本发明属于多肽纯化领域，具体是涉及一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法。
背景技术：
多肽是由20种氨基酸以不同的组成和排列方式通过肽键(酰胺键)相互连接而成的化合物，除了是组成蛋白质的基本结构单元，同时也是生物体内的重要活性物质，在生物界中分布较为广泛。在生命活动当中，涉及到各种毒素、激素、抗菌肽、信息素、细胞因子等生物活性多肽广泛参与分子识别信号传导、酶活调节、免疫调节以及细胞分化等过程；生物活性多肽的开发和利用越来越受到科学家的重视，在医药、食品、化妆品等行业中的应用日益广泛，尤其是医药行业当中，已经有大量的生物活性多肽通过了临床试验并投放市场，如降血糖的艾塞那肽、治疗乙型肝炎的胸腺肽、咖啡肽等等。
糖尿病是由多种病因引起的以慢性高血压为特征的代谢紊乱，高血压主要由胰岛素分泌或作用的缺陷引起。糖尿病可分两种，胰岛素依赖型糖尿病(i型糖尿病)和非胰岛素依赖型糖尿病(ii型糖尿病)，其中ii型糖尿病患者占90％以上。who统计结果显示，目前全球已经诊断的ii型糖尿病达到1.3亿人，我国已超过4000万人，是继印度之后的第二大糖尿病大国。常用的ii型糖尿病治疗药物包括：双胍类、磺脲类、α-葡萄糖甘酶抑制剂、噻唑烷二酮类及胰岛素等。但研究发现，这几类常用药物都有可能造成身体的不良反应，特别是二甲双胍，有导致患者乳性酸酸中毒的危险性，而胰岛素治疗也常导致低血糖的发生。因此迫切需要研制出新的ii型糖尿病治疗药物。
研究表明，艾塞那肽是一种由39个氨基酸组成的多肽，exendin-4(h-his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-gln-met-glu-glu-glu-ala-val-arg-leu-phe-ile-glu-trp-leu-lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-nh2)其结构与人的胰高血糖素有48％的同源性，与人的glp-1(胰高血糖素样肽-1)有53％的同源性。exendin-4能够与glp-1受体作用，通过刺激胰岛β细胞再生，促进胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的释放，减慢胃排空速率，抑制食物摄入。其促进胰岛素分泌作用是根据血糖水平进行的，故可降低低血糖的发生率，且对其他促胰岛素分泌剂不敏感的ii型糖尿病病人仍有降糖作用，同时glp-1还可以减轻ii型糖尿病患者的体重，是一类全新的糖尿病治疗药物。
2005年4月，美国礼来公司和艾米啉(amylin)公司共同开发的糖尿病药物倍它(byetta)，化学名艾塞那肽(人工合成的exendin-4)获美国fda批准上市。与此同时，国外许多制药公司如诺和诺德制药公司、默克制药公司也在争相研发与倍它属于同类型的药物。但国内外对exendin-4进行合成和纯化的相关文献都较少，尤其是艾塞那肽纯化方向，因此研究艾塞那肽现有纯化技术的改进和发展还有很长的路要走，摸索出一种操作更为简单成本较少的纯化方法很是重要。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法。
本发明需要解决的技术问题是：
现有纯化艾塞那肽体系中，一般采取的方式是先进行离子交换，但经离子交换后的样品中含有大量盐分，盐分在后续纯化过程中遇到有机溶剂浓度高的时候会在色谱柱中析出，从而影响后续纯化的分离效果，虽然可以通过在进行梯度洗脱之前用较高的水相去冲洗其中的盐分，但其操作时间过长，且不能较准确的控制时间，使整个纯化过程时间延长，效率降低。
本发明的可以通过以下技术方案实现：
一种醋酸艾塞那肽的分离纯化的方法，包括如下步骤：
1、粗肽的预处理
先将醋酸艾塞那肽粗肽进行自然晾干，使其切割过程中残留的溶剂挥发，晾干后将粗品溶解后利用高效液相色谱仪进行粗品分析，根据粗肽的分析图谱可以知道艾塞那肽的出峰浓度以及杂质的分布情况；
2、溶样
按照固液比1g艾塞那肽粗肽：18ml去离子水：2ml乙腈，将经过自然晾干的艾塞那肽粗肽超声溶解，超声时间为5-10min，溶解完全后用滤膜进行过滤，收集滤液；
3、粗纯
