一种支原体鉴定琼脂培养基及其制备方法与流程

本发明涉及培养基领域，尤其涉及一种用于解脲支原体的支原体鉴定琼脂培养基，以及利用该培养基对支原体进行培养鉴定的方法。

背景技术：

支原体（mycoplasma）归属于柔膜体纲，支原体目（mycoplasmatales），支原体科，是一群大小介于细菌与病毒之问的病原体，是机会致病菌。支原体在泌尿生殖道存在定植现象，人群中存在着相当数量的支原体携带者而没有症状和体征，以uu最为突出。

培养法是目前国内医疗机构进行解脲支原体和人型支原体检测的主要手段，而且主要是使用液体培养基直接检测并同时进行支原体药敏试验，已经沿用近20年，但在临床中已暴露出很多缺陷，如假阳性率高、假阴性、以及污染干扰严重等。液体培养法易受到细菌或真菌的污染导致假阳性，因此需要固体培养基确认菌落形态才能最后诊断。

固体琼脂法可以观察支原体特征性的菌落，如“海胆型”或“油煎蛋样”菌落是微生物学诊断的金标准，但是解脲支原体在固体培养基中菌落极其小，难以观察。uu在生长过程中产生尿素酶是其最重要的一个生理特征，尿素酶可以和多种金属离子发生氧化，生成不透明的氧化物。传统支原体琼脂培养基采用硫酸锰增大解脲支原体菌落的大小便于观察，但是硫酸锰对支原体具有一定的毒性，在增大菌落的同时会抑制支原体的生产。

为了解决支原体在固体琼脂上菌落小，难以观察的难题，国内外专家学者进行了大量的研究。现在市面上的固体琼脂培养基均以a7鉴别琼脂（a7differentialagar）发展改进而来，选用硫酸锰增大支原体菌落的大小，以便进行观察。但正如上所述，由于硫酸锰对支原体生长的抑制作用，导致这类固体琼脂培养基的灵敏度非常的低，达不到支原体检测的要求。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足,提供一种成分简单、增大菌落效果好且灵敏度高的支原体鉴定琼脂培养基，以及该培养基的制备方法，该方法步骤简单，易于实现，大大地降低了成本。

本发明所述支原体鉴定琼脂培养基所采用的技术方案是：按质量百分比计算，该培养基包括以下成分：基础培养基5.2～9.4％，添加剂0.309～0.645％，血清5.0～9.0％，余量为纯化水，其中，所述添加剂内包含有cacl2，所述cacl2在培养基中的占比为0.04～0.06％。

进一步地，按在培养基中的质量百分占比计算，所述基础培养基包括以下组分：琼脂粉1.0～1.5％，胰酪胨1.0～1.5％，大豆胨0.3～0.6％，葡萄糖0.3～0.6％，磷酸氢二钾0.3～0.6％，氯化钠0.3～0.6％，酵母提取液2.0～4.0％。

再进一步地，按在培养基中的质量百分占比计算，所述添加剂还包括以下组分：尿素0.12～0.26％，精氨酸0.12～0.26％，酚红0.02～0.05％，青霉素钾0.003～0.005％，氨苄西林钠0.003～0.005％，两性霉素0.003～0.005％。

本发明所述支原体鉴定琼脂培养基的有益效果是：本发明摒弃了传统的加入硫酸锰作为添加剂的做法，而是采用cacl2作为添加剂的一部分，解决了目前支原体固体琼脂培养基灵敏度与解脲支原体菌落大小无法兼顾的问题，目前使用的硫酸锰虽然可以增大解脲支原体菌落的大小，但是也会抑制支原体的生长，影响产品的灵敏度，本发明以cacl2作为支原体菌落增强剂具有非常好的效果，既可增强解脲支原体菌落的大小，也不会抑制支原体的生长，不会影响产品的灵敏度；作为支原体检测金标准可以提高目前检测方法准确性：目前液体培养基假阳性多，固体培养基由于硫酸锰对支原体的抑制作用导致灵敏度低，假阴性多，本发明产品灵敏度高、菌落易观察，可以很好的弥补目前市场上产品的缺陷。

