到小分子多肽与靶标蛋白最优的结合构象，计算出小分子多肽与生物大分子蛋白相结合的方式与亲和力，并且对结果进行打分，根据打分结果挑选出最佳配体，然后将最佳配体进行体外实验验证和筛选。

猪圆环病毒2型(procinecircovirustype2，pcv2)是造成猪圆环病毒相关性系统疾病(pcv2-systemicdisease，pcv2-sd)的首要病原，它常与其他病原混合感染引起猪的亚临床感染，对养猪业造成巨大的经济损失。pcv2为圆环病毒科圆环病毒属成员，是一种共价闭合、单股无囊膜的dna病毒，基因组大小约为1.7kb。病毒粒子为正二十面体的构象，直径约为17nm，是目前发现的最小动物病毒之一。pcv2基因组主要包含orf1和orf2两个开放阅读框，其中orf2编码病毒的主要结构蛋白cap，cap蛋白由233～234个氨基酸编码，该蛋白不仅可以自我组装成病毒样颗粒而且也是所有pcv2疫苗的主要成分，可以诱导机体产生高滴度的中和抗体水平。因此cap蛋白目前成为许多科研工作者的主要研究对象。

技术实现要素：

本发明借助于计算机辅助设计，在猪圆环病毒2型cap蛋白晶体结构的基础上，通过分子对接虚拟筛选技术，搜寻虚拟多肽数据库中与靶标蛋白结合模式与亲和力最佳的多肽配体，其多肽序列为kwwqswew，即l6-13。固相合成l6-13，利用表达纯化的pcv2cap蛋白分别进行elisa和局域表面等离子体共振(localizedsurfaceplasmonresonance，lspr)试验，结果表明，l6-13多肽能够与pcv2cap蛋白有良好的结合能力，由此证明，借助本发明设计而成的多肽，可用于对猪圆环病毒2型抗原进行快速检测和分离纯化。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

针对猪圆环病毒2型cap蛋白的高亲和性多肽序列，所述的多肽序列为kwwqswew。

所述的针对猪圆环病毒2型cap蛋白的高亲和性多肽序列，包括以所述的多肽序列为核心，任何对该多肽序列所进行的相应调整或修饰；修饰材料包括但不局限于纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定的蛋白质。

一种所述的多肽序列在猪圆环病毒2型cap蛋白的快速检测、纯化和疫苗中的应用。

所述快速检测包括但不局限于酶联免疫吸附试验(elisa)检测。

一种所述的多肽序列在猪圆环病毒2型抗原定量和定性的快速检测中的应用。

本发明的有益效果：

1、本发明基于猪圆环病毒2型cap蛋白的晶体结构(pdbid:3r0r)，通过分子对接虚拟筛选技术，获得一条可与猪圆环病毒2型cap蛋白特异性结合的多肽序列，其多肽序列为kwwqswew，即l6-13。固相合成l6-13，并与猪圆环病毒2型cap蛋白进行亲和力鉴定，l6-13序列与人工表达的pcv2cap蛋白之间相互作用的平衡解离常数kd为1.28×10^-7m，即128nm，说明亲和力较好。

2、由于猪圆环病毒纯化技术的局限性，针对猪圆环病毒的抗体获得很难，本发明设计得到的l6-13序列很好地避免了这一难题，实现快速人工合成与低廉检测成本。

3、本发明设计而成的l6-13序列与人工表达pcv2cap蛋白、人工接种pcv2均可以结合，与其它病毒蛋白均不发生交叉性反应，特异性较好。

4、与传统的噬菌体筛选多肽库相比，本发明具有简单，快速及成本低的特点；通过分子对接虚拟筛选技术，可为实现猪圆环病毒2型cap蛋白结构功能解析提供较好的理论指导。

5、本发明与人工表达纯化的蛋白进行免疫来获得针对蛋白抗体的过程相比，具有操作简单，省时省力，费用低等优点；通过对筛选l6-13序列进行标记，可对猪圆环病毒2型cap蛋白进行定性和定量的快速检测。

附图说明

图1为l6-13序列与cap蛋白的对接结果展示。

图2为l6-13序列与人工表达pcv2cap蛋白的lspr亲和力鉴定结果。其中，纵坐标代表传感器所检测到的信号值；横坐标代表样品在传感器中相互作用的时间。

图3为l6-13序列与人工表达pcv2cap蛋白的elisa鉴定结果。

图4为l6-13序列与人工接种pcv2的elisa鉴定结果。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1分子对接及虚拟肽库的筛选

1、cap蛋白晶体结构的准备

借助计算机辅助设计软件对猪圆环病毒2型cap蛋白的氨基酸序列和晶体结构进行分析，选定其第63～120氨基酸残基作为设定的对接区域，进行分子对接。

2、虚拟多肽库的设计

本发明采用逐个氨基酸残基延长的方式，首先将评分最高的几种氨基酸库逐个与靶标蛋白的结构实施对接，依据对接情况选择最佳的氨基酸残基为核心，再依次增加相应的氨基酸数量直至达到最佳的对接结果为止。虚拟多肽库生成的肽序列以2～9位氨基酸残基为宜。