利用反向液相色谱法对滤液进行粗纯，色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相a1为体积分数为0.05％-0.2％的磷酸水溶液，流动相b1为体积分数为0.05％-0.2％磷酸的乙腈溶液进行梯度洗脱，分段收集粗纯后的埃塞那肽溶液取小样进行分析，将其中纯度大于90％部分的溶液收集待用；
4、离子交换
将步骤3中粗纯后收集的溶液进行离子交换，色谱柱填料为sp高流速琼脂糖微球的强阳离子交换柱，流动相a2为0.02mol/l的醋酸-醋酸钠水溶液，ph值为3.5～4.4，流动相b2为含有0.5mol/l氯化钠和0.02mol/l的醋酸-醋酸钠水溶液，ph值为3.5～4.4，进行梯度洗脱分段收集，取小样进行分析，将其中纯度大于95％部分的溶液收集待用；
5、换盐
将步骤4得到的溶液用反相高效液相色谱法进行换盐，流动相a3为0.5mol/l的醋酸铵水溶液，ph是3.8-4.8，流动相a4为体积分数为0.2％的醋酸水溶液，流动相b3为乙腈，进行梯度洗脱分段收集，取小样进行分析，将其中纯度大于98％部分的溶液收集待用；
6、冻干
将步骤5中得到的纯度达到98％以上部分的溶液收集起来进行浓缩，浓缩后得到的浓缩液进行冻干。
进一步的，步骤1中粗肽分析的流动相a为体积分数为0.1％的磷酸水溶液，流动相b为体积分数为0.1％的磷酸乙腈溶液，分析时间为20分钟，流动性相a的梯度是5-95，流动相b的梯度是95-5，分析所用仪器为北京创新通恒lc3000ⅰ型。
进一步的，步骤2中过滤的滤膜为0.45um的水系滤膜。
进一步的，步骤3中粗纯的时间为0-40分钟，洗脱梯度是流动相a相20-50，流动相b相80-50。
进一步的，步骤4中的离子交换的洗脱梯度为0-40分钟，流动相a相为30-70，流动相b相为70-30。
进一步的，步骤5中色谱柱填料是十八烷基硅烷键合硅胶，梯度洗脱时间为60分钟，前30分钟a3:b3按95：5的梯度进行等度洗脱，后30分钟流动相a4为20-50，流动相b3相为80-50进行梯度洗脱。
进一步的，步骤6中进行浓缩使用的是旋转蒸发仪，减压浓缩至5-8g/l后转至冻干盘中冻干，冻干机使用的是原位冷冻干燥机vfd-2000a。
本发明的有益效果：
1、通过在纯化之前进行粗肽分析使得纯化过程有了一定的导向性，对目标物的出峰浓度及杂质分布的位置有了预判，使得后续收集目标物的过程更有目的性。
2、为了避免离子交换过程中产生的盐分对后续纯化过程的影响，先进行了粗品的提纯再进行离子交换之后再换盐，对后续纯化影响较小，且在换盐过程中的用醋酸铵等度洗脱的过程相当于一个冲洗盐分的过程，减少了时间。
3、此实验过程中使用的色谱柱类型为普通十八烷基硅烷键合硅胶柱和强阳离子交换柱未涉及到gel反向聚合物柱，所用试剂均为常用试剂，节约了成本且实验过程更为简洁。
4、本发明用磷酸进行粗纯紫外吸收波长设置为210nm,磷酸是无机酸，没有末端吸收，适合于被分离物需要在低紫外波长检测的情况，在此吸收波长下磷酸的出峰峰形和分离度都优于比三氟乙酸。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法包括以下步骤：
1、粗肽的预处理
先将醋酸艾塞那肽粗肽进行自然晾干，使其切割过程中残留的溶剂挥发，晾干后将粗肽溶解后利用高效液相色谱仪进行粗品分析，根据粗品的分析图谱可以知道艾塞那肽的出峰浓度以及杂质的分布情况；
2、溶样
按照固液比1g艾塞那肽粗肽：18ml去离子水：2ml乙腈，将经过自然晾干的艾塞那肽粗肽超声溶解，超声时间为5-10min，溶解完全后用滤膜进行过滤，收集滤液；
3、粗纯
利用反向液相色谱法对滤液进行粗纯，色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，色谱柱直径和装填长度为3cmx25cm，流速为20ml/min，紫外检测波长为210nm，流动相a1为体积分数为0.05％的磷酸水溶液，流动相b1为体积分数为0.05％磷酸的乙腈溶液，先用95％的流动相a1和5％的流动相b1对色谱柱进行平衡，时间为一个柱体积，大概七分钟，接着通过进样针将溶解好的滤液上样，进行梯度洗脱，分段收集粗纯后的艾塞那肽溶液取小样进行分析，将其中纯度大于90％的部分溶液收集待用；
4、离子交换
