(1)利用CTAB法提取芦苇叶片DNA
[0041] 称取l〇_15g芦苇叶片，加液氮研成粉末.加入预热至65°C的2-ME(巯基乙 醇）/CTAB抽提缓冲液（2% 2-MEV/V, 2%CTABW/V,lOOmmol/LTris?ClpH8. 0, 20mmol/L EDTApH8. 0, 1. 4mol/LNaCl)，混匀，加入 1 %PVP(聚乙烯吡咯烷酮W/V)，65°C恒温 60min. 加入等体积氯仿：辛醇（24 : 1，V/V)抽提，于4°C、8500r/min离心5min，取上清，加入 1/10 体积预热至 65°C的CTAB/NaCl溶液（10%CTAB,W/V，0. 7mol/LNaCl)，混匀，再加入等 体积的氯仿：辛醇（24 : 1，V/V)抽提，于4°C、8500r/min离心5min，取上清，加入1. 2倍 体积的CTAB沉淀液（1%CTABW/V, 50mmol/LTris?Cl(pH8. 0)，10mmol/LEDTA(pH8. 0))， 混勾，37°C水浴过夜后，取出于4°C、8500r/min离心10min，可见离心管底有沉淀形成；加入 高盐TE缓冲液（10mmol/LTris?ClpH8. 0,0?lmmol/LED-TApH8. 0,lmol/LNaCl),溶解后 加入0. 6倍体积的异丙醇使之沉淀，于4°C、8500r/min离心15min，沉淀用80%乙醇洗绦， 干燥后加入适量TE缓冲液溶解。
[0042] (2) 2007年10月在海南，取水稻9311、盐559、7海76、7海74作为受体，在盛花期 选择正在开花的稻穗，去除未开过的颖花和已开过的颖花，每穗只留下当天刚开的颖花约 20朵；1. 5?2. 0小时后剪去小穗内颖，并将1/3?1/2的花柱连同柱头一起剪去；立即用 微量注射器在刚剪去柱头的花柱切面上滴注含外源DNA溶液2?3yL;注射时间为水稻开 花后进行，DNA溶液浓度是250?300yg/ml，导入量是10-20y1，套上杂交袋以防止水份 蒸发，25?30天后收获180粒，导入穗的结实率约10%，称为％代种子。
[0043] (3)2008年5月至10月在湖南长沙，收获的D。代种子全部播种，发芽率约为70% 经观察，各导入植株变异小，得到Di代种子共约1500克。
[0044] (4)将0:代种子分为两组，第一组在含盐分浓度为5%。的塑料盆中进行种子发芽 和育苗，然后移栽到5%。的人工盐池中，进行耐盐性鉴定筛选，选留17株健壮幼苗移栽到普 通无盐大田，进行常规栽培，观察变异情况，选留生长正常的单株收种；第二组种子则种植 于普通水田内，选留8个变异株，单株收种。盐筛和非盐筛所选留的各单株收种称为0 2代 种子。为了加代培育，每年在冬春在海南进行盐选，夏秋在湖南一般稻田进行无盐种植。
[0045] (5)收获的D2代种子在盐池盐度为4%。?5%。的条件下进行耐盐性筛选，以未导入 外源DNA的受体作为对照，收获D2代植株25个株系，多数无明显的分离和变异，结实率相 对对照组好，筛选生长正常的单株，收获仏代种子；
[0046] (6)将收获的D3代种子在盐池盐度为4%。?5%。的条件下进行耐盐性筛选，以未导 入外源DNA的受体作为对照，进行水稻生长的耐盐性和产量品质性状的筛选鉴定，筛选生 长正常的单株，收获比代种子。
[0047] (7)在盐池盐度为5%。的条件下进行多代筛选，直至D6代植株基本稳定。
[0048] (8)同时，培育出与双8S/海湘4号C815S杂交获得Fi代植株，该植株长势良好， 粒形好。所收获的〇6代株系为20个，获得的F:代株系为1个。
[0049] (9) 2011年11月至2012年5月在保亭，将培育出的一批性能稳定的耐盐水稻新品 系21个组合或株系，在江苏盐城沿海滩涂进行不同梯度盐分2%。、4%。、6%。（低、中、高）进 行田间中试，海湘030、海湘016、海湘121表现突出。育种时间较一般的常规育种缩短了一 半。
[0050] (10)2013年，我们将海湘030、海湘016、海湘121三个耐盐水稻新品系在江苏盐 城沿海滩涂50亩"耐盐水稻高产示范区"中展示，在3%。_4%。盐分下对照品种全部死亡绝 收而这三个耐盐水稻表现优异，其中海湘030最好，株高100厘米左右、整齐一致，亩产实收 817 斤。
[0051] (11)耐盐水稻海湘030品系在产量、耐盐性等方面均表现突出，2014年在江苏盐 城，进行"50亩生产试种示范"，亩产806斤。
[0052] 二、水稻耐盐性鉴定
[0053] 2012年5月，将培育出的耐盐水稻新品系21个组合或株系在江苏盐城沿海滩涂进 行不同梯度盐分2%。、4%。、6%。（低、中、高）进行田间中试。其中，海湘030、海湘016、海湘 121表现突出，育种时间较一般的常规育种缩短了一半。
[0054] 如图4所示，2013年，将海湘030、海湘016、海湘121三个耐盐水稻新品系在江苏 盐城沿海滩涂50亩"耐盐水稻高产示范区"中展示，在3%。_4%。盐分下对照品种全部死亡 绝收而这三个耐盐水稻表现优异，其中海湘030最好，株高100厘米左右、整齐一致，亩产达 806 斤。
[0055] 如图5中所示，水稻海湘030的长势良好，颗粒饱满。
