专利名称:取代氧杂环壬烷－2－酮类化合物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的取代氧杂环壬烷-2-酮类化合物、制备取代氧杂环壬烷-2-酮类化合物的方法；本发明还涉及该类化合物在制备细胞周期抑制剂或细胞调亡诱导剂及抗肿瘤药物中的用途。
背景技术：
有关微生物发酵产物中具有细胞周期抑制、细胞凋亡诱导等抗肿瘤活性的化合物及其制备方法已有较多报道。如在文献C.-B.Cui，etal.；Novel mammalian cell cycle inhibitors，cyclotryprostatinsA-D produced by Aspergillus fumigatus，which inhibit mammaliancell cycle at G2/M phaseTetrahedron，Vol.53，No.1，pp.59-72，1997和长田裕之等，新規物質アセトフタリジン、細胞周期阻害剤および抗腫瘍剤，日本专利，公開特許広埁螅A)，特開平9-87269，公告日平成9年(1997年)3月31日中就曾报道了cyclotryprostatin类和acetophtalidin等新类型的活性化合物。但上述迄今所有文献所报道的活性化合物与氧杂环壬烷-2-酮类化合物具有完全不同的母体骨架结构。
迄今报道的氧杂环壬烷-2-酮类化合物仅二十多个，均为人工合成的化合物，生物活性鲜有报道。如文献W.C.Still，et al.；Chemicalconsequences of conformation in macrocyclic compounds-Aneffective approach to remote asymmetric inductionTetrahedron，Vol.37，No.23，pp.3981-3996，1981和G.Lenoble，et al.；Anchemoselective and regioselective catalytic way to a novelnine-membered lactoneTetrahedron Letters，Vol.42，pp.3697-3770，2001曾报道了9-甲基-氧杂环壬烷-2-酮、3，9-二甲基-氧杂环壬烷-2-酮和5，9，9-三甲基-氧杂环壬烷-2-酮等化合物的人工合成。从化学结构上看，上述迄今已知的全部人工合成的氧杂环壬烷-2-酮类化合物最典型的特征是在母环骨架上都没有羟基、氨基等杂原子与环骨架碳直接相连的取代基。迄今尚未见有任何有关天然氧杂环壬烷-2-酮类化合物的报道。
发明内容
本发明旨在提供一种具有细胞周期抑制、细胞凋亡诱导等抗肿瘤活性的取代氧杂环壬烷-2-酮类新化合物。
因此，本发明的一个方面涉及式I取代氧杂环壬烷-2-酮类化合物或其药学上可接受的盐 式I其中，R1和R4可以相同也可不同，为氢、羟基、氨基、磺酸基、C1-C6直链或支链烷基或C2-C6直链或支链链烯基、C1-C6直链或支链烷氧基或C2-C6直链或支链链烯氧基；R2和R3可以相同也可不同，但其中至少一个为羟基等与环骨架碳原子直接相连的氧取代基，另一个可以是氢、羟基、氨基、磺酸基、C1-C6直链或支链烷基或C2-C6直链或支链链烯基、C1-C6直链或支链烷氧基或C2-C6直链或支链链烯氧基。
本发明的另一方面涉及含有作为活性成分的式I取代氧杂环壬烷-2-酮类化合物以及一种或多种药用载体或赋形剂的药物组合物。
本发明的另一方面涉及制备取代氧杂环壬烷-2-酮的方法，该方法包括通过发酵培养能够生产取代氧杂环壬烷-2-酮类化合物的微生物如链霉菌属产素菌，获得含有该类化合物的发酵物，再利用常规方法从发酵物中分离纯化所需化合物的步骤。
本发明进一步的方面涉及上述式I取代氧杂环壬烷-2-酮用于制备细胞周期抑制剂、细胞凋亡诱导剂或肿瘤细胞抑制剂的用途。
具体来说，在本发明的一个实施方案中，取代的氧杂环壬烷-2-酮类化合物或其药学上可接受的盐如式I所示 式I其中，R1和R4可以相同也可不同，为氢、羟基、氨基、磺酸基、C1-C6直链或支链烷基或C2-C6直链或支链链烯基、C1-C6直链或支链烷氧基或C2-C6直链或支链链烯氧基；R2和R3可以相同也可不同，但其中至少一个为羟基等与环骨架碳原子直接相连的氧取代基，另一个可以是氢、羟基、氨基、磺酸基、C1-C6直链或支链烷基或C2-C6直链或支链链烯基、C1-C6直链或支链烷氧基或C2-C6直链或支链链烯氧基。
