基于PTBP1甲基化辅助诊断脑动脉瘤的检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及脑动脉瘤的辅助诊断技术领域，特别涉及一种辅助诊断脑动脉瘤的检测试剂盒及其应用，尤其指一种能用于检测与脑动脉瘤相关的ptbp1基因启动子区域dna甲基化程度的试剂盒及其应用。

背景技术：

脑动脉瘤是指颅内动脉的局部血管壁出现的异常囊状或梭形膨胀，最常见于颈内动脉系统的血管分叉处。脑动脉瘤破裂出血是蛛网膜下腔出血的首要病因，在脑血管意外病例中居第3位，仅次于脑梗死性疾病和高血压性脑出血。脑动脉瘤虽然是一种良性疾病，但其一旦破裂出血，便具有极高的致残率和死亡率，严重威胁人类的健康。这主要与脑动脉瘤破裂出血后导致的高颅内压、脑血管痉挛、脑内血肿的占位效应、脑积水、癫痫等相关。因此，脑动脉瘤的早期快速诊断的研究对该病的预防、治疗、改善预后、降低社会成本具有十分重要的意义。

多聚嘧啶结合蛋白1(polypyrimidinetractbindingprotein1,ptbp1)是一种高度保守的rna结合蛋白，能够选择性剪接调控蛋白。ptbp1在人类全身各个部位都有表达，并且参与了许多生物学过程。其表达可调控一系列靶基因mrna的表达进而维持细胞结构和运动、细胞周期、免疫和蛋白质代谢等。研究发现ptbp1蛋白的表达可以影响癌症的发生和发展。比如，ptbp1蛋白在结直肠癌组织中高表达，并与病人不良预后相关；ptbp1蛋白与乳腺癌肿瘤发生和肿瘤细胞生长是密切相关的。ptbp1基因的选择性剪接功能有可能影响到胚胎时期神经元形成的方式，从而产生不同的复杂形态和大脑尺寸。ptbp1的纵向动态可以作为帕金森病的一个生物标志物。研究显示，ptbp1蛋白能够调节肺动脉高压患者血管外膜成纤维细胞的代谢和增生。然而目前，国内外还没有公开任何关于ptbp1基因甲基化与脑动脉瘤的相关研究报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供检测方便，针对性强，准确率高的一种辅助诊断脑动脉瘤的检测试剂盒及其应用，通过对ptbp1基因启动子区域特定序列dna甲基化水平测定辅助诊断脑动脉瘤，检测方法简单快速、无创、效率高。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

基于ptbp1甲基化辅助诊断脑动脉瘤的检测试剂盒，所述的检测试剂盒内包括一对ptbp1基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一条ptbp1启动子区域dna甲基化特异性测序引物：

ptbp1启动子区域dna甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：

5’-gtatttgtggttattgtggaaatagt-3’；

ptbp1启动子区域dna甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：

5’-biotin-aaaaccctcaaaactccatattaatt-3’；

ptbp1启动子区域dna甲基化特异性测序引物的核苷酸序列：

5’-ggttattgtggaaatagtt-3’。

基于ptbp1甲基化辅助诊断脑动脉瘤的检测试剂盒的应用，所述的检测试剂盒能用于脑动脉瘤辅助诊断、检测或筛查药物。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了用于检测与脑动脉瘤相关的ptbp1基因启动子区域甲基化程度的检测试剂盒及其应用，ptbp1基因启动子区域dna甲基化水平与脑动脉瘤的患病率呈正相关。ptbp1基因启动子区域dna高甲基化水平可导致ptbp1基因的低表达，引起相关信号通路变化，从而引起脑部动脉血管的紊乱引发疾病。因此，以ptbp1基因启动子区域dna甲基化为靶点的药物有望成为脑动脉瘤辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。