3、对接结果的评断

分别计算多肽与蛋白结合的自由能，氢链，范得华力等力学参数进行综合评定，以此来判定筛选结果，并筛选得到l6-13，其多肽序列为kwwqswew(lys-trp-trp-gln-ser-trp-glu-trp)，其与cap蛋白对接的相互作用位置结果见图1。

实施例2l6-13序列与人工表达cap蛋白的亲和力鉴定

1、首先是cap蛋白芯片的制备，采用edc/nhs法将pcv2cap蛋白(5μg/ml)，共价耦合到lspr的羧基芯片上。当lspr的single≥500pm时，表明cap蛋白偶联成功，该传感器可以用于测量pcv2cap蛋白与l6-13序列之间的相互作用。

2、其次是运行传感器以获得稳定的信号基线，开始以150μl/min的最高流速运行pbs缓冲液(ph7.4)直至该传感器的信号基线达到平稳，然后，将流速降至20μl/min，准备上样。

3、使用pbs缓冲液将固相合成并在氨基端生物素化修饰的l6-13干粉预先配制成设定好的不同浓度，然后依次向传感器中注入不同浓度的l6-11溶液300μl(从低浓度到高浓度)，每次注入样品均采用20μl/min的流速与传感器相互作用5min，最后用pbs缓冲液在20μl/min的流速下冲洗5min。以得到的不同浓度l6-13溶液与pcv2cap蛋白相互作用的结合与解离曲线为依据，进行l6-13序列与pcv2cap蛋白相结合的亲和力分析(见图2)。

结果表明，l6-13序列与人工表达的pcv2cap蛋白具有较好的亲和性结合，两者之间相互作用的平衡解离常数kd为1.28×10^-7m，即128nm。

实施例3l6-13序列与人工表达cap蛋白的elisa鉴定

1、将纯化的pcv2cap蛋白用cbs溶液(ph9.6)稀释成10μg/ml，以50μl/孔的体积加入到elisa96孔板中；以同样方式将不同病毒表达纯化的蛋白，即猪瘟病毒e2蛋白(csfv-e2)、猪流行性腹泻病毒s蛋白(pedv-s)和2％牛血清白蛋白(bsa)、pbs缓冲液进行elisa96孔板包被，作为对照，4℃过夜包被。

2、elisa板用pbst缓冲液洗涤5次，1％的bsa液37℃封闭1h。

3、使用pbs缓冲液将固相合成的l6-13多肽稀释成1μg/ml的工作浓度，以50μl/孔的体积加入到上述elisa板中混匀，37℃，30min，pbst缓冲液洗涤elisa板5次。

4、使用pbs缓冲液将辣根过氧化物酶标记的亲和素(sa-hrp)稀释1000倍，以50μl/孔的体积加入到elisa板中混匀，37℃，30min。同样，用pbst缓冲液洗涤elisa板5次。

5、取100μl/孔的tmb显色液加入到elisa板中，充分混匀后，室温条件下，显色10min。

6、取50μl/孔的2m的硫酸液加入到上述elisa板中终止显色反应，并在450nm波长下测量各孔的elisa信号值，分析其结果。

结果表明，l6-13序列与人工表达pcv2cap2蛋白具有较好的亲和性与特异性结合，并且与其它病毒蛋白不发生反应(见图3)。

实施例4l6-13序列与人工接种pcv2的elisa鉴定

(1)将感染pcv2的pk-15细胞培养液进行超声破碎，然后以200tcid50进行elisa板包被；以同样方式将不同病毒培养液，即猪瘟病毒(csfv)、猪流行性腹泻病毒(pedv)和未感染病毒的pk-15细胞培养液进行酶标板包被，作为对照。其中，包被抗原均采用cbs缓冲液进行稀释，以50μl/孔的体积加入elisa板中，4℃过夜包被。

(2)elisa板用pbst缓冲液洗涤5次，1％的bsa液37℃温育1h。

(3)使用pbs缓冲液将固相合成的l6-13干粉稀释成1μg/ml的工作浓度，以50μl/孔的体积加入到上述elisa板中混匀，37℃，30min。pbst缓冲液洗涤elisa板5次。

(4)使用pbs缓冲液将辣根过氧化物酶标记的亲和素(sa-hrp)稀释1000倍，以50μl/孔的体积加入到elisa板中混匀，37℃，30min。同样，用pbst缓冲液洗涤elisa板5次。

(5)取100μl/孔的tmb显色液加入到elisa板中，充分混匀后，室温条件下，显色10min。

(6)取50μl/孔的2m的硫酸液加入到上述elisa板中终止显色反应，并在450nm波长下测量各孔的elisa信号值，分析其结果。

结果表明，l6-13序列与人工接种的pcv2细胞培养液具有较好的亲和性与特异性结合，并且与其它病毒培养液不发生反应(见图4)。

序列表

<110>河南省农业科学院

<120>针对猪圆环病毒2型cap蛋白的高亲和性多肽序列及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>8

<212>prt

<213>人工序列()

<400>1

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