在本发明的一个优选实施方案中，取代的氧杂环壬烷-2-酮类化合物或其药学上可接受的盐如式I所示 式I
其中，R1和R4为甲基或氢，R2和R3为羟基。
在本发明更优选的实施方案中，式I所示的取代的氧杂环壬烷-2-酮类化合物中，R1和R4为甲基，R2和R3为羟基，下文中又称其为化合物I。
本发明的式I化合物可通过发酵培养能够生产取代氧杂环壬烷-2-酮类化合物的微生物，获取含有该类化合物的发酵物，再从发酵物中分离纯化而得到。
所述能够生产氧杂环壬烷-2-酮类化合物的微生物包括链霉菌属产素菌，如链霉菌属的黄直丝链霉菌(Streptomyces flavoretus)。
在本发明的一个实施方案中，所用产素菌是从西双版纳土壤样品中分离、经分类学研究鉴定为黄直丝链霉菌的18522株。该菌株已于2003年10月23日保藏在位于北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏登记入册编号CGMCC No.1022)，建议的分类命名为黄直丝链霉菌。该黄直丝链霉菌18522 CGMCC 1022株具有如下微生物菌学特征各种培养基上的培养特征和形态特征培养特征在高氏合成一号琼脂、葡萄糖天门冬素琼脂、蔗糖硝基盐琼脂、无机盐淀粉琼脂、马铃薯浸汁琼脂、营养琼脂、燕麦粉琼脂、苹果酸钙琼脂等8种培养基上28℃培养7-15天后观察菌丝体的颜色和色素的产生等情况，有关特征见表1。
表1菌株18522在8种培养基上的培养特征
形态特征在高氏合成一号琼脂和葡萄糖天门冬素琼脂上28℃培养7～15天后，用光学显微镜和电子显微镜，按常规方法进行菌丝及孢子表面特征的观察，结果关观察到菌株基丝无横隔，不断裂；气丝分枝较多；孢子丝直丝或柔曲，有时成丛；孢子卵圆形，表面光滑(光学显微镜照片和电子显微镜照片略)。
化学分类特征胞壁化学组分分析按照Hasegawa的薄层层析(TLC)法进行了该菌株全细胞水解液氨基酸和糖型分析，结果表明，18522菌株全细胞水解液含有LL-DAP(左旋二氨基庚二酸，Diaminopimelicacid)，甘氨酸；无特征性糖(糖型C)。细胞壁化学组分属于I型。
生理生化特征参照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》Vol.IV的内容对菌株进行了生理生化鉴定。该18522菌株的生理生化特征见表2。
表2菌株的生理生化特征
由上述实验结果，根据形态特征与胞壁化学组分定属原则，该18522菌株无横隔，不断裂；气生菌丝多分枝，孢子丝直丝或柔曲；胞壁I型，糖型C，属于链霉菌属(Streptomyces)。根据培养特征和生理实验定种的原则，菌株18522的气生菌丝为黄色调，与黄直丝链霉菌相同，生理特征也与黄直丝链霉菌相似，故菌株18522可定名为黄直丝链霉菌(Streptomyces flavoretus)。
需要特别说明的是，经发酵微生物制取本发明式I化合物的方法可采用其它任何能生产氧杂环壬烷-2-酮类化合物的链霉菌属微生物，只要能生产氧杂环壬烷-2-酮类化合物的链霉菌属微生物均可用作产素菌用于制备式I化合物。
所述分离纯化包括利用本领域技术人员熟知的天然产物分离纯化的常规方法，如液液萃取、柱层析、薄层层析及重结晶等。
本发明采用丽丝胺罗丹明B(sulforhodamine B，SRB)法测试了式I化合物对人慢性髓性白血病K562细胞、人大肠癌HCT-15细胞、人卵巢癌A2780细胞、人肺癌A549细胞和人宫颈癌Hela细胞的细胞增殖抑制作用，并采用流式细胞术结合显微镜下检测细胞形态特征的方法测试了式I化合物对tsFT210、K562及HCT-15细胞的细胞周期抑制和细胞凋亡诱导作用。实验证实，式I化合物对肿瘤细胞可通过抑制细胞周期并诱发癌细胞凋亡来显示抑制肿瘤细胞增殖的生物学活性，从而发挥其抗肿瘤作用，因此本发明的式I化合物可用作细胞周期抑制剂、细胞凋亡诱导剂或肿瘤细胞抑制剂。
式I化合物还可与各种药物可接受的载体、赋形剂或辅料配伍，制成抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗。
