充分粉碎，得到浆料。过滤所述浆料除去乙醇，进一步冷冻干燥该残 渣，得到生姜根茎有机溶剂干燥粉碎物。
[0084] (制造例2)
[0085] 用切割研磨机粉碎生的生姜根茎，将其制成生姜根茎粗粉碎物。
[0086] (制造例3)
[0087] 将生姜根茎切片，以25?50°C的温度、温风通风3小时进行干燥，得到生姜根茎的 干燥物。用切割研磨机粉碎其成粉状，将其制成生姜根茎通风干燥粉碎物。
[0088] (实施例1)
[0089] 用pH4. 8的0. 1M醋酸钠缓冲液制备来自牛的明胶5质量％溶液。在该溶液中加 入制造例1中制备的生姜根茎有机溶剂干燥粉碎物、制造例2中制备的生姜根茎粗粉碎物、 制造例3中制备的生姜根茎通风干燥粉碎物，相对于来自牛的明胶以质量换算为1/20倍 量，以成为〇. 2w/v%的方式添加含谷胱甘肽的酵母提取物（株式会社兴人社制，Hithion extract YH-15(谷胱甘肽含有率为15%以上）），边以50°C振荡、搅拌边使其反应16h。反 应结束后静置，回收上清得到肽溶液。此外，生姜根茎粗粉碎物换算成干燥重量添加。
[0090] 将得到的肽溶液在下述LC/MS测定条件下分离，对构成寡肽的一部分的含量进行 定量。另外，对于用作原料的来自牛的明胶也与上述同样地测定寡肽的含量。将结果示于 表1。
[0091] 如表1所示，对于来自生姜根茎的酶，即使使用生姜根茎粗粉碎物、生姜根茎通风 干燥粉碎物和生姜根茎有机溶剂干燥粉碎物中任一种的情况，均会生成以X-Hyp-Gly (式 中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基）表示的肽。与生姜根茎粗粉碎物相比，在 使用生姜根茎通风干燥粉碎物、生姜根茎有机溶剂干燥粉碎物的情况下，以上述式表示的 肽的含量显著增高。
[0092] (1)LC/MS 测定条件
[0093] 高效液相色谱：1200Series (Agilent Technologies)，
[0094] 质量分析装置：3200QTRAP(AB Sciex)，
[0095] 分析柱：Allure PFPP 5 y m，4. 6mmi. d. X l5〇mm(RESTEK)，
[0096] 柱温：4(TC，
[0097] 流动相：A液；0. 1%甲酸，B液；100%乙腈，
[0098] 梯度条件：
[0099] 0 ?7. 5 分钟：A 液 100 %，
[0100] 7. 5 ?17. 5 分钟：A 液 100 ?70% ;B 液 0 ?30%，
[0101] 17. 5 ?20 分钟：A 液 70 ?50% ;B 液 3??50%，
[0102] 20 ?31 分钟：A 液 50 % ;B 液 50 %，
[0103] 31. 1 ?36 分钟：A 液 1% ;B 液 99%，
[0104] 36. 1 分钟?45 分钟：A 液 100 %，
[0105] 流速：0. 6mL/min。
[0106] (2)质量分析条件：
[0107] 离子化：ESI，阳极，
[0108] 分析模式：Multiple Reaction Monitoring (MRM)模式，
[0109] 离子喷雾电压：3kV，
[0110] 离子源温度：600°C。
[0111] (实施例2)
[0112] 用pH4. 8的0. 1M醋酸钠缓冲液制备来自牛的明胶5质量％溶液。在该明胶溶液中 加入与制造1同样新制备的生姜根茎有机溶剂干燥粉碎物，相对于来自牛的明胶以质量换 算为 1/20 倍量，进一步分别以成为 0w/v%、0? 001w/v%、0? 005w/v%、0? 02w/v%、0? lw/v% 以及0. 5w/v%的方式添加含谷胱甘肽的酵母提取物，边以50°C振荡、搅拌边使其反应16h。 反应结束后静置，回收上清得到肽溶液。将这些肽溶液在与实施例1同样的LC/MS测定条 件下分离，以及对构成其的寡肽的含量进行定量。将寡肽的含量示于表2。
[0113] 如表2所示，在将生姜根茎有机溶剂干燥粉碎物以相对于明胶为1/20倍量添加的 情况下，如果以成为〇. 02?0. 5w/v%的方式添加含谷胱甘肽的酵母提取物，则肽的生成率 大幅增加。
[0114] (实施例3)
