本发明属于褐藻胶裂解酶制备技术领域，具体涉及一种褐藻胶裂解酶的高效制备方法及应用。
背景技术：
褐藻酸是由古洛糖醛酸及甘露糖醛酸通过β-1,4糖苷键连接形成的异多糖，是褐藻细胞壁的主要成分。褐藻酸及其盐类，因其具有高粘度及易形成凝胶等性能，已在食品、化工及制药等领域取得较广泛应用。然而，较高的分子量及有限的水溶性限制了褐藻酸及其盐类的应用。相对而言，其降解产物褐藻酸寡糖，因其较低的分子量及更好的生物活性，具有更广阔的应用前景。
褐藻胶裂解酶可通过β消除方式裂解褐藻酸的糖苷键，产生含有不饱和双键的褐藻酸寡糖。目前，已有大量不同来源的褐藻胶裂解酶被克隆、表达及鉴定。现有技术中褐藻胶裂解酶的制备大多是通过质粒载体转入到大肠杆菌中进行表达获得，其存在一些技术缺陷，例如，游离的质粒载体表达不稳定，经多次传代后易丢失；大肠杆菌表达的褐藻胶裂解酶alg2a在细胞内，必须经过细胞破碎才能获得目标酶，增加了大规模制备的难度。
技术实现要素：
本发明的目的是，提供一种褐藻胶裂解酶alg7d的制备方法及应用；旨在提供一种经济高效的特异性褐藻胶裂解酶。为获得高效安全的褐藻胶裂解酶，对来源于嗜糖菌属细菌的褐藻胶裂解酶编码基因进行优化、全合成并在毕赤酵母中实现了分泌表达。表达的褐藻胶裂解酶具有实现褐藻酸寡糖工业制备的应用潜力。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：
本发明通过对褐藻胶裂解酶编码基因的密码子进行优化，以利于其在毕赤酵母中分泌表达，从而高效快速的获得水解活性高的褐藻胶裂解酶。
本发明提供的一种褐藻胶裂解酶alg7d，其氨基酸序列如seqidno.1所示。所述褐藻胶裂解酶alg7d的编码基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示。
本发明所述的褐藻胶裂解酶alg7d的制备方法为：将核苷酸序列如seqidno.2所示的褐藻胶裂解酶基因构建至表达载体中，然后导入毕赤酵母细胞，诱导培养并获得分泌表达的褐藻胶裂解酶。
所述褐藻胶裂解酶alg7d的具体制备步骤包括：(1)根据毕赤酵母密码子使用的偏好性，对来源于嗜糖菌属的褐藻胶裂解酶基因原始序列进行密码子优化；(2)将优化后的基因进行全合成并构建至表达载体pgbg1中；(3)对构建的表达载体进行酶切线性化后，舍弃含有抗性基因的片段，回收含有褐藻胶裂解酶基因的片段并导入毕赤酵母细胞gs115中，诱导并获得分泌表达的褐藻胶裂解酶。
在对褐藻胶裂解酶alg7d的编码基因进行优化的过程中，为了使褐藻胶裂解酶在毕赤酵母中能够更大量的表达，仅选取原始褐藻胶裂解酶的羧基端催化区域(氨基酸331-611)编码基因进行优化及表达，而去除了氨基端的多糖结合区域以及5’端的信号肽序列。在进行基因表达时，是利用了毕赤酵母载体中自带的信号肽实现分泌表达。这是使得优化基因高效表达的关键技术。
利用诱导表达的褐藻胶裂解酶粗酶上清对褐藻酸钠底物进行水解并使用液相及质谱方法对产物的聚合度及组成进行分析。分析结果表明：得到的粗酶液能够实现对褐藻酸钠的完全水解。
本发明所述的褐藻胶裂解酶可单独用于褐藻酸及其盐类的降解制备褐藻酸寡糖；或者所述褐藻胶裂解酶与其他褐藻胶裂解酶混合使用，协同降解褐藻酸及其盐类。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1.本发明的褐藻胶裂解酶基因来源于嗜糖菌属，使用巴斯德毕赤酵母表达系统分泌表达。巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)表达系统已被用于乳糖酶及磷脂酶c等食品级酶制剂的表达，其自身也被用于木聚糖酶的生产(gb2760-2014)。因此，使用嗜糖菌属来源的褐藻胶裂解酶基因在毕赤酵母中分泌表达，其产物褐藻胶裂解酶可成为食品级褐藻酸寡糖的生产用酶制剂。
2.本发明中的褐藻胶裂解酶基因由于根据毕赤酵母的密码子偏爱性进行了优化，可实现在毕赤酵母中高效分泌表达。经活性测定及换算，0.1ml粗酶液(约含有0.03mg酶蛋白)可完全水解1g褐藻酸钠，具有规模制备褐藻酸寡糖的应用潜力。
3.与现有的专利技术相比：a、通过基因重组方式将目的基因整合至毕赤酵母基因组中，比游离的质粒载体表达更加稳定，不易因为多次传代而丢失。b、在毕赤酵母中分泌表达的酶类，由于分泌在胞外，因此无需进行细胞破碎等工艺，发酵液获得的粗酶液无需纯化即可直接用于褐藻酸寡糖的制备。
附图说明
图1为本发明实施例2中的重组表达载体alg7d-pgbg1及其xhoi与noti双酶切产物凝胶电泳图谱。
图2为本发明实施例3中的重组表达毕赤酵母gs115菌株褐藻酸钠底物平板酶活初筛图。
图3为本发明实施例3中含褐藻胶裂解酶基因的毕赤酵母工程菌的发酵液上清的sds-page图谱。
图4为本发明实施例4中酶解产物褐藻酸寡糖aos-alg7d的hplc分析图谱。
图5为本发明实施例4中酶解产物褐藻酸寡糖aos-alg7d的质谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