本发明中的术语“药学上可接受的盐”可以是药用无机或有机盐。本发明式I中具有碱性基团的化合物可以与无机酸形成药用盐，例如硫酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐；也可与有机酸形成药用盐，例如乙酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、葡萄糖酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、马来酸盐等。本发明式I中具有酸性基团的化合物可以与碱金属或碱土金属形成药用盐，优选但不限于钠盐、钾盐，镁盐或钙盐。
本发明化合物可以单独或以药物组合物的形式给药。给药途径可以是口服、非肠道或局部给药。药物组合物可根据给药途径配成各种适宜的剂型。
本发明化合物的药物组合物可以以下面的任意方式施用口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，局部用药，非肠道用药，如皮下，静脉，肌内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中优选口服、腹膜内或静脉内给药方式。
当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。
当局部用药时，特别是治疗局部外敷容易达到的患面或器官，如眼睛、皮肤或下肠道神经性疾病时，可根据不同的患面或器官将本发明化合物制成不同的局部用药制剂形式，具体说明如下当眼部局部施用时，本发明化合物可配制成一种微粉化悬浮液或溶液的制剂形式，所使用载体为等渗的具有一定pH的无菌盐水，其中可加入也可不加防腐剂如氯化苄基烷醇盐。对于眼用，也可将化合物制成膏剂形式如凡士林膏。
当皮肤局部施用时，本发明化合物可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、吐温60、十六烷酯蜡、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。
本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液或无菌注射溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。
另外需要指出，本发明化合物的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。优选的使用剂量介于0.01～100mg/kg体重/天。
式I化合物亦可作为抑制细胞周期或诱发细胞凋亡的低分子生物探针用于生命科学研究。当将式I化合物作为细胞周期抑制剂或细胞凋亡诱导剂用于生命科学研究时，可将其溶于甲醇、水或含水甲醇中，也可将其溶于二甲基亚砜的含水溶液中加以应用。
图1是化合物I在甲醇中的紫外吸收光谱；图2是化合物I的红外吸收光谱(KBr)；图3是化合物I在氘代氯仿中的1H核磁共振谱；图4是化合物I在氘代氯仿中的13C核磁共振谱；图5是小鼠乳腺癌tsFT210细胞经不同浓度的化合物I处理17小时后测得的流式细胞直方图。左上图为空白对照组，其余为不同浓度(浓度见每个图右上方)的化合物I处理组，图中曲线部为实测数据，黑色填充部为计算值。
图6是人慢性髓性白血病K562细胞经不同浓度的化合物I处理24小时后测得的流式细胞术直方图。左上图为空白对照组，其余为不同浓度(浓度见每个图右上方)的化合物I处理组，图中曲线部为实测数据，黑色填充部为计算值。
图7是人卵巢癌A2780细胞经不同浓度的化合物I处理24小时后测得的流式细胞术直方图。左上图为空白对照组，其余为不同浓度(浓度见每个图右上方)的化合物I处理组，图中曲线部为实测数据，黑色填充部为计算值。
具体实施方式
下列实施例将进一步说明本发明，但并不对本发明构成限制。
实施例1 化合物I的发酵生产及分离精制发酵生产产素菌本实施例中用于发酵生产氧杂环壬烷-2-酮类化合物的产素菌采用从西双版纳土壤样品中分离并经分类学研究鉴定的黄直丝链霉菌(Streptomyces flavoretus)18522 CGMCC 1022株。
产素菌的发酵培养按培养微生物的常规方法，取黄直丝链霉菌(Streptomycesflavoretus)18522 CGMCC 1022适量，接种到高氏合成1号琼脂固体斜面培养基上，在28℃培养箱中培养7天。