[0115] 通过醋酸钠缓冲液或磷酸钠缓冲液制备pH为4. 0、4. 4、4. 8、5. 2、5. 6、6. 0、6. 4及 6. 8的溶液，在其中溶解实施例1中使用的来自牛的明胶制备成5质量％明胶溶液。在该溶 液中分别加入实施例2中制备的生姜根茎有机溶剂干燥粉碎物，相对于来自牛的明胶以质 量换算为1/20倍量，进一步以成为0. 2w/v%的方式添加含谷胱甘肽的酵母提取物（谷胱甘 肽含有率为15%以上），边以50°C振荡、搅拌边使其反应16h。反应结束后静置，回收上清 得到肽溶液。将这些肽溶液在与实施例1同样的LC/MS测定条件下分离，以及对构成其的 寡肽的含量进行定量。将寡肽的含量示于表3。
[0116] 如表3所示，如果用各肽各自的生成量为最大的pH进行判断，则在pH4. 0?5. 2 的范围以X-Hyp-Gly (式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基）表示的肽的生成 率增加。另一方面，可同时生成的X-Pr〇-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基 酸残基）在PH5. 6?6. 0的范围生成率优异。在用来自生姜根茎的酶进行分解的情况下， 启示了通过调节反应液的PH，可调整获得的胶原肽组合物含有的肽的量。
[0117] (实施例4)
[0118] 使用与制造例1同样新制备的生姜根茎有机溶剂干燥粉碎物，将其添加量变更成 相对于来自牛的明胶以质量换算为1/10倍量，除此之外，与实施例1同样地进行操作，得到 肽溶液。另外，用重组人明胶（株式会社免疫生物研宄所制，Neosilk-human collagen I) 来代替来自牛的明胶，除此之外，与上述同样地进行操作，得到肽溶液。
[0119] 对于这些肽溶液，在与实施例1同样的LC/MS测定条件下分离，对肽溶液含有的寡 肽的一部分的含量进行定量。另外，对于该肽溶液，按照下述测定DPP-4阻碍率和IC 5Q值。 将测定的寡肽的含量与IC5(I值示于表4。将由来自牛的明胶得到的肽组合物的DPP-4阻碍 曲线示于图1，由重组人明胶得到的肽组合物的DPP-4阻碍曲线示于图2。
[0120] 如表4的IC5(I值所示，由重组人明胶得到的肽组合物与由来自牛的明胶得到的肽 组合物相比，DPP-4阻碍活性优异。这意思是例如通过以由蚕得到的重组蛋白质表达体系制 备的"不含有Hyp的重组人胶原"为底物，与以"含有Hyp的来自天然的胶原、明胶"为底物 的情况相比，可制造DPP-4阻碍活性优异的肽组合物。DPP-4阻碍活性的不同来自含有的各 肽相对于DPP-4阻碍活性的IC 5(I值。如前所述，构成胶原的Hyp是在生物合成胶原时通过 脯氨酸羟基化酶对Pro进行羟基化而生成的。在胶原序列-Gly-X-Y-中，X位的Pro几乎没 有被羟基化，但大量Y位的Pro被羟基化。如对寡肽相对于DPP-4阻碍活性的IC 5(I值进行 了评价的表6所示，例如如果将X-Hyp-Gly与X-Pro-Gly进行比较，贝X-Pro-Gly的DPP-4 阻碍活性强。所以推断得到了下述结果：重组人胶原Y位的Pro的羟基化率低，得到的肽组 合物相对于DPP-4阻碍活性的IC 5(I值变低，DPP-4阻碍活性优异。
[0121] 测定方法
[0122] (l)DPP-4阻碍率的测定方法
[0123] 将在50mM的Tris盐酸缓冲液（pH7. 5)中溶解有试样的样品溶液35 y 1、与在50mM 的Tris盐酸缓冲液（pH7. 5)溶解的DPP-4(西格玛公司制，来自猪肾脏；8. 6mU/ml) 15 y 1在 微板孔（NUNC公司制，商品名"237015"）中混合，37°C培育10分钟。
[0124] 在其中添加和混合预先保温在37°C的底物溶液（以10yM在50mM的Tris盐 酸缓冲液（PH7. 5)中溶解有甘氨酰脯氨酸-4-甲基香豆素-7-酰胺（Gly-Pro-MCA)的溶 液）50 y 1，以37 °C使其反应20分钟。
[0125] 用酶标仪型荧光检测器（Corona电气公司制，商品名"SH-9000"）随时间地测定被 DPP-4游离出的7-氨基-4-甲基香豆素（AMC)的荧光强度。此外，测定波长以380nm的激 发波长、460nm的测定波长进行。此外，以使用相同量50mM的Tris盐酸缓冲液（pH7. 5)来 代替样品的样品作为对照，测定荧光强度。
[0126] DPP-4的活性用荧光强度变化量在反应时间中的平均斜率表示，对于DPP-4阻碍 率，以对照为100%，将所述对照减去样品的活性而得的部分作为抑制率（100% )计算出。
[0127] (2) IC5。值的测定方法
[0128] 以上述DPP-4阻碍率的测定方法为基准，由使样品浓度变化而得到的阻碍率