脑动脉瘤的传统诊断都是基于影像学手段进行检查，而病人往往都是出现相关症状才到医院就诊。脑动脉瘤破裂前没有任何征兆，其死亡率极高，大概1/3的脑动脉瘤患者都是发病后送往医院救治的过程中死亡。本发明以检测ptbp1基因启动子区域dna甲基化水平为基础的检测试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对脑动脉瘤的检测，检测效率高，针对性强，有利于脑动脉瘤的早期发现和及时治疗。

附图说明

图1为ptbp1基因启动子区域被检测序列所在区域，具体位置为chr19:796,392-797,191,(grch37/hg19)，以及所检测的6个cpg位点的详细位置；

图2为ptbp1基因启动子区域dna甲基化水平检测结果示例(图中所示百分数为对应cpg位点的甲基化程度，如图示有cpg1到cpg6的甲基化程度分别为5%，6%，4%，7%，3%，0%)；

图3为脑动脉瘤与对照组之间ptbp1基因启动子区域dna甲基化差异(脑动脉瘤患者ptbp1基因甲基化程度显著高于对照组)；

图4为男性脑动脉瘤与对照组之间ptbp1基因启动子区域dna甲基化差异(脑动脉瘤患者ptbp1基因甲基化程度显著高于对照组)；

图5为女性脑动脉瘤与对照组之间ptbp1基因启动子区域dna甲基化差异(脑动脉瘤患者ptbp1基因甲基化程度显著高于对照组)；

图6为ptbp1基因启动子区域dna甲基化与脑动脉瘤的敏感性和特异性(auc=0.78，最佳临界点时的敏感度为75.0%，特异性为79.2%)。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

基于ptbp1甲基化辅助诊断脑动脉瘤的检测试剂盒，所述的检测试剂盒内包括一对ptbp1基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一条ptbp1启动子区域dna甲基化特异性测序引物：

ptbp1启动子区域dna甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：

5’-gtatttgtggttattgtggaaatagt-3’；

ptbp1启动子区域dna甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：

5’-biotin-aaaaccctcaaaactccatattaatt-3’；

ptbp1启动子区域dna甲基化特异性测序引物的核苷酸序列：

5’-ggttattgtggaaatagtt-3’。

基于ptbp1甲基化辅助诊断脑动脉瘤的检测试剂盒的应用，所述的检测试剂盒能用于脑动脉瘤辅助诊断、检测或筛查药物。

基于ptbp1启动子区域dna甲基化辅助诊断脑动脉瘤的检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

步骤一、提取检测样本的全血基因组dna，并检测dna浓度；

步骤二、亚硫酸氢盐处理试剂盒对样本dna进行亚硫酸氢盐转化；

步骤三、转化后的样本进行甲基化检测；

步骤四、数据分析。

以下是本发明具体的实施例，在下述施例中，除本发明有特殊限定外，所采用的试剂、原料和设备均可以通过购买获得。

1、研究对象的收集

募集志愿者，根据脑动脉瘤的国际诊断标准收集病例组，健康志愿者作为对照组，并采用调查表的形式调查志愿者的一般情况，同时采取静脉血，进行一般血生化检测，具体如下：

从某医院收集经磁共振成像和血管造影术证实的脑动脉瘤患者48例，年龄48.08±5.69岁；收集性别匹配、年龄相仿的48名正常人作为对照组，年龄46.63±6.04岁。对照组均排除心脑血管病，和其他严重疾病如恶性肿瘤、严重肝肾疾病等。所有研究对象进行空腹抽血检测血脂、血糖等一般生化指标，同时抽取静脉血3ml入edta抗凝管中，用于提取基因组dna。

2、基因组dna的提取

采用qiagen公司的全基因组dna抽提试剂盒，按照标准流程提取dna。采用核酸蛋白测定仪检测所得dna的浓度，以供ptbp1基因dna甲基化水平的检测。

3、dna甲基化水平测定

本研究采用焦磷酸测序技术对ptbp1基因启动子区域(grch37/hg19，chr19:796,392-797,191)的6个cpg位点(如图1)进行了dna甲基化水平分析。此技术的基本原理：用重亚硫酸盐处理dna样品后，再应用聚合酶链反应(pcr)扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶(c)碱基保持不变，而使未发生甲基化的c转变成了尿嘧啶(u)，然后通过测序引物进行pcr测序，从而得到哪个位点发生了甲基化。本次研究采用pyromarkassaydesign软件进行引物设计，用于实验的pcr扩增引物和测序引物如下：