取培养7天的斜面，用接种针挑取适量孢子和菌体，接种到一个含100毫升种子培养液(培养基组成豆粉0.5％，可溶性淀粉1.5％，甘油1.5％，蛋白胨1.5％，碳酸钙0.2％，调pH7.4)的500毫升三角烧瓶中，置于摇床中，在28℃、每分钟180转条件下进行种子培养48小时，获得黄直丝链霉菌18522 CGMCC 1022的种子培养液。
取该种子培养液适量，按10％的接种量接种到100个内装150毫升生产发酵培养液(培养基组成豆粉0.5％，可溶性淀粉1.5％，甘油1.5％，蛋白胨1.5％，碳酸钙0.2％，调pH7.4)的500毫升三角烧瓶中，置于28℃、每分钟180转的摇床上进行生产发酵5天，获得含有氧杂环壬烷-2-酮类目标化合物的黄直丝链霉菌18522 CGMCC 1022的发酵培养液约15升。
含化合物I的氯仿提取物的制备将黄直丝链霉菌18522 CGMCC 1022的发酵培养液(约15升)离心，分为上清液和菌丝体。菌丝体用80％丙酮水溶液超声提取3次，合并提取液，减压浓缩至不含丙酮后，用等量氯仿萃取三次，得菌丝体提取物的氯仿萃取液。取上清液，直接用等量氯仿萃取三次，得上清液的氯仿萃取液。所得上清液的氯仿萃取液与菌丝体提取物的氯仿萃取液合并，减压浓缩至干，得到含有化合物I的氯仿提取物7.5克。
化合物I的分离精制取含有化合物I的氯仿提取物(7.5克)，用适量氯仿溶解后加15克200-300目硅胶G(青岛海洋化工集团公司产品)拌样，装载到装填有75克青岛海洋化工集团公司产薄层层析用硅胶60H的玻璃减压柱上，以石油醚(沸点60-90°)-乙酸乙酯混合液为洗脱溶剂系统进行减压柱层析，洗脱溶剂的极性通过加大乙酸乙酯的用量来梯度递增，每150毫升为一个馏份，获得若干馏份。采用小鼠乳腺癌tsFT210细胞的流式细胞术筛选模型，以细胞周期抑制和细胞凋亡诱导活性作为抗癌指标，检测每个馏份的活性，再结合薄层层析检测结果，合并石油醚-乙酸乙酯(2∶1)洗脱馏份中的第6-11馏份，得到含有化合物I的活性组分。将该活性组分用适量石油醚(沸点60-90°)室温溶解、提取，分为石油醚可溶部分和不溶部分，结果化合物I被浓缩于石油醚不溶部分中。取全部石油醚不溶部分，用制备反相高效液相色谱(色谱柱，SENSHU PAK ODS柱(20×250mm)；流动相，甲醇-水(85∶15v/v)，流速10ml/min；检测波长215nm)进行层析分离，得到化合物I粗品40mg，继而在丙酮中重结晶精制，得到化合物I纯品(30mg)，其为无色针状结晶，熔点152-153℃(未校正)，[α]D25+1.22(c 1.00氯仿)，分子式C10H18O4。TOF-MS m/z203[M+H]+，185[M+H-H2O]+。HR-TOF-MS m/z实测值185.1182[M-H2O+H]+，计算值185.1178(C10H17O3)。UVλmaxnm(logε)于甲醇204(3.17)，末端吸收。IRvmaxcm-1(KBr)3380(OH)，2928，1728(内酯羰基)，1575，1408，1194，1063。1H及13C NMR数据见表3。
表3化合物I在氘代氯仿中的600MHz1H和150MHz13C NMR数据a)
a)本表信号归属基于DEPT、PFG1H-1H COSY、PFG HMQC及PFGHMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。
b)此栏中的数字和代号分别代表在PFG1H-1H COSY谱中与相应行中的1H给出偶合相关信号的1H核。
c)此栏中的数字和代号分别代表在PFG HMBC(1JCH＝8Hz)中与相应行中的碳信号给出远程杂核相关(HMBC)信号的1H核。
实施例2对癌细胞的增殖抑制、细胞周期抑制、细胞凋亡诱导活性的测试实验样品及实验方法被测样品溶液的配制测试样品为上述实施例1中分离精制的纯品化合物I。精密称取适量样品，用甲醇配制成所需浓度的溶液，供测活性。
细胞系及细胞的继代培养活性测试采用人慢性髓性白血病K562细胞、人大肠癌HCT-15细胞、人卵巢癌A2780细胞、人肺癌A549细胞、人宫颈癌HeLa细胞和小鼠乳腺癌tsFT210细胞等哺乳动物的癌细胞系。各种细胞均用含10％FBS的RPMI-1640培养基，在32℃(tsFT210细胞)或在37℃(K562细胞、HCT-15细胞、A2780细胞、A549细胞和HeLa细胞)于通入5％二氧化碳的培养箱中继代培养。
