一种制备枸杞ace抑制肽的方法
【专利说明】
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技术领域： 本发明属于ACE抑制肽制备方法，特别涉及一种制备枸杞ACE抑制肽的方法。
[0002]
【背景技术】： 血管紧张素转化酶（Angiotensin Converting Enzy me,简称ACE)是使血压升高的一 个关键酶。一方面，它可催化不具有活性的血管紧张素 I转化为具有强烈收缩血管作用的 血管紧张素 II ;另一方面，它能降解具有舒张血管作用的舒缓激肽并导致其失活。因此，通 过抑制ACE的活性就可达到预防和治疗高血压的目的。已知通过对多种来源的蛋白进行蛋 白水解消化可获得ACE抑制肽，该蛋白的来源包括鱼、动物奶蛋白以及植物。多数所描述的 用于从植物蛋白中获得ACE抑制肽的方法在水解之前均包括对所述蛋白进行初步纯化的 步骤,其增加了所述方法的成本和复杂性并因此增加了产品的成本。因此,仍需要从植物材 料中制备ACE抑制剂组合物的改进方法和高特异活性的ACE抑制肽的其它来源。
[0003] 目前，人们已从食品蛋白质中获得了各种功能性肽，如促钙吸收肽、ACE抑制肽、免 疫调节肽等。ACE抑制肽因其无毒副作用的降压功能成为活性肽研究的热点，《食品科技》 2009年第34卷第4期，任清等著《荞麦蛋白的提取及其酶解产物ACE抑制活性的研究》中 提到过类似方法，该文中提出以荞麦粉为原料，采用碱提酸沉法提取荞麦蛋白。通过正交实 验优化了最佳蛋白提取工艺：温度50°C，pH=ll，时间3h，蛋白的提取率可达44. 2%，由碱性 蛋白酶、中性蛋白酶及复合蛋白酶共同水解所获得的产物ACE抑制肽活性可达90. 55%。
[0004] 枸杞是茄目茄科枸杞属（Lycium)的植物，果实称枸杞子，嫩叶称枸杞头，常见种类 为枸杞（Lycium chinense Miller)，主要的药用种类为宁夏枸杞（Lycium barbarum L·)。 宁夏枸杞是宁夏地区的五宝之一，其作为名贵的药材和滋补品，中医很早就有"枸杞养生" 的说法，《本草纲目》中有记载："枸杞，补肾生精，养肝……明目安神，令人长寿。"因其具有 降低血糖、抗脂肪肝作用，并能抗动脉粥样硬化等药食同源的功效，申请人结合现有技术 的研究方法，经过分析对比，建立从枸杞中提取ACE抑制肽的方法并优化实验条件，最终测 得ACE抑制肽的活性。
[0005]
【发明内容】
： 本发明的目的是提供一种制备枸杞ACE抑制肽的方法，即建立从枸杞中提取ACE抑制 肽的方法并优化实验条件，并对其进行ACE抑制肽的活性测定。
[0006] 为达到上述目的，本发明采取以下技术方案： 一种制备枸杞ACE抑制肽的方法，是以枸杞为原料，经研磨成粉加超纯水成枸杞溶液， 进行离心处理后得枸杞粗蛋白，然后加超纯水成枸杞蛋白溶液并加入中性蛋白酶进行酶解 制得枸杞ACE抑制肽，包括以下步骤： 51 :将枸杞研磨成枸杞粉，过80目筛网，并称取枸杞粉于烧杯中，按1:80的质量比加 入超纯水，搅拌至完全溶解，然后用质量体积比为20%的NaOH溶液调节pH至8. 5得枸杞溶 液； 52 :将上述枸杞溶液在40°C条件下水浴搅拌4h后，于4°C，6000r/min条件下离心处 理，取上清液，用lmol/L HCl溶液调解等电点至pH=4. 0,静置； 53 :在4°C，6000r/min条件下离心，弃上清液，取沉淀，并将沉淀冲洗至中性，将沉淀放 置在真空干燥箱中干燥24h制成枸杞粗蛋白； 54 :取上述干燥后的枸杞粗蛋白，按1:20的质量比加入超纯水配置成5%的枸杞蛋白溶 液，然后加入中性蛋白酶，在温度45°C，pH=7条件下连续酶解4h，然后迅速冷却至40°C，调 节pH至枸杞蛋白质等电点pH=4 ; 55 :将上述酶解处理后的枸杞蛋白溶液在4°C，6000r/min条件下离心处理，并取上清 液，即得枸杞ACE抑制肽。