(1)ptbp1启动子区域dna甲基化特异性上游引物(forwardprimer)

5’-gtatttgtggttattgtggaaatagt-3’；(seqidno.1)；

(2)ptbp1启动子区域dna甲基化特异性下游引物(reverseprimer)

5’-biotin-aaaaccctcaaaactccatattaatt-3’(seqidno.2)；

(3)ptbp1启动子区域dna甲基化特异性测序引物(sequencingprimer)

5’-ggttattgtggaaatagtt-3’(seqidno.3)。

具体实验步骤：

步骤a.采用qiagenepitect®亚硫酸氢盐处理试剂盒(epitechbisulfitekits;qiagen;#59104)对样本dna进行亚硫酸氢盐转化。

步骤b．取步骤a中转化过的dna样本20ng加入到pcr扩增体系中，并加入5×buffergc(kapa)10μl；dntp(10mm/each)1μl；primer(up50pm/ul)1μl；primer(down50pm/ul)1μl；template2μl；taq(5u/μl)0.2μl；最终根据dna浓度定容总体积至50μl。

pcr扩增程序如下：首先95℃变性持续3min；接着进行40个循环的退火反应，其中包括94℃30s，56℃30s，72℃1min；然后进行72℃延伸反应持续7min。

步骤c.焦磷酸测序：

1).在96孔pcr反应板中加入反应结合珠2μl，结合缓冲液38μl，pcr产物40μl，室温下充分混匀10min；

2).开启真空泵吸取结合珠及pcr产物混悬液，依次浸入70%乙醇，0.2mnaoh和冲洗缓冲液中各5s；

3).关闭真空泵，后将探头上结合珠及pcr产物置于40μl退火缓冲液(含测序引物1.5μl)中，85℃变性2min，冷却至室温，使引物与模板退火杂交；

4).根据pyrosequencing软件序列设计信息所计算出剂量，在试剂舱中依次加入底物混合物、酶混合物及四种dntp(qiagen)；

5).将试剂舱及96孔反应板放入pyrosequencing检测仪(pyromarkq96id，qiagen)进行反应，然后应用使用焦磷酸测序仪自带的pyroq—cpg软件自动分析每个位点甲基化状态(甲基化水平检测结果见图2)。

4、结果分析

本次研究采用spss22.0软件对结果进行统计学分析。通过病例对照组比较，我们发现脑动脉瘤患者中ptbp1基因启动子区域平均甲基化程度均高于对照组(见图3,p<0.0001)，其中除位点3外，其余cpg位点甲基化水平都高于正常人组(见图3，位点1,2,4,5，p<0.001；位点6，p<0.05)。此外，我们也发现在男性(见图4，p<0.001)和女性(见图5，p<0.05)脑动脉瘤患者中ptbp1基因启动子区域的平均甲基化程度都显著增高。并且ptbp1基因启动子区域甲基化与脑动脉瘤的敏感性和特异性分析(见图6)，显示auc=0.78，95%ci=0.69-0.88，最佳临界点时的敏感度为75.0%，特异性为79.2%。

本发明辅助诊断脑动脉瘤的检测试剂盒具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点。采用上述试剂盒对ptbp1基因启动子区域甲基化水平进行检测，能够快速、可靠地为脑动脉瘤的辅助诊断、检测或筛查药物提供借鉴。

本发明的最佳实施例已被阐明，由本领域普通技术人员做出的各种变化或改型都不会脱离本发明的范围。

序列表

<110>宁波市第一医院

<120>基于ptbp1甲基化辅助诊断脑动脉瘤的检测试剂盒及其应用

<141>2019-03-19

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(unknown)

<400>1

gtatttgtggttattgtggaaatagt26

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列(unknown)

<400>3

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