细胞增殖抑制活性测试方法(SRB法)本发明采用SRB(sulforhodamine B，丽丝胺罗丹明B)法，测试评价了被测试样品对癌细胞增殖的抑制活性。该SRB法是近来开发并用于抗癌药物筛选和评价的新的比色法。丽丝胺罗丹明B即SRB是一种亮粉红色的氨基夹氧杂蒽类染料(aminoxanthene dye)，分子中具有两个磺酸基。在微酸性条件下，SRB可定量地结合到经三氯醋酸固定的细胞内蛋白质中的碱性氨基酸残基上，从而提供测定细胞蛋白质含量的很灵敏的定量指标。细胞内蛋白质的含量与活细胞的密度呈线性关系，因此，SRB法可用于评价抗癌药物对癌细胞增殖的抑制活性。
活性测试时，取对数生长期的K562细胞、HCT-15细胞、A2780细胞、A549细胞和HeLa细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2×105个细胞的细胞悬液，按每孔200微升接种于96孔板中，每孔加入2微升不同浓度的样品溶液，37℃下培养24小时。取药物作用下培养后的细胞，首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化，判断有无细胞周期抑制，细胞凋亡或细胞坏死的形态学特征，继而在4℃每分钟3000转条件下离心3分钟，吸去上清液。每孔细胞中加入20％三氯醋酸50微升，置于4℃固定1小时，用水冲洗5次并空气干燥。每孔加入0.4％SRB的醋酸溶液50微升并在室温静置30分钟。用1％醋酸水清洗4次，除去未结合的游离SRB染料。每孔加入150微升Tris缓冲液(10mmol/L，pH 10.5)溶解蛋白结合染料并利用MD公司产SPECTRA MAX Plus型酶标仪测定每孔在520nm处的光密度(OD)值。同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，另设三孔作为空白对照。取三孔平均OD值按IR％＝(OD空白对照-OD样品)/OD空白对照×100％式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR％)，再利用Bliss方法，由各种浓度的抑制率(IR％)求得半数抑制浓度(IC50)。同样的测试和计算分别进行三次，求得IC50的平均值和标准差。
细胞周期抑制和细胞凋亡诱导活性的流式细胞术测试方法取对数生长期的tsFT210、K562和A2780细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2×105个细胞的细胞悬液，按每孔0.5毫升接种于24孔板中，每孔加入5微升不同浓度的样品溶液，32℃下培养17小时(tsFT210细胞)或37℃下培养24小时(K562细胞和A2780细胞)。取药物作用下培养后的细胞，首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化，判断有无细胞周期抑制，细胞凋亡或细胞坏死的形态学特征，必要时进行拍照。继而将细胞分别从24孔板转移至1.5毫升Eppendorf离心管中，4℃下每分钟3000转离心3分钟，吸去上清液，加0.5毫升磷酸缓冲溶液(PBS)振荡洗涤一次，相同条件下离心收集细胞，加150微升碘化丙啶(PI)水溶液(在100毫升水中含5毫克PI、100毫克柠檬酸钠和200毫克NP-40)，4℃下染色30分钟后，加入180微升PBS稀释，用流式细胞仪分析测定细胞中DNA的含量分布。细胞在细胞周期各时相中的分布利用库尔特公司产计算机软件WinCycle进行分析计算。
实验结果化合物I细胞增殖抑制活性用不同浓度的化合物I分别处理tsFT210细胞17小时、A2780、K562、HCT-15、A549和HeLa细胞各24小后用SRB法测试的活性结果见表4。
表4化合物I细胞增殖抑制活性的SRB法测试结果(平均值±标准差，n＝3)
化合物I活性的流式细胞术分析检测结果用不同浓度的化合物I分别处理tsFT210细胞17小时、K562和A2780细胞各24小后，用流式细胞术检测分析得到的化合物I对癌细胞的细胞周期抑制及凋亡诱导活性测试结果见表5至表10。
表5tsFT210细胞经化合物I处理17小时后的测试结果(平均值±标准差，n＝3)