此外，上述支原体鉴定琼脂培养基的制备方法包括以下步骤：

（1）基础培养基的制备：按比例称取琼脂粉、胰酪胨、大豆胨、磷酸氢二钾、葡萄糖、氯化钠和酵母提取液，直接加入纯化水中，加热使完全溶解，充分混匀后用2mol/mlhcl调节ph值至6.3±0.05，将培养基加热煮沸5分钟后，经121℃、15分钟高压灭菌备用；

（2）添加剂的制备：按比例称取尿素、精氨酸、酚红、青霉素钾、氨苄西林钠、两性霉素、cacl2，充分溶解于纯化水中备用；

（3）培养基的配制：在百级洁净条件下，将高压灭菌后的基础培养基冷却至55～56℃，将无菌过滤后的血清加热至55～56℃，按照比例量取血清加入基础培养基中，充分混匀；将经过无菌过滤的添加剂加入基础培养基中，充分混匀，用2mol/mlhcl调节培养基ph值至6.05±0.05；

（4）固体培养基制备：在百级洁净条件下，对培养基进行无菌分装，待培养基充分冷却凝固后，即得到固体培养基。

进一步地，所述步骤（3）中，血清和添加剂均采用0.22μm的滤膜进行无菌过滤。

上述方案可见，本发明所述支原体鉴定琼脂培养基的制备方法步骤简单，易于实现，大大地降低了成本。

附图说明

图1是利用本发明支原体鉴定琼脂培养基进行uu菌落培养前的菌落示意图，图中所示为40倍放大图；

图2是利用本发明支原体鉴定琼脂培养基进行uu菌落培养后的菌落示意图，图中所示为40倍放大图，图中显示，菌落清晰可见，且数量大，说明培养基的营养丰富，培养效果好；

图3是另一实施例利用本发明支原体鉴定琼脂培养基进行uu菌落培养后的菌落示意图，图中所示为40倍放大图，图中显示，菌落清晰可见，且菌落体积大，说明培养基的营养丰富，培养效果好。

具体实施方式

本发明所述支原体鉴定琼脂培养基按质量百分比计算，该培养基包括以下成分：基础培养基5.2～9.4％，添加剂0.309～0.645％，血清5.0～9.0％，余量为纯化水，其中，所述添加剂内包含有cacl2，所述cacl2在培养基中的占比为0.04～0.06％。所述纯化水由纯水机制得。

具体地，按在培养基中的质量百分占比计算，所述基础培养基包括以下组分：琼脂粉1.0～1.5％，胰酪胨1.0～1.5％，大豆胨0.3～0.6％，葡萄糖0.3～0.6％，磷酸氢二钾0.3～0.6％，氯化钠0.3～0.6％，酵母提取液2.0～4.0％。所述添加剂除了含有cacl2，还包括以下组分：尿素0.12～0.26％，精氨酸0.12～0.26％，酚红0.02～0.05％，青霉素钾0.003～0.005％，氨苄西林钠0.003～0.005％，两性霉素0.003～0.005％。

上述支原体鉴定琼脂培养基的制备方法包括以下步骤：

（1）基础培养基的制备：按比例称取琼脂粉、胰酪胨、大豆胨、磷酸氢二钾、葡萄糖、氯化钠和酵母提取液，直接加入纯化水中，加热使完全溶解，充分混匀后用2mol/mlhcl调节ph值至6.3±0.05，将培养基加热煮沸5分钟后，经121℃、15分钟高压灭菌备用。

（2）添加剂的制备：按比例称取尿素、精氨酸、酚红、青霉素钾、氨苄西林钠、两性霉素、cacl2，充分溶解于纯化水中备用。

（3）培养基的配制：在百级洁净条件下，将高压灭菌后的基础培养基冷却至55～56℃，将无菌过滤后的血清加热至55～56℃，按照比例量取血清加入基础培养基中，充分混匀；将经过无菌过滤的添加剂加入基础培养基中，充分混匀，用2mol/mlhcl调节培养基ph值至6.05±0.05，其中，血清和添加剂均采用0.22μm的滤膜进行无菌过滤。

