专利名称:突变的d-氨基转移酶和使用它们生产旋光性谷氨酸衍生物的方法
技术领域：
本发明涉及ー种用于生产旋光性谷氨酸衍生物的D-氨基转移酶，特别涉及以氨基酸取代的方式使野生型D-氨基转移酶突变所获得的突变D-氨基转移酶，其可自monatin前体有效生产(2R，4R)-monatin。本发明还涉及ー种使用突变D-氨基转移酶生产谷氨酸衍生物,如monatin的(2R，4R)异构体的方法。
背景技术：
由下列结构式(3)表示的4_(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-谷氨酸(3-(1-氨基-1，3- ニ羧基-3-轻基-丁 -4-基)-Π引哚)(下文称作“ monatin”)存在于植物Schlerochitomilicifolius的根中，而且因为它甜度非常高，是ー种特别有前途的低-卡路里甜味剂(JP64-25757 A)
权利要求
1.一种由在SEQ ID NO :2所示氨基酸序列中经下列(1)-(12)取代中的任一取代的氨基酸序列组成的蛋白 (1)第181位的丝氨酸残基被天冬氨酸残基取代； (2)第243位的丝氨酸残基被谷氨酸残基取代； (3)第243位的丝氨酸残基被亮氨酸残基取代；
(4)第243位的丝氨酸残基被赖氨酸残基取代； (5)第243位的丝氨酸残基被天门冬酰胺残基取代； (6)第243位的丝氨酸残基被谷胺酰胺残基取代； (7)第244位的丝氨酸残基被赖氨酸残基取代； (8)第180位的丝氨酸残基被丙氨酸残基取代和第243位的丝氨酸残基被天门冬酰胺残基取代； (9)第180位的丝氨酸残基被丙氨酸残基取代和第244位的丝氨酸残基被赖氨酸残基取代； (10)第243位的丝氨酸残基被天门冬酰胺残基取代和第244位的丝氨酸残基被赖氨酸残基取代； (11)第100位的天门冬酰胺残基被丙氨酸残基取代和第243位的丝氨酸残基被天门冬酰胺残基取代； (12)第182位的丙氨酸残基被丝氨酸残基取代和第243位的丝氨酸残基被天门冬酰胺残基取代。
2.一种由在SEQ ID NO :2所示氨基酸序列中经下列取代(i)-(vii)中的任一取代的氨基酸序列组成的蛋白 (i)用天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基； ( )用赖氨酸残基取代第244位的丝氨酸残基； (iii)用丙氨酸残基取代第180位的丝氨酸残基并用天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基； (iv)用丙氨酸残基取代第180位的丝氨酸残基并用赖氨酸残基取代第244位的丝氨酸残基; (v)用天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基并用赖氨酸残基取代第244位的丝氨酸残基； (vi)用丙氨酸残基取代第100位的天门冬酰胺残基并用天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基；和 (vii)用丝氨酸残基取代第182位的丙氨酸残基并用天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基。
3.一种由在SEQ ID NO :4所示氨基酸序列中经下列(a')和(b')中的任一种取代的氨基酸序列组成的蛋白 (a')用赖氨酸或天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基；和 (b')用赖氨酸残基取代第244位的丝氨酸残基。
4.一种用于生产旋光性谷氨酸衍生物的方法，包括在有权利要求
1-3任何一项的蛋白和氨基供体存在的条件下，使由下列通式(I)表示的酮酸反应
5.根据权利要求
4所述的用于生产旋光性谷氨酸衍生物的方法，其中所述R是苯基或口引噪基。
6.根据权利要求
4所述的用于生产旋光性谷氨酸衍生物的方法，其中所述氨基供体是氨基酸。
7.根据权利要求
6所述的用于生产旋光性谷氨酸衍生物的方法，其中所述反应是在反应系统中进行的，该反应系统还含有酶，该酶具有催化将L-氨基酸转化成D-氨基酸的反应的活性，或该反应系统还含有具有这种酶活性的微生物。
8.一种编码在SEQ ID NO :2所示氨基酸序列中经下列(1)-(12)取代中的任一种取代的氨基酸序列组成的蛋白的DNA (1)第181位的丝氨酸残基被天冬氨酸残基取代； (2)第243位的丝氨酸残基被谷氨酸残基取代； (3)第243位的丝氨酸残基被亮氨酸残基取代； (4)第243位的丝氨酸残基被赖氨酸残基取代； (5)第243位的丝氨酸残基被天门冬酰胺残基取代； (6)第243位的丝氨酸残基被谷胺酰胺残基取代； (7)第244位的丝氨酸残基被赖氨酸残基取代； (8)第180位的丝氨酸残基被丙氨酸残基取代和第243位的丝氨酸残基被天门冬酰胺残基取代； (9)第180位的丝氨酸残基被丙氨酸残基取代和第244位的丝氨酸残基被赖氨酸残基取代； (10)第243位的丝氨酸残基被天门冬酰胺残基取代和第244位的丝氨酸残基被赖氨酸残基取代； (11)第100位的天门冬酰胺残基被丙氨酸残基取代和第243位的丝氨酸残基被天门冬酰胺残基取代； (12)第182位的丙氨酸残基被丝氨酸残基取代和第243位的丝氨酸残基被天门冬酰胺残基取代。
9.一种编码在SEQ ID NO :2所示氨基酸序列中经下列(i)-(vii)取代中的任一种取代的氨基酸序列组成的蛋白的DNA (i)用天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基； ( )用赖氨酸残基取代第244位的丝氨酸残基；(iii)用丙氨酸残基取代第180位的丝氨酸残基并用天门冬酰胺残基取代第243位的 丝氨酸残基； (iv)用丙氨酸残基取代第180位的丝氨酸残基并用赖氨酸残基取代第244位的丝氨酸残基; (v)用天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基并用赖氨酸残基取代第244位的丝氨酸残基； (vi)用丙氨酸残基取代第100位的天门冬酰胺残基并用天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基；和 (vii)用丝氨酸残基取代第182位的丙氨酸残基并用天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基。
10.一种编码在SEQ ID NO :4所示氨基酸序列中经下列(a')和(b')的任一取代的氨基酸序列组成的蛋白的DNA (a')用赖氨酸或天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基；和 (b')用赖氨酸残基取代第244位的丝氨酸残基。
11.一种通过将权利要求
8-10任一项的DNA与载体DNA连接获得的重组DNA。
12.—种用权利要求
11的重组DNA转化的细胞。
13.一种用于生产具有D-氨基转移酶活性的蛋白的方法，包括在培养基中培养权利要求
12的细胞并在所述培养基和/或所述细胞中积聚具有所述D-氨基转移酶活性的蛋白。
专利摘要
通过取代SEQ ID NO2所示野生型D-氨基转移酶氨基酸序列中涉及有效生产(2R，4R)-monatin的至少一个位置(第100、180-183、243和244位)处的氨基酸而修饰D-氨基转移酶，从而自4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸有效生产高甜度的(2R，4R)-monatin。
文档编号C12P17/10GKCN1723281 B发布类型授权 专利申请号CN 200380105550
公开日2012年8月15日 申请日期2003年12月9日
发明者杉山雅一, 柏木立己, 渡部乙比古, 铃木荣一郎 申请人:味之素株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非专利引用 (4),