实施例1褐藻胶裂解酶基因的密码子优化及全基因合成
在不改变氨基酸序列的前提下，对来源于嗜糖菌属菌株2-40(saccharophagusdegradans2-40)的褐藻胶裂解酶编码基因进行密码子优化，优化后的密码子全部为毕赤酵母偏爱密码子，具体序列见seqidno.2。优化后的基因序列与褐藻胶裂解酶alg7d的原始序列(如序列seqidno.3所示，genbankaccessionnumber:cp000282.1)一致性(identity)为75％。需要说明的是，为了使褐藻胶裂解酶在毕赤酵母中能够更大量的表达，仅选取原始褐藻胶裂解酶的羧基端催化区域(氨基酸331-611)编码基因进行优化及表达，而去除了氨基端的多糖结合区域。优化后的基因序列委托北京擎科兴业生物技术有限公司进行全合成，合成获得的基因序列记为alg7d。
实施例2褐藻胶裂解酶基因alg7d的表达载体构建
首先使用限制性内切酶xhoi及noti对含有褐藻胶裂解酶基因alg7d的克隆载体进行双酶切，获得目的基因片段，同时使用相同的内切酶对表达载体pgbg1进行双酶切，回收大片段。两个回收产物进行连接，获得重组载体，命名为alg7d-pgbg1。为确定目标褐藻胶裂解酶基因已经构建至载体中，使用xhoi及noti对重组载体进行双酶切，并对产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。根据图1可知：经双酶切后，在750bp和1000bp之间出现了目的基因片段，与alg7d的片段长度879bp相符。
实施例3褐藻胶裂解酶毕赤酵母工程菌的筛选及褐藻胶裂解酶制备
将获得的重组质粒alg7d-pgbg1经限制性内切酶bglii线性化后，凝胶电泳分离并切取含有目的基因的核酸大片段，电击导入毕赤酵母gs115中，通过组氨酸营养缺陷md平板上筛选得到重组菌落。挑取其中的8个菌落划线至含有0.2％褐藻酸钠的bmmy琼脂平板上，30℃培养48h后，倒入10％氯化十六烷吡啶(cetylpyridiniumchloride，cpc)水溶液进行显色，发现仅5号克隆菌株表现出褐藻胶裂解活性，参见图2，为重组表达毕赤酵母gs115菌株褐藻酸钠底物平板酶活初筛图。挑取其中的5号菌株单菌落，接种于50mlbmgy培养基中，30℃及250rpm下培养48h，离心弃上清，加入等量的bmmy进行诱导表达。24h后补加甲醇至其终浓度为1％，以后每隔24h补加一次，共计诱导72h后离心，上清液即为含有褐藻胶裂解酶alg7d的粗酶液。使用sds-page检测蛋白表达情况，其结果如图3所示，在25-35kda之间出现了两个条带，推定为表达的褐藻胶裂解酶(预测分子量31.2kda)及其糖基化产物。bradford法测定粗酶液中的蛋白质浓度为0.30mg/ml；dns法(使用葡萄糖绘制标准曲线，1u定义为1min内水解产生1μmol还原糖所需的酶量)，在40℃下测定其比酶活为11.45u/ml。上述的md琼脂平板、bmmy琼脂平板、bmgy培养基、bmmy培养基为酵母表达系统常用的培养基，可直接购买或者按照现有文献技术配制均可。
实施例4：褐藻胶裂解酶alg7d酶解制备褐藻酸寡糖
称取20g褐藻酸钠，加至200ml去离子水中，加入上述实施例3中制备的褐藻胶裂解酶alg7d粗酶液2ml)。40℃下搅拌反应72h，调节温度至90℃维持1h，灭活酶类。离心去除不容物，上清经冷冻干燥得成品褐藻酸寡糖，记为aos-alg7d。称取一定量制备的褐藻酸寡糖冻干样品，配置成褐藻酸寡糖浓度为5mg/ml的乙腈水溶液(乙腈：水，1:1，v/v)，过滤后用于高效液相色谱分析。高效液相色谱仪连接蒸发光散射检测器用于寡糖的信号检测，使用xamide色谱柱(华谱新创科技有限公司)对褐藻酸寡糖进行分离，乙腈浓度递减(70％-50％)方式洗脱，柱温为30℃，检测器气压23psi，流速：1ml/min。流动相为0.1m甲酸胺(ph3.2)、乙腈及水。洗脱时间：40min。结果如图4所示，从图4可以看出，得到了多种潜在的褐藻寡糖组分。采用质谱对其组分进行分析。质谱条件为采用负离子模式，离子源电压：3kv；鞘气流速：40arb；毛细管温度：270℃；扫描范围：300-2000。检测结果如图5所示，从图5可以看出：可检测到不同聚合度的褐藻酸寡糖。
需要说明的是，在对褐藻胶裂解酶基因优化的过程中，我们尝试进行优化并合成了8个褐藻胶裂解酶基因，但是结果只有其中两个优化的基因在毕赤酵母表达系统中实现了高效的分泌表达，这两个优化的基因分别来源于黄杆菌属菌株s20以及本申请中所述的嗜糖菌属菌株2-40。其它优化的基因在毕赤酵母表达系统中表达的褐藻胶裂解酶均是没有活性或者活性较低，有的优化基因则是无法在毕赤酵母系统中顺利分泌表达。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
序列表
<110>中科荣信（苏州）生物科技有限公司
<120>一种褐藻胶裂解酶alg7d及其制备方法和应用
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