lncRNA和lncRNA抑制剂的应用及应用其的产品的制作方法

本发明涉及生物医学工程技术领域，尤其是涉及一种lncrna和lncrna抑制剂的应用及应用其的产品。

背景技术：

目前，心血管疾病是导致人类死亡的第一杀手，动脉粥样硬化斑块破裂所致的缺血性心脏病是导致死亡的主要原因。如何早期预测动脉粥样硬化斑块破裂和干预血栓形成是目前医学和生物学研究亟待解决的难题。

非编码长链rna(longnon-codingrna，lncrna)是一类广泛存在于真核生物、长度为大于200的非蛋白质编码rna，它们能以序列特异性方式调节基因表达，在发育、凋亡、代谢以及人类疾病方面都起着不容忽视的作用。lncrna的生理病理调控机制是近几年来受到高度重视的一门新型学科。lncrna在心血管疾病，尤其是动脉粥状硬化中的应用，仍处于研发阶段，需要不断的探索和研究。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供lncrna的应用，本发明的第二个目的在于提供用于特异性检测lncrna的引物的应用，本发明的第三个目的在于提供一种用于诊断和/或预后评估动脉粥样硬化的试剂盒，本发明的第四个目的在于提供lncrna抑制剂的应用，本发明的第五个目的在于提供一种用于预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物，以缓解现有技术中存在的动脉粥状硬化相关lncrna研究不足的现状。

本发明提供了lncrna在制备用于诊断和/或预后评估动脉粥样硬化的试剂盒中的应用，所述lncrna含有seqidno.1所示的序列。

另外，本发明还提供了用于特异性检测lncrna的引物在制备用于诊断和/或预后评估动脉粥样硬化的试剂盒中的应用，所述lncrna含有seqidno.1所示的序列。

进一步的，所述用于特异性检测lncrna的引物为：

lncrna-f：

5’-ccggaattccggagcgcctaggagccc-3’(seqidno.2)；

lncrna-r：

5’-ccgctcgagttaaaatcctttggt-3’(seqidno.3)。

另外，本发明还提供了一种用于诊断和/或预后评估动脉粥样硬化的试剂盒，所述试剂盒包括用于特异性检测lncrna的引物，所述lncrna含有seqidno.1所示的序列。

进一步的，所述用于特异性检测lncrna的引物为：

lncrna-f：

5’-ccggaattccggagcgcctaggagccc-3’(seqidno.2)；

lncrna-r：

5’-ccgctcgagttaaaatcctttggt-3’(seqidno.3)。

另外，本发明还提供了lncrna抑制剂制备用于预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用，所述lncrna含有seqidno.1所示的序列。

进一步的，所述lncrna抑制剂为所述lncrna的寡核苷酸衍生物，所述寡核苷酸衍生物中的β-d-呋喃核糖的2'-o、4’-c位可通过缩水作用形成刚性结构。

另外，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物，所述药物包括lncrna抑制剂，所述lncrna含有seqidno.1所示的序列。

进一步的，所述lncrna抑制剂为所述lncrna的寡核苷酸衍生物；

优选地，所述lncrna抑制剂具有如seqidno.4所示的序列。

进一步的，所述药物的给药方式包括口服给药或者注射给药；优选地，所述注射给药包括静脉注射、肌肉注射、或者冠状动脉内注射。

本发明提供的lncrna在h2o2处理的ha-vsmc细胞中表达量增加，并且westenblotting技术测定细胞中抗凋亡蛋白bcl-2表达减少；而且，lncrna质粒转染扩增的腺病毒灌注，能够促进小鼠原代血管平滑肌细胞的凋亡，并且能够促进动脉粥样硬化炎症的发生和粥样斑块的大小和数量；而lncrna抑制剂能够使细胞死亡率降低，且经检测发现，经lncrna抑制剂处理的细胞中抗凋亡蛋白bcl-2表达增加。因此，lncrna可以作为一种新的生物标志物，应用于动脉粥样硬化的诊断和/或预后评估；而与之相应的lncrna抑制剂，可以作为一种新型的药物用于动脉粥样硬化的预防和/或治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的lncrna-punisher在动脉粥样硬化模型小鼠中主动脉的表达情况结果图；