将步骤3中粗纯后收集的溶液进行离子交换，色谱柱填料为sp高流速琼脂糖微球的强阳离子交换柱，色谱柱直径和装填长度为5cmx25cm，流速为40ml/min，紫外检测波长为230nm，流动相a2为0.02mol/lph值为3.5的醋酸-醋酸钠水溶液，流动相b2为含有0.5mol/l氯化钠的0.02mol/lph值为3.5的醋酸-醋酸钠水溶液，先用70％的流动相a2和30％的流动相b2平衡色谱柱一个柱体积，接着将粗纯收集的溶液加去离子水稀释一倍以后上样，进行梯度洗脱分段收集后取小样进行分析，将其中纯度大于95％的部分收集留用；
5、换盐
将步骤4得到的溶液用粗纯中使用的色谱柱进行换盐，色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，色谱柱直径和装填长度为3cmx25cm，流速为20ml/min，紫外检测波长为210nm，流动相a3为0.5mol/l的醋酸铵水溶液，流动相a4为体积分数为0.2％的醋酸水溶液，流动相b3为乙腈，先将粗纯后的色谱柱用95％的流动相b1冲洗两个柱体积后用95％的流动相a4对色谱柱进行平衡之后，将步骤4中大于95％的液体加去离子水稀释一倍后上样，上样后用95％的流动相a4等度洗脱三十分钟，之后换用流动相a3进行梯度洗脱，分段收集后取小样进行分析，将其中纯度达到98％以上的艾塞那肽溶液收集留用；
6、冻干
将步骤5中得到的纯度达到98％以上部分的溶液收集起来进行浓缩，浓缩后得到的浓缩液进行冻干，干燥后得到纯度大于98％的醋酸艾塞那肽，称重计算其纯品收率为60％。
实施例2
一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法包括以下步骤：
1、粗肽的预处理
先将醋酸艾塞那肽粗肽进行自然晾干，使其切割过程中残留的溶剂挥发，晾干后将粗肽溶解后利用高效液相色谱仪进行粗品分析，根据粗品的分析图谱可以知道艾塞那肽的出峰浓度以及杂质的分布情况；
2、溶样
按照固液比1g艾塞那肽粗肽：18ml去离子水：2ml乙腈，将经过自然晾干的艾塞那肽粗肽超声溶解，超声时间为5-10min，溶解完全后用滤膜进行过滤，收集滤液；
3、粗纯
利用反向液相色谱法对滤液进行粗纯，色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，色谱柱直径和装填长度为3cmx25cm，流速为20ml/min，紫外检测波长为210nm，流动相a1为体积分数为0.1％的磷酸水溶液，流动相b1为体积分数为0.1％磷酸的乙腈溶液，先用95％的流动相a1和5％的流动相b1对色谱柱进行平衡，时间为一个柱体积，大概七分钟，接着通过进样针将溶解好的滤液上样，进行梯度洗脱，分段收集粗纯后的埃塞那肽溶液取小样进行分析，将其中纯度大于90％的一段溶液收集待用；
4、离子交换
将步骤3中粗纯后收集的溶液进行离子交换，色谱柱填料为sp高流速琼脂糖微球的强阳离子交换柱，色谱柱直径和装填长度为5cmx25cm，流速为40ml/min，紫外检测波长为230nm，流动相a2为0.02mol/lph值为3.5的醋酸-醋酸钠水溶液，流动相b2为含有0.5mol/l氯化钠的0.02mol/lph值为3.5的醋酸-醋酸钠水溶液，先用70％的流动相a2和30％的流动相b2平衡色谱柱一个柱体积，接着将粗纯收集的溶液加去离子水稀释一倍以后上样，进行梯度洗脱分段收集将其中纯度大于95％的部分集中留用；
5、换盐
将步骤4得到的溶液用粗纯中使用的色谱柱进行换盐，色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，色谱柱直径和装填长度为3cmx25cm，流速为20ml/min，紫外检测波长为230nm，流动相a3为0.5mol/l的醋酸铵水溶液，流动相a4为体积分数为0.2％的醋酸水溶液，流动相b3为乙腈，先将粗纯后的色谱柱用95％的流动相b1冲洗两个柱体积后用95％的流动相a4对色谱柱进行平衡之后，将步骤4中大于95％的液体加去离子水稀释一倍后上样，上样后用95％的流动相a4等度洗脱三十分钟，之后换用流动相a3进行梯度洗脱，分段收集后取小样进行分析，将其中纯度达到98％以上的艾塞那肽溶液收集留用；
6、冻干
