一种梅毒螺旋体荧光pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及荧光PCR检测试剂盒领域，更具体涉及梅毒螺旋体荧光PCR检测试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 梅毒螺旋体（Treponema Pallidum，TP)是引起梅毒疾病的一种病原体，其可经血 液传播。近年来发病呈逐年递增趋势，根据其传播途径可分为后天获得性梅毒和先天性梅 毒。根据其病程和临床表现又可将后天获得性梅毒分为包含一期、二期的早期梅毒和三期 晚期梅毒，选择好的检测方法有利于早期梅毒的诊断和治疗。对于早期梅毒的诊断则值得 关注，因部分病例的临床症状不典型，抗体出现时间较晚，常规实验室检测方法的特异性、 灵敏度均低，势必会带来一些样本的漏检。如何及时、准确地诊断出早期梅毒，对于梅毒的 防治具有重要意义。
[0003] 目前梅毒螺旋体的实验室诊断方法主要有快速血浆反应素试验（RPR)、甲苯胺红 快速反应素试验（TRUST)、梅毒螺旋体ELISA试验（EUSA)、梅毒螺旋体血凝试验（TPHA)和 梅毒螺旋体颗粒凝集试验（TPPA)等，RPR和TRUST检测非特异性的抗心磷脂抗体，特异性和 灵敏度都比较差；梅毒螺旋体ELISA试验（ELISA)、梅毒螺旋体血凝试验（TPHA)和梅毒螺 旋体颗粒凝集试验（TPPA)等虽然在特异性和灵敏度方面具有优势，但是无法区分既往感 染和当前感染，不利于临床的诊断及治疗。近年来，分子生物学技术渐渐显现了其在检测上 的优势，目前认为PCR技术是检测TP DNA最佳方法。荧光PCR技术是基于传统PCR技术并 结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏，更特异，更精确的核酸检测技术。检测结果准确， 重复性高，能动态反应患者治疗前、后病原体动态变化及与临床的关系，且整个过程中避免 了传统PCR需后处理的问题，减少了污染。大量研宄表明用PCR技术检测TP DNA的阳性率 远高于其他检测技术，是当今用于TP感染诊断最常用的有力工具，且能更好的应用于TP致 病机理的研宄之中。
[0004] 结合国内情况，在临床梅毒螺旋体感染的实验诊断中，实时荧光PCR技术凭借着 快速、敏感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越性，目前已有多家荧光PCR诊断试剂盒 在临床TP感染诊断中常规使用，但是缺乏完善的质控体系，还需要进一步完善和提高技术 水平，使此类产品更加满足临床准确诊断的需要。运用PCR技术进行检测主要涉及到两个 方面，核酸的提取和核酸的扩增检测。
[0005] 目前国内临床上主要采用煮沸法对梅毒螺旋体的核酸进行提取：先将分泌物样本 浓缩、洗涤，再加裂解液，煮沸，高速离心，取上清为模板。对于浓缩这一步，不同厂家的浓缩 效果不一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到，看得到沉淀的是因为将病原体与蛋白都浓 缩了，这样，导致后面加入裂解液时很难充分混匀；无法看到沉淀的，则使操作者无法确定 吸弃上清时会不会吹打到病原体核酸。
[0006] 临床上检测TP-DNA的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR的技术及其改进，实 时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置 的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集 检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映 PCR的每个循环的扩增水平，试验 结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点（即Ct值） 以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或 标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值（即定量检 测）。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭 基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效 应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切 断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发 出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈 现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性 结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐 取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。