图2为本发明实施例1提供的lncrna-punisher在动脉粥样硬化临床样本中的表达情况结果图；

图3a为本发明实施例2提供的采用细胞流式法测定对照组ha-vsmc细胞的凋亡率的结果图；

图3b为本发明实施例2提供的采用细胞流式法测定lncrna-punisher抑制组ha-vsmc细胞的凋亡率的结果图；

图3c为本发明实施例2提供的采用细胞流式法测定ha-vsmc细胞的凋亡率的统计结果图；

图4为本发明实施例3提供的采用cck8法测定ha-vsmc细胞的增殖率的结果图；

图5a为本发明实施例3提供的细胞划痕实验结果图；

图5b为本发明实施例3提供的利用imagej计算迁移面积的分析结果图；

图6a为本发明实施例2提供的采用westenblotting技术检测lncrna-punisher抑制剂对ha-vsmc细胞中bcl-2蛋白表达的影响的wb结果图；

图6b为本发明实施例2提供的采用westenblotting技术检测lncrna-punisher抑制剂对ha-vsmc细胞中bcl-2蛋白表达的影响的wb条带灰度值的结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中涉及的lncrna可以为：与seqidno.1所示序列完全相同的序列，或者含有seqidno.1所示序列的序列，或者seqidno.1所示序列的生物活性功能片段，或者seqidno.1所示序列的变体。凡是具备seqidno.1所示序列功能的序列，都应当理解为本发明的保护范围，而不应当仅理解为与seqidno.1所示序列完全相同的序列。

其中，seqidno.1所示的序列为：

agcgcctaggagcccgtaccgctggggacctccccttccgcgaaccccgagcgggtagacccagagcaatccgagtgtggaaacaatggagagggggcgtgttgagctggggtctccatgcctcgttggggagagggagctcacgtacccacagcagcagttgcgtgatgacgacgtgggcgagctcggccgccaggtggagtggggagcgcagctgtgggtcctctacgctggtgtcgagcggcccgtgtcgcgcatgggccaaaagcaggagaacggtagccacgtcctgggcctgcacggcggcccacagctggcggcccagcggctcctccgaggtgctcagcggcgccaggaacagtagctgctcgtacttggcgcgaatccacgactcgcgctcctccctgcaagaccagggatcaacggaaaaggctctagggacccccagccaggacttctgcccctacccacgggaccgtctcaggttcgcacaccctcagcaaccctccccccgctctgttccctcacgcttaccgcgaagagtcccgcgagggcttggcacggcctcgcgtgtcgctttcccacacgcggttggccgtgtcgttgccaatagccgtcagcaccagggtcagctcccgtggccagtcgtccaagtccagcgagcgaacgcgggacaggtgtgtgcccaggttgcggtggatgccagaacactcgatgcagatgagggcgcccaggttcaagctggcccacgtggggtctgcggaaggagcgtagaggtcggctcccagccgggcagcacaggcaccccggcattcactacactccctagcccctccgctgcctcctggcactcactgggggccccgcagtccacgcagattgaattccccttggcgttccggatcgcctggatggccacggcctcgctttggctgtctgtgcgcagctgcagagagggtttgggttggcactgactctgcctccaagccccacctccttctcagacacctctgctctcctctcacacgacttcggccgtgtcgttgccaatggccgtcagcaccagggtcagttcctgcggccagtcctccactccacctcaaactcttaccttgaccttgctgctctcacagcattgcagactggctaggatctgactctcgatggcctggacccaggcatcccgctcctcaaaactggctgcctcaaagtgccacgtctgacccgtgctggacacgatcaggaactcaaagttttcctctgagtgggggatgggatggggtcattaagggacagagttcaagcaggggctgcctttcccaagaccgtcctccctgatgtccatcccgagcccctgggagtggggcagtgggggtagggaaagcagagggtggggggcagcaggaagcccgagcacatgcaggggaaggcgggggcacccccacccttctgcaccccagctgagcgcccctcccggctccccacttgttacctgctttataaatatttcttaaactaccaaaggattttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。