将步骤5中得到的纯度达到98％以上部分的溶液收集起来进行浓缩，浓缩后得到的浓缩液进行冻干，干燥后得到纯度大于98％的醋酸艾塞那肽，注重计算其纯品收率为65％。
实施例3
一种醋酸艾塞那肽的分离纯化方法包括以下步骤：
1、粗肽的预处理
先将醋酸艾塞那肽粗肽进行自然晾干，使其切割过程中残留的溶剂挥发，晾干后将粗肽溶解后利用高效液相色谱仪进行粗品分析，根据粗品的分析图谱可以知道艾塞那肽的出峰浓度以及杂质的分布情况；
2、溶样
按照固液比1g艾塞那肽粗肽：18ml去离子水：2ml乙腈将经过自然晾干的艾塞那肽粗肽超声溶解，超声时间为5-10min，溶解完全后用滤膜进行过滤，收集滤液；
3、粗纯
利用反向液相色谱法对滤液进行粗纯，色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，色谱柱直径和装填长度为3cmx25cm，流速为20ml/min，紫外检测波长为210nm，流动相a1为体积分数为0.2％的磷酸水溶液，流动相b1为体积分数为0.2％磷酸的乙腈溶液，先用95％的流动相a1和5％的流动相b1对色谱柱进行平衡，时间为一个柱体积，大概七分钟，接着通过进样针将溶解好的滤液上样，进行梯度洗脱，分段收集粗纯后的埃塞那肽溶液取小样进行分析，将其中纯度大于90％的一段溶液收集待用；
4、离子交换
将步骤3中粗纯后收集的溶液进行离子交换，色谱柱填料为sp高流速琼脂糖微球的强阳离子交换柱，色谱柱直径和装填长度为5cmx25cm，流速为40ml/min，紫外检测波长为230nm，流动相a2为0.02mol/lph值为3.5的醋酸-醋酸钠水溶液，流动相b2为含有0.5mol/l氯化钠的0.02mol/lph值为3.5的醋酸-醋酸钠水溶液，先用70％的流动相a2和30％的流动相b2平衡色谱柱一个柱体积，接着将粗纯收集的溶液加去离子水稀释一倍以后上样，进行梯度洗脱分段收集将其中纯度大于95％的部分集中留用；
5、换盐
将步骤4得到的溶液用粗纯中使用的色谱柱进行换盐，色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，色谱柱直径和装填长度为3cmx25cm，流速为20ml/min，紫外检测波长为230nm，流动相a3为0.5mol/l的醋酸铵水溶液，流动相a4为0.2％的醋酸水溶液，流动相b3为乙腈，先将粗纯后的色谱柱用95％的流动相b1冲洗两个柱体积后用95％的流动相a4对色谱柱进行平衡之后，将步骤4中大于95％的液体加去离子水稀释一倍后上样，上样后用95％的流动相a4等度洗脱三十分钟，之后换用流动相a3进行梯度洗脱，分段收集后取小样进行分析，将其中纯度达到98％以上的艾塞那肽溶液收集留用；
6、冻干
将步骤5中得到的纯度达到98％以上部分的溶液收集起来进行浓缩，浓缩后得到的浓缩液进行冻干，干燥后得到纯度大于98％的醋酸艾塞那肽，称重后计算其纯品收率为62％。
对比例1
将实施例1中粗纯过程中流动相a1换为体积分数为0.05％三氟乙酸水溶液，流动相b1换成体积分数为0.05％三氟乙酸乙腈溶液，其余过程不变，进行实验。
对比例2
实施例1中粗纯过程中流动相a1换为体积分数为0.1％三氟乙酸水溶液，流动相b1换成体积分数为0.1％三氟乙酸乙腈溶液，其余过程不变，进行实验。
对比例3
实施例1中粗纯过程中流动相a1换为体积分数为0.2％三氟乙酸水溶液，流动相b1换成体积分数为0.2％三氟乙酸乙腈溶液，其余过程不变，进行实验。
对比例4
将实施例1中粗纯和离子交换顺序互换，其余条件不变，进行实验。
对比例5
将实施例2中粗纯和离子交换顺序互换，其余条件不变，进行实验。
对比例6
将实施例3中粗纯和离子交换顺序互换，其余条件不变，进行实验。
对实施例和对比例冻干后得到的醋酸艾塞那肽纯品利用hplc分析纯度，并且计算其纯品收率。
由上表可知，当采用磷酸水溶液和磷酸乙腈溶液为粗纯流动相，得到纯品收率和纯度均优于用三氟乙酸水溶液和三氟乙酸乙腈溶液为粗纯流动相，且先进行粗纯再进行离子交换的方式所得到的醋酸艾塞那肽纯度和收率也优于先进行离子交换再粗纯对比例。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上内容仅仅是对本发明作的举例和说明，所述本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。