（4）固体培养基制备：在百级洁净条件下，对培养基进行无菌分装，待培养基充分冷却凝固后，即得到固体培养基。

用纯水机进行纯化水制备的过程如下：

1、纯水机开机：开启进水阀，接通水机电源，按下“总电源“按钮，相继启动原水泵、高压泵、纯水泵、按下“手动/自动”按钮，此时指示灯亮，说明设备处于自动状态。

2、当设备处于自动档时，当水机制水至纯水箱高液位时，自动停止制水；当纯水箱内的水位处于最低液位时，水机自动开始制水。

3、停机：按下高压泵、纯水泵按钮，此时，指示灯灭。

4、ro（反渗透装置）部分操作（正常工作情况下不需要此项操作）：水机制水时，ro浓水阀完全打开，ro纯水阀控制在250流量。高压进水阀控制在小于等于0.30mpa，ro进出水阀控制在小于等于1.2mpa，产水电阻一般大于10mώ.cm。

5、新制出的水保存期限不得超过7天，每周将将贮水灌的水全部放掉一次。纯化水管道每6个月消毒一次。

6、纯水制备主要技术参数：6.1、进水要求：市政自来水，水质符合gc5749-2006；6.2、进水水量：>2t/h；6.3、使用环境温度：5-35度；6.4、ro最佳操作压力：0.8-1.0mpa；6.5、ro最大操作压力：1.2mpa；6.6、产水水量（25度）：250l/h；6.7、产水水质：电导<20us/cm。

下面以具体实施例来对本发明作进一步的说明。

实施例1

按质量百分比计算，该培养基包括以下成分：

琼脂粉1.0％，胰酪胨1.0％，大豆胨0.3％，葡萄糖0.3％，磷酸氢二钾0.3％，氯化钠0.3％，酵母提取液2.0％，尿素0.12％，精氨酸0.12％，酚红0.02％，青霉素钾0.003％，氨苄西林钠0.003％，两性霉素0.003％，cacl20.04％，血清5.0％，余量为纯化水。将以上成分按上述方法进行培养基制备，制得固体培养基。在制得的培养基上进行uu菌落培养，得到如表1所示的结果。

实施例2

按质量百分比计算，该培养基包括以下成分：

琼脂粉1.25％，胰酪胨1.25％，大豆胨0.45％，葡萄糖0.45％，磷酸氢二钾0.45％，氯化钠0.45％，酵母提取液3.0％，尿素0.19％，精氨酸0.19％，酚红0.035％，青霉素钾0.004％，氨苄西林钠0.004％，两性霉素0.004％，cacl20.05％，血清7.0％，余量为纯化水。将以上成分按上述方法进行培养基制备，制得固体培养基。在制得的培养基上进行uu菌落培养，得到如表1所示的结果。

实施例3

按质量百分比计算，该培养基包括以下成分：

琼脂粉1.5％，胰酪胨1.5％，大豆胨0.6％，葡萄糖0.6％，磷酸氢二钾0.6％，氯化钠0.6％，酵母提取液4.0％，尿素0.26％，精氨酸0.26％，酚红0.05％，青霉素钾0.005％，氨苄西林钠0.005％，两性霉素0.005％，cacl20.06％，血清9.0％，余量为纯化水。将以上成分按上述方法进行培养基制备，制得固体培养基。在制得的培养基上进行uu菌落培养，得到如表1所示的结果。

实施例4

1.用780ml纯水溶解培养基基础。加入如下成分并搅拌均匀。

2.121℃灭菌15min。

3.待冷却至55℃时，加入预热的无菌5ml增菌液、10ml新鲜酵母提取物、5ml青霉素g溶液、200ml马血清、10ml10%尿素溶液。混匀后倒平板。得到传统的硫酸锰的培养基。在制得的培养基上进行uu菌落培养，得到如表1所示的结果。

表1

由上述实施例可知，利用本发明制备得到的培养基进行uu菌落培养，以cacl2作为支原体菌落增强剂具有非常好的效果，既可增强解脲支原体菌落的大小，也不会抑制支原体的生长，不会影响产品的灵敏度；且灵敏度高、菌落易观察，可以很好的弥补目前市场上产品的缺陷。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡本行业的普通技术人员均可按以上所述而顺畅地实施本发明；但是，凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，可利用以上所揭示的技术内容而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。