专利名称:一种有机磷农药残留降解菌及其生产的菌剂的制作方法
技术领域：
本发明一种有机磷农药残留降解菌及其生产的菌剂，属于生物高技术领域：
，是利用微生物的方法降解化学农药残留，适用于现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与加工。
二、技术背景
化学农药的使用大大地促进了现代农业的发展，为农业生产挽回了大量因病虫害等原因造成的损失，并极大地提高了农业生产的劳动效率和机械化程度，在农业生产的现代化进程中起了不可估量的作用。但同时农药都是一些有毒有害化学物质，它们进入生态环境后，不仅杀死了对人类有害的生物，同时也对生态系统造成了严重的危害。农药的大量使用引起农产品中农药残留超标，严重影响了人民的身体健康及农产品的出口创汇。随着人们生活水平的提高和环境保护意识的增强，全社会对农药残留带来的直接危害和潜在影响亦愈来愈关注，人们迫切需要无农药残留污染的清洁的绿色农产品。但从目前我国的农业生产形式和人口状况来看，以停止农药使用降低农业产量为代价的无公害生产模式是行不通的，农药作为控制病虫害的有效手段还将继续在农业生产中发挥巨大的作用。如何能解决农业生产中的这个两难问题就成为各个学科的研究热点。实验室和实际应用研究都表明利用微生物来降解消除土壤中的农药残留“库”容量，从而降低粮食、蔬菜、茶叶等农产品中的农药残留，提高农产品的品质和经济价值是可行的。现有技术中本课题组已拥有降解菌的发明专利(ZL96106317.3，公开号CN1145408A，
公开日1997年3月19日)，该专利是一株芽胞杆菌J5，能有效地降解甲胺磷，但该菌株降解谱窄，仅能降解甲胺磷一种农药，从而使用受到限制。
发明内容
技术问题 本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，开发研制出一种新型的农药残留降解菌剂，使用本菌剂可以使甲基对硫磷、辛硫磷等有机磷类农药的残留量降低90％以上，并对甲胺磷、甲基异柳磷也有一定的降解效果。具有较广的降解谱，生产和使用成本较低。使用该降解菌剂可以在农作物的正常生长过程中正常使用化学农药进行病虫害防治而保证农产品中农药残留含量符合绿色食品要求。
技术方案 下面为本发明的主要内容
本发明提供一种消除有机磷农药残留的降解菌，其菌株是一株革兰氏染色反应阴性菌DLL-1(2000年9月22日已寄存于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，编号CGMCC NO.0492)，经鉴定属恶臭假单胞菌属(分类地位属于Pseudomonas putida)。主要生物学特性为G-，菌体为短杆状，末端椭圆，大小0.7～1.2×2.0～4.0μm，单端丛生鞭毛，兼性厌气；过氧化氢酶、氧化酶和V.P.反应为阳性；能水解淀粉，不能还原硝酸盐，能以甲基对硫磷为唯一碳源、氮源进行生长，将其彻底矿化为CO2和水及简单的无机化合物。该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为AF447394。利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、D-半乳糖、D-果糖，不利用甘露糖、乳糖、D-木糖及淀粉。最适生长温度30-35℃。该菌还能以氯苯、邻苯二酚、苯甲酸、苯乙酸和辛硫磷为唯一碳源进行生长。在实验室摇瓶培养条件下甲基对硫磷的降解率达90％以上。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。
使用上述有机磷农药残留降解菌生产菌剂的工艺为斜面种—摇瓶种—种子罐—生产罐—产品(包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂)。
本发明的详细实施步骤为
1)将有机磷农药残留的降解菌DLL-1的试管种接种于肉汤培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；
2)将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期。种子罐所用的培养基配方为葡萄糖0.8％，(NH4)2SO4 1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.05％，NaCl 0.01％，CaCO30.3％，酵母膏0.02％，pH值7.2-7.5。
3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同。
在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1∶0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30-35℃，整个工艺流程培养时间为48-60小时。发酵完成后培养液即为菌剂。
有益效果 使用该发明生产的农药残留降解菌剂具有生产使用成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合在全国粮油蔬菜生产出口基地或有绿色食品商标标志的地方大面积推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人民的身体健康，提高农产品的附近值具有重要的意义。降解菌DLL-1具有较广的降解谱，能使甲基对硫磷、辛硫磷等有机磷类农药的残留量降低90％以上，并对甲胺磷、甲基异柳磷也有一定的降解效果。大大降低了生产和使用过程中的工作量，降低了生产和使用成本。使用该降解菌剂可以在农作物的正常生长过程中正常使用化学农药进行病虫害防治而保证农产品中农药残留含量符合绿色食品要求。并且该菌为革兰氏阴性菌，在田间的存活时间适当不会影响以后农药使用的效果。
田间试验表明，用本发明生产的降解菌剂直接施用于农作物可使作物中农药残留量降低95％以上。本发明成功地解决了农业生产中农药残留超标问题，既充分发挥了化学农药在植物病虫害防治中的高效快速的作用，又可以生产出无毒无公害的绿色农产品。
四具体实施方式
以下叙述本发明的实施例。