本发明涉及的用于特异性检测lncrna的引物，既包括扩增lncrna序列的引物，又包括检测lncrna序列的探针。

本发明提供的用于预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物，包括有效剂量的lncrna抑制剂，优选的有效剂量为0.5-2μg/kg。

另外，本发明提供的用于预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物中，可将lncrna抑制剂包装成病毒。

本发明提供的用于预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物，可以将lncrna抑制剂与药剂学上可以接受的载体或者辅料联合使用，载体或者辅料选自壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或多种。

本发明涉及的lncrna抑制剂，为lncrna的寡核苷酸衍生物，该寡核苷酸衍生物中的β-d-呋喃核糖的2'-o、4’-c位通过缩水作用形成刚性的结构，形成锁核酸，从而将一部分核糖上的2'与4'碳连结在一起达到抑制该rna活性的目的。

抑制剂序列为：ccaccucaaacucuuaccuugaccu(seqidno.4)。

为了有助于更清楚的理解本发明的内容，现结合具体的实施例详细介绍如下。如未明确指出，以下实施例中涉及的实验操作方法为常用的分子生物学操作方法，涉及的试剂、仪器为常规的市售试剂或者仪器。

除非特别指出，以下实施例中涉及的lncrna-punisher，即为lncrna。

除非特别指出，以下实施例中涉及的lncrna的核苷酸序列即为seqidno.1所示的序列。

材料

以下各实施例中使用的主要实验材料和试剂如下：

ha-vsmc细胞购自atcc(美国标准生物品收藏中心)；

triquick试剂购自北京索莱宝科技有限公司；

dntps购自上海博亚生物技术有限公司；

m-mlv逆转录酶购自takara公司；

核糖核酸酶抑制因子(ribonucleaseinhibitor)和real-timertpcr试剂盒均购自takara公司；

引物序列委托华大公司合成。

实施例1lncrna-punisher在小鼠动脉粥样硬化主动脉组织和临床血液样本中表达量的测定

本实施例选取高脂饲养3个月的apoe-^/-小鼠(c57bl/6j)摘取的主动脉和临床血液样本。之后，triquick试剂提取总rna，制备c-dna，real-timertpcr法检测lncrna-punisher的表达量，并且以健康小鼠主动脉和健康人的血液作为对照。

1、总rna提取：

采用triquick试剂分别提取细胞总rna。

(1)选取0.1g主动脉组织或者300μl血清直接加入1mltriquick。用取样器吹打混匀。

(2)4℃12000rpm离心10min，取上清。每使用1mltriquick向样品中加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置5min。

(3)4℃12000rpm离心15min，样品分为三层。rna主要在无色的水相。把水相转移到新管中。

(4)在转移到新管中的水相中加入等体积的冰冷异丙醇，混匀，室温放置20min。

(5)4℃12000rpm离心10min，去上清。加入1ml75％乙醇(用rnase-free水配制)洗涤沉淀。4℃7000rpm离心5min，弃上清。

(6)室温放置凉干，加入适量rnase-free水，充分溶解rna。

(7)-80℃保存rna样品。

2、lncrna-punisher的c-dna制备

加m-mlv前后充分混匀，42℃1h，95℃5min，-20℃保存样品。

3、real-timepcr法检测lncrna-punisher的表达量

采用real-timertpcr试剂盒(购自takara公司)检测lncrna-punisher的表达量。

1)设计引物序列如下：

lncrna-f：

5’-ccggaattccggagcgcctaggagccc-3’(seqidno.2)；

lncrna-r：

5’-ccgctcgagttaaaatcctttggt-3’(seqidno.3)。

2)lncrna-punisherreal-timertpcr反应体系如下：

real-timertpcr反应条件如下：

3)数据处理：

lncrna-punisher表达量用下式计算：

δct样品＝ct样品-ct样品u6

δct对照＝ct对照-ct对照u6

δδct＝δct样品-δct对照

lncrna-punisher相对表达量变化＝2^-δδct

结果如图1和图2所示，从结果图中可以看出，与健康组小鼠对比，实验组lncrna-punisher在动脉粥样硬化临床样本中的表达量明显增多。

实施例2lncrna-punisher抑制剂促进ha-vsmc细胞的凋亡率

本实施例选取对数生长期的ha-vsmc细胞，用细胞转染技术将分别将4μglncrna-punisher抑制剂(即为合成的lncrna-punisher反义核酸序列)转入ha-vsmc细胞中，以转入lncrna-control(5’-uucuccgaacgugucacgutt-3’)的细胞为阴性对照，采用细胞流式法测定ha-vsmc细胞的凋亡率。