注本表数据系将tsFT210细胞经碘化丙啶染色后用流式细胞术分析测得结果。
表6tsFT210细胞经化合物I处理17小时后测试并经统计处理t检验结果(n＝3)
注本表数据系将tsFT210细胞经碘化丙啶染色后用流式细胞术分析测得结果。
表7K562细胞经化合物I处理24小时后的测试结果(平均值±标准差，n＝3)
注本表数据系将K562细胞经碘化丙啶染色后用流式细胞术分析测得结果。
表8K562细胞经化合物I处理24小时后测试并t检验结果(平均值±标准差，n＝3)
注本表数据系将K562细胞经碘化丙啶染色后用流式细胞术分析测得结果。
表9A2780细胞经化合物I处理24小时后的测试结果(平均值±标准差，n＝3)
注本表数据系将A2780细胞经碘化丙啶染色后用流式细胞术分析测得结果。
表10A2780细胞经化合物I处理24小时后测试并经统计处理t检验结果(n＝3)
注本表数据系将A2780细胞经碘化丙啶染色后用流式细胞术分析测得结果。化合物I对癌细胞作用的形态学检测结果在光学倒置显微镜下观察到，用不同浓度的化合物I处理后，HCT-15、A2780、A549、HeLa、tsFT210等细胞的形态没有特别显著的变化，但视野中体积较小的细胞的数目随化合物I浓度增高而增多并在化合物I的浓度达到一定值以上时基本保持同等水平。而当用不同浓度的化合物I处理时，K562细胞随着样品浓度增高细胞形态逐渐发生变化。当化合物I在0.01μM以下时细胞形态与空白对照组基本相同，但当化合物I的浓度超过0.01μM以上时，随着样品浓度的提高，视野中开始出现部分雪花瓣状以及碎片状凋亡细胞的形态，并且，在化合物I达到1μM以上时，呈凋亡形态的细胞数基本保持同等水平。
上述形态学观测结果与流式细胞术检测分析结果(表5-表10)完全吻合。
以上实验结果表明，化合物I可显著抑制K562细胞、HCT-15细胞、A2780细胞、A549细胞和HeLa细胞等癌细胞的增殖，化合物I抑制这些癌细胞增殖的半数抑制浓度(IC50)分别为1.4±0.4μM(A2780细胞)、8.4±4.7μM(K562细胞)、9.4±2.2μM(HCT-15细胞)、15.4±5.6μM(A549细胞)、13.7±2.0μM(HeLa细胞)。
流式细胞术检测分析结果表明，化合物I对tsFT210、K562、A2780细胞G0/G1期抑制作用的MIC值分别为15.1nM(tsFT210细胞)、1.0μM(K562细胞)和0.1μM(A2780细胞)，对K562细胞发挥细胞凋亡诱导作用的MIC值为0.01μM。
结论化合物I可显著抑制肿瘤细胞的增殖，并可通过细胞周期G0/G1期抑制及诱发凋亡来发挥其抑制肿瘤细胞增殖的抗肿瘤作用。
权利要求
1.式I化合物或其药学上可接受的盐 式I其中，R1和R4为甲基；R2和R3为羟基。
2.药物组合物，其含有权利要求
1的式I化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种药用载体或赋形剂。
3.权利要求
1所述的式I化合物的制备方法，其特征在于发酵培养链霉菌属的氧杂环壬烷-2-酮类化合物生产菌、获取含有该类化合物的发酵物，继而从发酵物中分离纯化出式I化合物。
4.权利要求
3所述的方法，所述链霉菌属的氧杂环壬烷-2-酮类化合物生产菌是黄直丝链霉菌18522 CGMCC 1022。
5.权利要求
1所述的式I化合物用于制备细胞周期抑制剂、细胞凋亡诱导剂和肿瘤细胞杀伤剂的用途。
6.权利要求
1所述的式I化合物用于制备抑制肿瘤细胞增殖和抗肿瘤药物的用途。
7.黄直丝链霉菌18522 CGMCC 1022。
8.权利要求
7所述的菌株用于生产权利要求
1所述的式I化合物的用途。
专利摘要
本发明涉及取代氧杂环壬烷-2-酮类化合物及其制备方法和用途。本发明采用黄直丝链霉菌发酵生产并制取取代氧杂环壬烷-2-酮类化合物。经实验证实，该类化合物可用于制备细胞周期抑制剂、细胞凋亡诱导剂或抗肿瘤剂。
文档编号C07D313/00GKCN1314679SQ200410006050
公开日2007年5月9日 申请日期2004年2月27日
发明者崔承彬, 韩冰, 蔡兵 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非专利引用 (1),