[0056] 如图2、3所示，海湘030、海湘016、海湘121三个耐盐水稻新品系在盐度分别为 3%。及6%。一9%。的江苏盐城沿海滩涂种植展示图。从图中可看出，海湘030、海湘016、海湘 121三个耐盐水稻长势良好，对照株全部死亡绝收。
[0057] 以下为考种结果：
[0058] 2013年江苏盐城耐盐水稻考种结果（3%。盐度）
[0059]
【主权项】
1. 一种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法，包括以下步骤： (1) 提取盐生植物叶片DNA作为供体； (2) 取水稻9311、盐恢559、7海76、7海74作为受体，在盛花期选择正在开花的稻穗， 去除未开过的颖花和已开过的颖花，每穗只留下当天刚开的颖花约20朵；1. 5?2. 0小时 后剪去小穗内颖，并将1/3?1/2的花柱连同柱头一起剪去；立即用微量注射器在刚剪去柱 头的花柱切面上滴注含芦苇DNA溶液2?3 y 1 ;注射时间为水稻开花后1?3小时进行， 芦苇DNA溶液浓度是100?500 y g/ml，导入量是10-20 y 1，套上杂交袋以防止水份蒸发， 25?30天后收获D。代种子； (3) 收获的％代种子全部播种，经观察，各导入系基本无变异或变异不明显，分别全收 各株的种子为种子； (4) 将0:代种子分为两组，第一组在含盐分浓度为5%。的塑料盆中进行种子发芽和育 苗，对种子进行耐盐性筛选，选留健壮幼苗移栽到普通无盐大田，进行常规栽培，观察变异 情况，选留生长正常的单株收种；第二组种子则种植于普通水田内发芽和育苗以及全过程 生长，选留变异株，进行单株收种；盐筛和非盐筛所选留的各单株收种称为％代种子； (5) 将收获的D2种子再在盐池盐度为4%。?5%。的条件下进行耐盐性筛选，以未导入外 源DNA的受体作为对照，进行水稻生长的耐盐性和产量品质性状的筛选鉴定，筛选生长正 常的单株，收获〇 3代种子； (6) 将收获的D3代种子在盐池盐度为4%。?5%。的条件下进行耐盐性筛选，以未导入外 源DNA的受体作为对照，进行水稻生长的耐盐性和产量品质性状的筛选鉴定，筛选生长正 常的单株，收获比代种子； (7) 在盐池盐度为5%。的条件下进行多代筛选，直至D6代植株基本稳定； (8) 同时，培育出与双8S/海湘4号C815S杂交获得Fjf植株； (9) 将收获的D6代株系的种子与获得的F i代单株种子分别在盐分为2%。和4%。、6%。不 同梯度的江苏盐城滩涂盐地中进行田间试种，以未导入外源DNA的受体作为对照，选育出 耐盐性尚、生长好、广量尚的新品种或新品系，； (10) 次年，将新品系或新品种在盐分为3%。_4%。的江苏盐城滩涂盐地中进行50亩"耐 盐水稻高产示范区"中展示，以未导入外源DNA的受体作为对照，进行水稻生长的耐盐性和 产量品质性状的筛选鉴定。
2. 根据权利要求1中所述的一种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法，其特 征在于：通过CTAB法提取盐生植物叶片DNA。
3. 根据权利要求1或2中所述的一种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法， 其特征在于：所述盐生植物为芦苇。
4. 根据权利要求3中所述的一种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法，其特 征在于：所述注射时间为水稻开花后1?3小时。
5. 根据权利要求4中所述的一种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法，其特 征在于：所述芦苇DNA溶液浓度是250?300 y g/ml。
6. 根据权利要求5中所述的一种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法，其特 征在于：向芦苇DNA溶液中加入100?200 y g/ml的非功能运载DNA。
7. 根据上述1至6中所述的方法得到的耐盐水稻新品种或新品系的新的DNA片段，其 特征在于：所述编码序列为序列表1中所示。
【专利摘要】本发明公开一种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法，包括以下步骤：(1)提取芦苇叶片DNA；(2)外源DNA的导入受体水稻；(3)发芽期的盆筛；(4)人工盐池筛选和大田选育；(5)稳定株系在盐滩田间种植。本发明运用花粉管通道技术，将盐生植物的总DNA转移到普通水稻，实现超远缘遗传物质的转移，省略了组织培养过程，避免了植物组织培养过程中可能产生的各种无法预测的不利影响，能同时导入多个基因，达到耐盐植物分子育种的目的。
【IPC分类】C12N15-89, A01H1-06
【公开号】CN104531764
【申请号】CN201410743591
【发明人】林栖凤, 何登骥, 李冠一, 何加太
【申请人】林栖凤, 何登骥, 李冠一, 何加太
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月8日