实验结果如图3a、图3b和图3c所示，在ha-vsmc细胞中，抑制内源性lncrna-punisher，发现能够显著促进ha-vsmc细胞的凋亡。可见，lncrna-punisher抑制剂降低了ha-vsmc细胞的凋亡率。

此外，还采用westenblotting技术检测lncrna-punisher抑制剂对ha-vsmc细胞中bcl-2蛋白表达的影响。

电泳结果见图6a和图6b，图6a是wb结果，图6b是利用imagej计算wb条带灰度值的结果，从图中可以看出，在ha-vsmc细胞中，抑制内源性lncrna-punisher能够显著抑制bcl-2蛋白的表达。表明lncrna-punisher抑制剂降低了ha-vsmc细胞中bcl-2蛋白的表达。

实施例3lncrna-punisher抑制剂降低ha-vsmc细胞的增殖和迁移

本实施例选取对数生长期的ha-vsmc细胞，用细胞转染技术分别将4μglncrna-punisher抑制剂(即为合成的lncrna-punisher反义核酸序列)转入ha-vsmc细胞中，以转入lncrna-control的细胞为阴性对照，采用cck8法测定ha-vsmc细胞的增殖率，划痕实验测定ha-vsmc细胞的迁移率。

实验结果如图4所示，在ha-vsmc细胞中，抑制内源性lncrna-punisher，检测细胞的生物学功能，发现lncrna-punisher的表达降低能够显著抑制ha-vsmc细胞的增值；可见，lncrna-punisher抑制剂降低了ha-vsmc细胞的增殖率。同时，图5a和图5b显示，在ha-vsmc细胞中，抑制内源性lncrna-punisher，检测细胞的生物学功能，发现lncrna-punisher的表达降低能够显著抑制ha-vsmc细胞的迁移。

血管平滑肌细胞是血管壁的主要组成成分之一。血管平滑肌细胞的过度增殖和迁移对于动脉粥样硬化的发生、发展有着重要影响。在生理状态下，vsmc以比较慢的速度进行更新，而在动脉粥样硬化发展时期，vsmc增殖和迁移加速，从而造成了动脉内膜粥样的突起和斑块的产生。

因此，lncrna-punisher可以作为一种新的生物标志物应用于动脉粥样硬化的诊断和/或预后评估。此外，lncrna-punisher的锁核酸可以作为一种新型的药物用于动脉粥样硬化的预防和/或治疗。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

sequencelisting

<110>青岛大学

<120>lncrna和lncrna抑制剂的应用及应用其的产品

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

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<212>dna

<213>智人种（homosapiens）

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agcgcctaggagcccgtaccgctggggacctccccttccgcgaaccccgagcgggtagac60

ccagagcaatccgagtgtggaaacaatggagagggggcgtgttgagctggggtctccatg120

cctcgttggggagagggagctcacgtacccacagcagcagttgcgtgatgacgacgtggg180

cgagctcggccgccaggtggagtggggagcgcagctgtgggtcctctacgctggtgtcga240

gcggcccgtgtcgcgcatgggccaaaagcaggagaacggtagccacgtcctgggcctgca300

cggcggcccacagctggcggcccagcggctcctccgaggtgctcagcggcgccaggaaca360

gtagctgctcgtacttggcgcgaatccacgactcgcgctcctccctgcaagaccagggat420

caacggaaaaggctctagggacccccagccaggacttctgcccctacccacgggaccgtc480

tcaggttcgcacaccctcagcaaccctccccccgctctgttccctcacgcttaccgcgaa540

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cctcctggcactcactgggggccccgcagtccacgcagattgaattccccttggcgttcc900

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taaatatttcttaaactaccaaaggattttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1560

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ccaccucaaacucuuaccuugaccu25