[0007] S6 :用N-(3-[2-呋喃]丙烯酰）-苯基丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸（FAPGG)作为ACE 抑制肽的底物，测定4个时间段肽组分的抑制肽活性。
[0008] 上述加入的中性蛋白酶与枸杞蛋白的质量比为1:50。
[0009] 上述连续酶解过程是每隔Ih取酶解液20ml，于90°C水浴中进行灭酶15min。
[0010] 上述测定枸杞ACE抑制肽的活性是在酶标定量仪中340nm波长条件下，先测出空 白孔、样品孔的初始吸光度，然后在37°C环境下孵育30min后再一次测定吸光度，根据I= (空白吸光度减少值-样品吸光度减少值）/空白吸光度减少值，算出其抑制率。
[0011] 本发明的有益效果：采用本发明的方法制备的枸杞ACE抑制肽活性强，经实验测 定其活性可达99. 03%，能够有效地起到降压作用，可同时发挥出营养和保健两方面的作用， 因此，有望为开发无毒副作用的降压功能新药物提供有效成分。
[0012]
【具体实施方式】： 下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
[0013] 实施例1 将枸杞研磨成粉，过80目筛，称取50g于烧杯，加入400ml超纯水，搅拌至完全溶解得 枸杞溶液；用质量体积比为20%的NaOH溶液调节pH至8. 5,在40°C条件下水浴搅拌4h后， 在4°C，6000r/min条件下离心，取上清液，用lmol/L HCl溶液调解等电点至pH=4. 0,静置； 在4°C，6000r/min条件下离心，弃上清液，取沉淀，并将沉淀冲洗至中性，将沉淀放置在真 空干燥箱中干燥24h制成枸杞粗蛋白；取5g干燥后的枸杞粗蛋白，用超纯水配置成5%的枸 杞蛋白溶液l〇〇g，根据加酶量：枸杞蛋白=1:50的比例加入中性蛋白酶0. lg，在温度45°C， pH=7条件下连续酶解4小时，每隔Ih取酶解液20ml，90°C水浴15min灭酶，迅速冷却至 4(TC，调节pH至枸杞蛋白质等电点pH=4 ;在4-C，6000r/min条件下离心并取上清液即得枸 杞ACE抑制肽。
[0014] 实施例2 将枸杞研磨成粉，过80目筛，称取25g于烧杯，加入200ml超纯水，搅拌至完全溶解得 枸杞溶液；用质量体积比为20%的NaOH溶液调节pH至8. 5,在40°C条件下水浴搅拌4h后， 在4°C，6000r/min条件下离心，取上清液，用lmol/L HCl溶液调解等电点至pH=4. 0,静置； 在4°C，6000r/min条件下离心，弃上清液，取沉淀，并将沉淀冲洗至中性，将沉淀放置在真 空干燥箱中干燥24h制成枸杞粗蛋白；取2. 5g干燥后的枸杞粗蛋白，用超纯水配置成5% 的枸杞蛋白溶液50g，根据加酶量：枸杞蛋白=1:50的比例加入中性蛋白酶0.05g，在温度 45°C，pH=7条件下连续酶解4小时，每隔Ih取酶解液20ml，90°C水浴15min灭酶，迅速冷却 至4(TC，调节pH至枸杞蛋白质等电点pH=4 ;在4?，6000r/min条件下离心并取上清液即得 枸杞ACE抑制肽。
[0015] 实施例3 将枸杞研磨成粉，过80目筛，称取IOOg于烧杯，加入800ml超纯水，搅拌至完全溶解 得枸杞溶液；用质量体积比为20%的NaOH溶液调节pH至8. 5,在40°C条件下水浴搅拌4h 后，在4°C，6000r/min条件下离心，取上清液，用lmol/L HCl溶液调解等电点至pH=4.0,静 置；在4°C，6000r/min条件下离心，弃上清液，取沉淀，并将沉淀冲洗至中性，将沉淀放置在 真空干燥箱中干燥24h制成枸杞粗蛋白；取IOg干燥后的枸杞粗蛋白，用超纯水配置成5% 的枸杞蛋白溶液200g，根据加酶量：枸杞蛋白=1:50的比例加入中性蛋白酶0. 2g，在温度 45°C，pH=7条件下连续酶解4小时，每隔Ih取酶解液20ml，90°C水浴15min灭酶，迅速冷却 至4(TC，调节pH至枸杞蛋白质等电点pH=4 ;在4?，6000r/min条件下离心并取上清液即得 枸杞ACE抑制肽。
[0016] 测定采用上述方法制备的枸杞ACE抑制肽的活性，在酶标定量仪中340nm波长条 件下，先测出空白孔、样品孔的初始吸光度，然后在37°C环境下孵育30min后再一次测定 吸光度，根据I=(空白吸光度减少值-样品吸光度减少值）/空白吸光度减少值，算出其抑 制率。其中，枸杞ACE抑制肽的活性测定受到时间，底物浓度和加酶量三个因素的影响，用 N-(3-[2-呋喃]丙烯酰）-苯基丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸（FAPGG)作为ACE抑制肽的底物， 对此选用L9 (33)正交设计表对上述时间，底物浓度和加酶量三个因素进行正交实验，建立 从枸杞中提取ACE抑制肽的方法并优化实验条件，各因素及水平的设计见表1 : 表I L9 (33)正交实验因素水平
【主权项】
1. 一种制备枸杞ACE抑制肽的方法，其特征在于：以枸杞为原料，经研磨成粉加超纯水 成枸杞溶液，进行离心处理后得枸杞粗蛋白，然后加超纯水成枸杞蛋白溶液并加入中性蛋 白酶进行酶解制得枸杞ACE抑制肽，包括以下步骤： 51 :将枸杞研磨成枸杞粉，过80目筛网，并称取枸杞粉于烧杯中，按1:80的质量比加 入超纯水，搅拌至完全溶解，然后用质量体积比为20%的NaOH溶液调节pH至8. 5得枸杞溶 液； 52 :将上述枸杞溶液在40°C条件下水浴搅拌4h后，于4°C，6000r/min条件下离心处 理，取上清液，用lmol/L HCl溶液调解等电点至pH=4. 0,静置； 53 :在4°C，6000r/min条件下离心，弃上清液，取沉淀，并将沉淀冲洗至中性，将沉淀放 置在真空干燥箱中干燥24h制成枸杞粗蛋白； 54 :取上述干燥后的枸杞粗蛋白，按1:20的质量比加入超纯水配置成5%的枸杞蛋白溶 液，然后加入中性蛋白酶，在温度45°C，pH=7条件下连续酶解4h，然后迅速冷却至40°C，调 节pH至枸杞蛋白质等电点pH=4 ; 55 :将上述酶解处理后的枸杞蛋白溶液在4°C，6000r/min条件下离心处理，并取上清 液，即得枸杞ACE抑制肽； 56 :用N-(3-[2-呋喃]丙烯酰）-苯基丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸（FAPGG)作为ACE抑 制肽的底物，测定4个时间段肽组分的抑制肽活性。
2. 根据权利要求1所述的一种制备枸杞ACE抑制肽的方法，其特征在于：所述加入的 中性蛋白酶与枸杞蛋白的质量比为1:50。
3. 根据权利要求1所述的一种制备枸杞ACE抑制肽的方法，其特征在于：所述连续酶 解过程是每隔Ih取酶解液20ml，于90°C水浴中进行灭酶15min。
4. 根据权利要求1所述的一种制备枸杞ACE抑制肽的方法，其特征在于：所述测定枸 杞ACE抑制肽的活性是在酶标定量仪中340nm波长条件下，先测出空白孔、样品孔的初始吸 光度，然后在37°C环境下孵育30min后再一次测定吸光度，根据1=(空白吸光度减少值-样 品吸光度减少值）/空白吸光度减少值，算出其抑制率。
【专利摘要】本发明公开一种制备枸杞ACE抑制肽的方法，其是以枸杞为原料，经研磨成粉加超纯水成枸杞溶液，进行离心处理后得枸杞粗蛋白，然后加超纯水成枸杞蛋白溶液并加入中性蛋白酶进行酶解制得枸杞ACE抑制肽，并优化实验条件及对其进行ACE抑制肽的活性测定。采用本发明的方法制备的枸杞ACE抑制肽活性强，经实验测定其活性可达99.03%，能够有效地起到降压作用，可同时发挥出营养和保健两方面的作用，因此，有望为开发无毒副作用的降压功能新药物提供有效成分。
【IPC分类】C12P21-06
【公开号】CN104561205
【申请号】CN201410824684
【发明人】杨建军, 陈琨, 赵俊香
【申请人】宁夏医科大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月27日