[0007] 国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测TP-DNA的试剂盒应用于临床 检测中，这些试剂盒所提供的TP-DNA提取方法主要是煮沸法。因此，其核酸提取过程较复 杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本 中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢 失导致样本定量偏低；同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤，容易造成气溶胶污 染。此外，这些试剂盒中的荧光定量PCR技术定量检测TP-DNA的引物、探针序列的选择同 样也会影响最终检测的特异性和灵敏度。
[0008] 正因为现有技术中的核酸的提取和核酸的扩增检测步骤的缺陷使得现有技术中 的TP-DNA检测灵敏度不高，约在500?lOOOcopies/ml左右。因此，本领域需要解决现有梅 毒螺旋体荧光定量PCR检测试剂盒的缺陷，提供一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高、 检测范围宽的梅毒螺旋体荧光定量PCR检测试剂盒。
【发明内容】
[0009] 因此，本发明提供一种梅毒螺旋体荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括核 酸释放剂和含用于靶核苷酸检测的引物、探针序列的PCR反应液，所述核酸释放剂包括 0.01?0.5臟〇1/1的莎梵婷、50?200臟〇1/1的氯化钾、质量百分含量为0.01%?2%的 十二烷基磺酸钠和体积百分含量为0. 05%?1%的乙醇。本发明中，所述核酸释放剂的溶 剂例如选自TE缓冲液、无菌水和无菌生理盐水。
[0010] 在一种【具体实施方式】中，所述用于靶核苷酸检测的引物序列为，
[0011] 上游引物：5 ' -GACTGACCCAAGCGTTACTAAGATG-3 '，
[0012] 下游引物：5' -CCCTCGACTGCTTCAAACTTAATC-3'。
[0013] 所述用于靶核苷酸检测的探针序列为5' -CCCCGTCCTCTCCCAAATCCTGA-3'。
[0014] 本发明提供的梅毒螺旋体荧光PCR检测试剂盒操作快速、方法简便、检测灵敏度 高、检测范围宽。应用该试剂盒可以对皮损处渗液、生殖道分泌物等未知样本中的TP-DNA 进行快速检测，为诊断TP感染提供可靠的实验依据。
[0015] 优选地，所述试剂盒中还包括内标及在所述PCR反应液中还包含有内标的引物探 针序列，内标序列为：5' -TAGGCAGTTCCCACGGACCCTTAGACGGCAITTAITTAACGTACGAAGAAACATGT CCCCTTGTGGCTATTATTCAAAGTGGAGAAACAGGGATCGA-3 '，
[0016] 内标的上游引物序列为：5' -ACCCTTAGACGGCATTTATT-3'，
[0017] 内标的下游引物序列为：5' -GTTTCTCCACTTTGAATAA-3'，
[0018] 内标的探针序列为：5' -AACGTACGAAGAAACATGTCCCCTTG-3'。
[0019] 本发明中的试剂盒设置了阳性内对照（即内标），因此有效地监控了假阴性。
[0020] 在一种【具体实施方式】中，所述试剂盒中还包括TP定量参考品，所述TP定量参考 品包括A、B、C、D四个浓度的TP强阳性质粒溶液，溶液A中强阳性质粒的浓度为1. 00? 5. 00E+07copies/ml，溶液B中强阳性质粒的浓度为1. 00?5. 00E+06copies/ml，溶液C中 强阳性质粒的浓度为1. 00?5. 00E+05C〇pieS/ml，溶液D中强阳性质粒的浓度为1. 00? 5. 00E+04C〇pieS/ml。TP定量参考品的设置使得本发明所述梅毒螺旋体荧光PCR检测试剂 盒在做定性检测的同时还能做定量检测。
[0021] 在另一种【具体实施方式】中，所述试剂盒中还包括预防PCR产物污染的酶混合液， 所述酶混合液中包括耐热DNA聚合酶IU/ μ 1?5U/ μ 1和尿嘧啶DNA糖基化酶0. 05U/ μ 1?0. 2U/ μ 1 ;且在所述PCR反应液中还包含dUTP。酶混合液的设置使得本发明的试剂 盒对梅毒螺旋体的检测能更为准确。
【具体实施方式】
[0022] 本发明通过以下实施例详细说明，但下述实施例并不用于限定本发明的保护范 围。
[0023] 实施例1
[0024] 本实施例提供本发明所述的一种梅毒螺旋体荧光定量PCR检测试剂盒。所述试剂 盒中包括如下独立包装的组分：
[0025] ①核酸释放剂：莎梵婷（surfactin) 0· 01?0· 5mmol/L，氯化钾（KCl) 50? 200臟〇1/1，十二烷基磺酸钠（505)0.01%?2%(质量百分含量），乙醇0