4%。 因此，反应中最高的3-氰基吡啶浓度为0. 8mol/L。
[0079] 实施例8 :基因工程菌株Ε· coli pET28a(+)-NH05降解敌草腈为2, 6-二氯苯甲酰 胺
[0080] 取IOOml实施例4基因工程菌E. coli pET28a(+)-NH05的诱导培养物，在5000? 10000 X g条件下离心5?30min收集菌体，湿菌体重量为I. 26g。然后用50ml磷酸缓冲液 (50?200mM，pH5. 0?8. 0)重悬菌体细胞，即得工程菌的静息细胞重悬液。向重悬液中加 入终浓度0. lmmol/L缓冲液的敌草腈，25°C下条件进行反应，反应时间12h。采用HPLC法检 测反应体系内的敌草腈和2, 6-二氯苯甲酰胺的含量。结果发现反应体系内已无敌草腈残 留，全部转化为2, 6-二氯苯甲酰胺，转化率为100 %，2, 6-二氯苯甲酰胺得率>99 %。
[0081] HPLC检测条件为：高效液相色谱仪（Agilent 110，USA)，紫外（UV)检测器，检测波 长为221nm，色谱柱为Varian PURSHT C18反向色谱柱（4.6_X250mm);甲醇/水（60/40， v/v，IL含60 μ L三氟乙酸）为流动相；流速为0. 5mL/min。
[0082] 实施例9考察反应过程中最适的敌草腈浓度
[0083] 将实施例8中3-氰基吡啶的终浓度分别改为0. 05mmol/L，0. Immol/L，0. 2mmol/ L，0. 3mmol/L和0. 4mmol/L，其他操作同实施例8。结果发现，当敌草腈浓度在0. . 05? 0.2mmol/L范围内，体系中已无敌草腈残留，全部转化为2, 6-二氯苯甲酰胺，转化率为 100%，产物的得率> 99% ;当3-氰基吡啶浓度为0. 3mmol/L和0. 4mmol/L时，体系中底物 的转化率分别仅为69. 8和52. 4%。因此，反应中最高的敌草腈浓度为0. 2mmol/L。
[0084] 实施例10 :活化元件基因对重组腈水合酶NH05功能的影响
[0085] 根据慢生型大豆根瘤菌USDA 110的基因组中假定腈水合酶的核苷酸序列（如SEQ ID NO. 1)设计下游引物ΝΗ05-β -Down，以慢生型大豆根瘤菌USDA 110基因组为模板，PCR 扩增腈水合酶NH05的结构基因，仅包含了 SEQ ID NO. 2所示α亚基、SEQ ID NO. 3所示β 亚基的基因序列。PCR产物采用DNA凝胶回收纯化试剂盒进行回收。
[0086] 上游引物 NH05_Up :5' -ggaattccatatgcagcccatcccatggc-3' ；
[0087] 下游引物ΝΗ05-β -Down(含有Hind III酶切位点）如下所示：
[0088] 下游引物 NH05-β -Down :5' -cccaagctttcacgccaggtccagat-3'。
[0089] PCR反应体系和PCR反应条件：
[0090] PCR扩增体系：
[0091] PrimcrSTAR DNA 聚 25 μ?； NH05-Up ( 10 pmol/μ?) 2.0 μΙ；
[0092] NHOS-p-Down ( lOpmol/μΙ ) 2.0 μ?； 模板DNA (基因组） 2.0 μ?; 加双蒸水至 50 μΙ。
[0093] PCR扩增条件：
[0094] 1)预变性：95°C 2min ;
[0095] 2)变性：95°C 10s ;退火：56°C 15s ;延伸：72°C 15s ;共循环 30 次；
[0096] 3)延伸：72°C IOmin ;
[0097] 4)4。〇保存2.011。
[0098] 将质粒载体pET28a(+)和上述PCR产物经Nel I和Hid III双酶切，两者等量混 合，用T4DNA连接酶16°C连接过夜，得到重组质粒pET28a (+) -NH05- α β (不含活化元件基 因）。然后，将重组质粒转化入感受态Ε. coli BL21(DE3)细胞中。再将转化后的菌液涂布 于含有终浓度100 μ g/ml卡那霉素（Kanamycin，Kan)的LB平板上，经37°C静止培养，挑取 单菌落，由上海生工进行基因序列的测定，从而验证重组质粒pET28a(+)-NH05-a β及重 组菌株的正确性。
[0099] 将基因工程菌Ε. coli pET28a(+)-NH05-a β甘油保藏菌种接于5mL含IOOyg/ mlKan的LB液体培养基中，37°C，200rpm振荡培养10?14h。取2mL培养液转接至IOOmL 含50 μ g/ml Kan的新鲜LB液体培养基中，37 °C，200rpm振荡培养至菌体密度（OD6tltl)达到 〇· 8左右时，加入IPTG至终浓度为0· lmM，18?37°C下诱导12?18h。取IOOml基因工程 菌E.coli pET28a(+)-NH05-a β的诱导培养液，在5000?IOOOOXg条件下离心5?30min 收集菌体，湿菌体重量为11. 8g。然后用50ml磷酸缓冲液（50?200mM，pH5. 0?8. 0)重悬 菌体细胞，即得工程菌的静息细胞重悬液。向重悬液中分别加入终浓度〇. 4mol/L缓冲液的 3_氰基吡啶和0. lmmol/L缓冲液的敌草腈，25°C下条件进行反应，反应时间12h。采用HPLC 法进行检测分析，没有检测到产物烟酰胺和2, 6-二氯苯甲酰胺。据此可以确定，活化元件 基因在重组腈水合酶NH05的表达过程中至关重要，直接决定其在大肠杆菌细胞中的活力。
[0100] 对比例1
[0101] Zhao A. (Appl Biochem Biotechnol, 53, 65-73, 1995)等米用马红球菌 SHB-121 (Rhodococcus equi SHB-121)催化3-氰基卩比啶的水合反应。发现该野生菌生产的 腈水合酶能催化3-氰基吡啶生产烟酰胺，然而该酶不仅催化活力低，而且热稳定性较差。 在40°C条件下，该腈水合酶的稳定性仅为22min。本发明的重组腈水合酶NH05在40°C条件 的半衰期达到了 l〇h。
[0102] 对比例2
[0103] Li B. (Organic Process Research&Development, 15:291_293, 2〇11)等米用大肠 杆菌基因工程菌催化3-氰基吡啶制备烟酰胺，反应体系中最高的底物浓度为40g/L，采用 分批补料策略在5. 5h内可以催化200g/L 3-氰基吡啶完全转化为烟酰胺。本发明中采用基 因工程菌E. coli pET28a(+)-NH05催化3-氰基吡啶制备烟酰胺，最高底物浓度为0. 8mol/ L，而且在Ih内完全转化为烟酰胺，转化率为100%。
【主权项】
1. 一种耐热重组腈水合酶基因，其特征在于所述耐热重组腈水合酶基因由SEQ ID NO. 2所示α亚基、SEQ ID NO. 3所示β亚基和SEQ ID NO. 4所示活化元件依次连接构成。
2. -种由权利要求1所述的耐热重组腈水合酶基因编码的耐热重组腈水合酶。
3. 如权利要求2所述的耐热重组腈水合酶，其特征在于所述耐热重组腈水合酶的氨基 酸序列为SEQ ID NO. 2所示α亚基基因编码的SEQ ID NO. 5所示氨基酸序列、SEQ ID NO. 3 所示β亚基基因编码的SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列和SEQ ID NO. 4所示活化元件基因 编码的SEQ ID NO. 7所示氨基酸序列依次连接构成。
4. 一种由权利要求1所述耐热重组腈水合酶基因构建的重组载体。
5. -种由权利要求4所述耐热重组载体转化得到的重组基因工程菌。
6. -种权利要求2所述耐热重组腈水合酶基因在制备耐热重组腈水合酶中的应用，其 特征在于所述的应用为：在SEQ ID NO. 3所示β亚基基因序列的上游添加 SEQ ID NO. 8所 示的大肠杆菌SD序列和SEQ ID NO. 9所示间隔序列，形成含SD序列和间隔序列的β亚基， 将SEQ ID NO. 2所示α亚基、含SD序列和间隔序列的β亚基和SEQ ID NO. 4所示活化元 件依次连接，合成含有SD序列和间隔序列的耐热重组腈水合酶基因片段，将含有SD序列和 间隔序列的耐热重组腈水合酶基因片段与载体连接，构建含有SD序列和间隔序列的耐热 重组腈水合酶基因片段的重组载体，再将重组载体转化宿主菌，获得的重组基因工程菌诱 导培养，培养液分离获得含耐热重组腈水合酶的菌体细胞。
7. -种权利要求1所述的耐热重组腈水合酶在催化3-氰基吡啶生成烟酰胺中的应用。
8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含耐热重组腈水合酶基因 的重组基因工程经诱导培养后获得的湿菌体为催化剂，以pH5. 0?8. 0的磷酸缓冲液为反 应介质，以3-氰基吡啶为底物，在25°C下进行反应，反应结束后，获得含烟酰胺的反应液， 将反应液分离纯化，获得烟酰胺；所述催化剂的用量以湿菌体的重量计为10?50g/L缓冲 液，所述底物的终浓度为〇. 2?I. Omol/L缓冲液。
9. 一种权利要求1所述的耐热重组腈水合酶在生物降解敌草腈中的应用。
10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含耐热重组腈水合酶基因 的重组基因工程经诱导培养后获得的湿菌体为催化剂，以pH5. 0?8. 0的磷酸缓冲液为反 应介质，以敌草腈为底物，在25°C下进行反应，反应结束后，获得含2, 6-二氯苯甲酰胺的反 应液，将反应液分离纯化，获得2, 6-二氯苯甲酰胺；所述催化剂的用量以湿菌体的重量计 为10?50g/L缓冲液，所述底物的终浓度为0. 05?0. 5mol/L缓冲液。
【专利摘要】本发明公开了一种耐热重组腈水合酶基因、编码酶、载体、工程菌及其在催化腈化合物生成酰胺和生物降解除草剂敌草腈中的应用，本发明实现了源自慢生型大豆根瘤菌USDA？110中假定腈水合酶基因的功能表达，证明了一种腈水合酶的活化元件在表达过程中的关键作用。同时，本发明提供了一种在大肠杆菌内构建腈水合酶基因工程菌的方法，在腈水合酶基因在活化元件的参与下获得具有高表达量和高活性的腈水合酶。
【IPC分类】A62D101-04, C12N15-70, C12N15-60, C12N1-21, C12N9-88, A62D3-02, A62D101-26, C12P17-12
【公开号】CN104561065
【申请号】CN201410843384
【发明人】裴晓林, 王秋岩, 杨立荣, 吴坚平
【申请人】杭州师范大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月30日