将本发明的微生物有机磷农药残留的降解菌DLL-1的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200ml肉汤培养基1000ml摇瓶中，恒温振荡培养至对数期，准备接种种子罐。种子罐500升，投料量400升，培养基配方为葡萄糖0.8％，(NH4)2SO4 1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.05％，NaCl 0.01％，CaCO3 0.3％，酵母膏0.02％，pH值7.2-7.5。投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至33℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1∶0.8。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1kg/cm2的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35℃以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在30-35℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1∶0.8-1.0，搅拌速度为240转/分，整个工艺流程培养时间为48-60小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。
发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
用上述方法所得的产品进行田间农药残留降解试验示范。在韭菜喷过有机磷类农药(甲基一六0五、辛硫磷、甲基异柳磷、甲胺磷、乐果等)后，将上述菌剂按使用方法要求施于菜地和茶园中，一定时间后，收获韭菜和茶叶的叶片用气相色谱和液相色谱法测定农药残留的含量(由南京农业大学绿色食品测试中心和农业部环境监测总站测定)，从结果中看出经降解菌处理后能大大降低植物中的残留农药(表1、表2)。对于茶叶这样相对较难处理的植物DLL-1也表现出较好的处理效果(表3)。
表1.DLL-1对甲胺磷、甲基一六0五和乐果的降解农药品种Pesticide 甲胺磷 甲基一六0五 乐果处理方式 CK DDL-1处 理 CK DDL-1处 理 CK DDL-1处理农药浓度(mg/L) 89 44 227 11 206.6 170降解率 (％) 51 95.2 17.7
表2 DLL-1对韭菜中甲基一六0五、辛硫磷及甲基异柳磷的降解.
(韭菜样品分析报告)
送样单位南京农业大学 样品名韭菜
接受日期2000.10.18 检测日期2000.10.19
检测单位农业部环境监测总站
样品分析报告
送样单位南京农业大学 样品名称韭菜
接收日期2000.10.18 检测日期2000.10.19样品名称 样品号 编号检测农药 检测结果 (ppm) 韭菜甲基1605对照 (10.14) J-D-1甲基1605 4.3927 韭菜甲基1605对照 (10.16) J-D-2甲基1605 5.7959 韭菜甲基1605处理 (10.14) J-CH-1甲基1605 0.0956 韭菜甲基1605处理 (10.16) J-CH-2甲基1605 0.0267 韭菜辛硫磷对照 (10.14) X-D-1 辛硫磷 8.7441 韭菜辛硫磷对照 (10.16) X-D-2 辛硫磷 2.8287 韭菜辛硫磷处理 (10.14) X-CH-1 辛硫磷 0.4161 韭菜辛硫磷处理 (10.16) X-CH-2 辛硫磷 0.3376 韭菜甲基异柳磷对照(10.14) L-D-1甲基异柳磷 25.6417 韭菜甲基异柳磷对照(10.16) L-D-2甲基异柳磷 15.6816 韭菜甲基异柳磷处理(10.14) L-CH-1甲基异柳磷 15.8182 韭菜甲基异柳磷处理(10.16) L-CH-2甲基异柳磷 21.4240
表3.DLL-1对茶叶中一六0五的降解
权利要求
1.一种农药残留降解菌，其特征在于该微生物是革兰氏染色阴性的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的菌株DLL-1，2000年9月22日寄存于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.0492，主要生物学特性为G-，菌体为短杆状，末端椭圆，大小0.7～1.2×2.0～4.0μm，单端丛生鞭毛，兼性厌气；过氧化氢酶、氧化酶和V.P.反应为阳性；能水解淀粉，不能还原硝酸盐，能以甲基对硫磷为唯一碳源、氮源进行生长，将其彻底矿化为CO2和水及简单的无机化合物，该菌株16SrDNA的Genbank登陆号为AF447394。
2.一种用权利要求
1所述的农药残留降解菌生产的农药残留降解菌剂，是通过以下方法生产而成
1)将试管种接种于肉汤培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；
2)将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为
葡萄糖0.8％，(NH4)2SO4 1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.05％，NaCl 0.01％，CaCO3 0.3％，酵母膏0.02％，pH值7.2-7.5；
3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；
4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1∶0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30-35℃，全流程培养时间为48-60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
专利摘要
本发明提供一种消除有机磷农药残留的降解菌剂，所用菌株为革兰氏染色反应阴性菌DLL－1，经鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。主要生物学特性为G－，菌体为短杆状，末端椭圆，大小0.7～1.2×2.0～4.0μm，单端丛生鞭毛，兼性厌气；过氧化氢酶、氧化酶和V.P.反应为阳性；能水解淀粉，不能还原硝酸盐，该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为AF447394。降解菌产品直接施用可使作物中农药残留量降低95％上，解决了农业生产中农药残留超标问题，可生产出无毒无公害的绿色农产品。
文档编号C12N1/20GKCN1563356SQ200410014408
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月24日
发明者李顺鹏, 刘智, 沈标, 洪青, 何健 申请人:南京农业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan