用于小报春不同组织基因表达分析的内参基因及其引物的制作方法

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及用于小报春不同组织基因表达分析的内参基因及其引物。

背景技术：

实时荧光定量pcr(quantativereal-timepcr,qrt-pcr)是在pcr扩增过程中，添加荧光物质以便对pcr进程进行实时检测。其定量的依据是在pcr扩增的指数时期，模板的ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，该技术克服了常规pcr的缺点，并且由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点迅速发展，现在已经应用到生命科学研究的各个领域。

利用qrt-pcr技术可以进行基因表达分析，然而，在分析过程中，rna的质量和产量、反转录效率的差异以及其他阻碍因素等都会对目的基因表达结果的准确性产生影响。因此需要选择合适的内参基因进行校正和标准化，从而减小检测样本之间的差异。

理想的内参基因应该在所有的细胞中和生理状态下都能较稳定地表达，可以完全用于不同类型的样品，但是在实际过程中，随着试验条件的变化，没有任何一种内参基因的表达是始终稳定的，即在一种实验条件下合适的内参基因并不一定适用于另一种实验条件，或者不同物种间的内参基因也可能是不同的。未经验证地使用一种基因作为内参，轻则可能难以发现基因表达的细小差别，重则可能出现完全相反的结果。使用不稳定表达的内参基因可能对靶基因表达量分析有极大影响，因此在具体实验条件下选择表达稳定的内参基因至关重要。

研究者通常使用看家基因作为内参，因为这些基因广泛参与有机体的基本生化反应，这使得其在某些器官组织中可以稳定地表达。目前，常用的传统内参有肌动蛋白基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因、组蛋白基因、微管蛋白基因、泛素结合酶基因和延伸因子等。迄今为止，关于报春花属植物内参基因筛选的领域依旧是一片空白。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供一种用于小报春组织基因表达分析中稳定性更高的内参基因。

本发明提供的用于小报春不同花期荧光定量pcr的内参基因，其为gapdh和stpp，所述的gapdh的序列如seqidno.1所示，所述的stpp的序列如seqidno.9所示。

本发明还提供用于小报春不同组织基因表达分析的试剂，其包括：

1)检测所述的gapdh表达水平的物质；和

2)检测所述的stpp表达水平的物质。

在本发明一个优选的实施方案中，所述检测所述的gapdh表达水平的物质为扩增所述基因或其片段的引物；所述检测所述的stpp表达水平的物质为扩增所述基因或其片段的引物。

在本发明一个更为优选的实施方案中，所述的检测所述的gapdh表达水平的物质为序列如seqidno.17所示的单链dna和序列如seqidno.18所示的单链dna；所述的检测所述的stpp表达水平的物质为序列如seqidno.25所示的单链dna和序列如seqidno.26所示的单链dna。

本发明还提供含有所述试剂的用于小报春不同组织基因表达分析的试剂盒。

在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒还可含有分析基因表达所需的其他成分，如pcr所需要的其它试剂。

在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒还可含有用于检测不同组织表达的目标基因表达水平的物质，如目标pcr所需要的引物，优选还含有pcr所需要的其他试剂。

本申请中，术语“组织”可指植物器官或其部分，也可以指植物的组织或其部分。所述的小报春不同组织可为根、茎、叶、花等器官或组织或它们的一部分。

本发明还提供所述试剂在小报春不同组织基因表达分析中的应用。

本发明以小报春不同花期的花器官和不同组织为试验材料，基于前期的转录组测序数据，从中选取10个内参基因进行试验，并分别利用genorm、normfinder和bestkeeper软件对所得结果进行分析评估。不同组织条件下，gapdh、csd和stpp是最稳定的基因。相比于单基因内参，gapdh和stpp组合使用作内参可以得到更可靠的结果。

附图说明

图1所示为候选内参基因引物扩增片段。

图2所示为10个候选内参基因的熔解曲线图。

图3所示为所有样品中qrt-pcrct值。盒中的线表示中位数，盒子上端和下端分别表示25％和75％，上下边缘线分别表示最大和最小值。

图4所示为genorm软件分析结果(上：所有样品；下：不同组织)。

图5所示为genorm最佳内参基因数目分析。

图6所示为venn图分析最佳内参基因。

图7所示为不同内参基因组合对pflis/nes在不同组织表达量的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

试验所用小报春采集于2016年2月至4月。取不同开花时期的花朵。不同花期包括4个阶段：花蕾期、初花期、盛花期和末花期。各阶段的描述标准如下：花蕾期：花朵处于未开放状态，花萼紧紧包裹花瓣；初花期：花朵处于半开放状态，花萼外展，花瓣伸长；盛花期：花朵处于完全盛开状态，花萼和花瓣完全展开；末花期：花朵处于开放状态，花萼和花瓣出现萎蔫并向后翻展。不同组织包括：根、花茎、叶和花(盛花期)。根在采集后用清水仔细洗尽泥土并用滤纸吸干水分。所有的样品在采集后立即用液氮冷冻并保存于-80℃环境中。

从转录组测序数据库中选出与拟南芥同源性较高的10个基因序列作为候选内参基因(表1)，包括6个传统内参基因(28s,act,tua,tub,his,gapdh)和4个新型内参基因(rpl18a,stpp,csd,rnapolii)。利用primerpremier5.0进行引物设计。

表1候选内参基因信息

注：blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)

通过熔解曲线分析和普通pcr对设计的10对qrt-pcr引物特异性进行验证。

普通pcr反应体系如下：

反应条件为：95℃3min；95℃30s，48-58℃30s，72℃30s，30个循环；72℃5min。反应完成后通过1％琼脂糖凝胶电泳检测各pcr产物。结果如图1所示。从图1可以看出，各候选内参基因普通pcr均有与预期大小相符的pcr产物，条带明显、单一，无非特异性扩增，说明引物特异性良好，可用于后续试验。

以cdna为模板，用ddh2o依次稀释5个梯度，每个梯度稀释10倍，即每个模板的浓度分别为1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4。每个反应设置3个重复。利用analytikjenaqtower2.2荧光定量仪(ag，德国)进行qrt-pcr试验，反应体系如下，反应条件：95℃3min；95℃5s，80℃30s，44个循环；60-95℃熔解曲线分析。试验设置了3个技术重复，并通过仪器自动读取相关数据。候选内参基因引物及相关信息如表2所示。

qrt-pcr反应体系：

结果见表2和图2。可知各候选内参基因标准曲线相关系数r²>0.988，扩增效率均在90％-110％之间，熔解曲线均只产生单一熔解峰，无非特异性扩增干扰。上述试验结果说明各候选内参基因的线性分析和扩增效率均符合要求。

表2候选内参基因引物及相关信息

在小报春7个样品中，10个候选内参基因的ct值在17-26之间。ct值越大，基因表达量越低；反之亦然。由图3可知，act的ct值最小(17.63)而csd的ct值最大(26.58)，说明act高丰度表达，而csd低丰度表达。此外，各候选内参基因在不同样品中的表达变化差异明显，其中，act的波动较大，tua次之，而tub和rnapolii的表达变化较小。

实施例2内参基因稳定性分析

为了筛选出最佳的内参基因，每一个候选内参基因的稳定性都经由genorm(version3.5)、normfinder(version0.953)和bestkeeper(version1.0)分析评定。其中，bestkeeper使用原始ct值进行计算，而输入genorm和normfinder的数据则需先根据公式q＝e^-δct计算得出，其中e为基因扩增效率，δct＝ct样品-ctmin。

通过三种不同软件genorm，normfinder和bestkeeper综合分析qrt-pcr数据结果，确定候选内参基因在两个不同组别(所有样品、不同组织)的最佳内参基因。

genorm分析候选内参基因稳定性

genorm软件能够计算出每个候选内参基因的表达稳定值m，即：根据单个内参基因与其他内参基因表达水平的两两比值后的对数变换从而计算出的平均标准差，m值越低表示该候选内参基因的表达越稳定，反之亦然。当m>1.5时，说明该基因极不稳定，不适宜做内参基因。

由图4可知，大部分的m值都小于1.5。在所有样品组，his和28s表达最稳定；而在不同组织组，rpl18a和stpp表现最佳。

此外，该软件还可以通过计算引入1个新的内参基因后标准化因子(normalizationfactor)的配对变异(pairwisevariation)v值来预测最佳内参基因的个数，默认的v值为0.15，若vn/vn+1>0.15，则需要引入第n+1个基因，反之则不必引入新的内参基因。由图5可知小报春不同条件下的最佳内参基因个数。一般来说，当v>0.15时，则需引入第n+1个基因，然而该值在某些条件下显得过于严格，因其不仅取决于基因数量，也受被测样品本身的影响。在本试验中，三个组别的v值均大于0.15。在所有样品组，当引入第5个基因时，v值最低，且随后随着基因数量的增加v值并没有显著降低，故该组的最佳内参基因数量为4；同理，在不同组织组，当引入第3个和第5个基因时，v值最小，考虑到增加基因个数会增加试验成本，故其最佳内参基因个数为2。

normfinder分析候选内参基因稳定性

normfinder是基于方差分析产生基因表达稳定值，然后根据稳定值的大小排序，最终将表达稳定值最小的基因作为最稳定的基因。

由表3可知，gapdh在所有样品组中表达稳定，而act则表现极不稳定；在不同组织组中，csd表达最稳定，act表达波动明显。

表3normfinder软件分析结果

bestkeeper分析候选内参基因稳定性

bestkeeper程序是由michael等编写的针对内参基因和目标基因进行表达量分析的程序。根据软件要求将原始ct值直接输入，该程序即可在每个基因之间产生配对的相关系数(correlationofcoefficient，r)和每个基因在不同样品中的变异系数，其中，相关系数r值越高，候选内参基因越稳定。由表4可知，gapdh在两个组别中都位列第一，说明其稳定性最高，此外，在不同组织组，gapdh、csd和stpp是最稳定的基因，tub则表现最差。

表4bestkeeper软件分析结果

实施例3内参基因验证

通过参考genorm预测的最佳内参基因个数，并结合韦恩图(图6)分析，试验最终确定了最佳内参基因验证的不同组合，其中，不同组织组最佳内参基因包括：stpp、gapdh、stpp+gapdh，以及最不稳定的内参基因tub。

pflis/nes基因被用于验证小报春不同组织条件下的最佳内参基因结果的准确性。pflis/nes基因的荧光定量rt-pcr的引物如seqidno.31和32所示。

在小报春的不同组织中，当使用稳定表达的候选内参基因时，结果呈现出高度的相似性，pflis/nes主要在花器官中表达，在花茎和叶中表达较低，而在根中不表达。然而当使用不稳定的tub作内参基因时，pflis/nes在花茎和叶中的表达量出现偏差，明显高于正常表达水平，这与软件预测的结果是相符的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>四川天艺优境环境科技有限公司

四川农业大学

<120>用于小报春不同组织基因表达分析的内参基因及其引物

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