了增加心氨基酸生产菌的心氨基酸产量，本发明人作了广泛地研究，找到了适 合于进行改良的基因，并构建了相应的构建物。
[0038] 因此，本发明提供了一种构建物，所述构建物包括；谷氨醜胺酶孔aS的编码基因 的表达盒。所述的表达盒具备基因表达所需的所有元件（包括启动子、编码DNAW及终止 子等），从而可完整地表达出相应的蛋白。
[0039] 通常，所述的构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述 的构建物。所述的表达载体通常还含有复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟 知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。该些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成 技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，W指导 mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
[0040] 此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，W提供用于选择转化的 宿主细胞的表型性状，如原核细胞培养用的氨予青霉素、安普霉素、卡那霉素抗性。
[0041] 包含上述的适当的多核巧酸序列W及适当启动子或者控制序列的载体，可W用于 转化适当的宿主。在本发明的方法中，所述的宿主是心氨基酸生产菌。
[0042] 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行，例如磯酸巧 共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。作为一种优选的方式，可用电 转化的方法进行。
[0043] 本发明还涉及用于生产心氨基酸的试剂盒，所述试剂盒中包括；重组的k氨基酸 生产菌，其中谷氨醜胺酶YbaS高表达或高活性。所述的重组细胞或细胞被置于适当的容器 中。
[0044] 作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还包括用于后续化学反应生产谷脫甘 肤的其它化学成分，包括但不限于：半脫氨酸、甘氨酸、谷氨酸或其盐（如轴盐）、无机盐和 ATP ;较佳地，所述的无机盐包括：走水氯化镇，己醜磯酸二裡盐。
[0045] 作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还包括使用说明书，说明各种化学试剂 或表达载体或细胞或细胞裂解产物的浓度、用法用量。
[0046] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，该些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第H版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0047] 实施例1、构建pTrc-ybaS质粒
[0048] (1) W ybaS-F/ybaS-R 为引物，MG1655 (CGSC6300)(购自 Coli Genetic Stock Center)基因组为模板，PCR扩增ybaS ORF片段，约化b ;
[0049] ybaS-F ;5, GCGGTCTCCATGTTAGATGCAAACAAATTACAG3,（SEQ ID N0:1);
[0050] ybaS-R ;5' GCCTCGAGTCAGCCCTTAAACACGTTATAGC3'（SEQ ID N0:2);
[0051] (2)ybaS ORF片段利用BsalAhoI酶切，插入到pTr地is2B载体（获自中科院上海 植物生理生态研究所）的化olAhoI位点，构建的质粒命名为pTrc-y油S，质粒图谱如图2。 构建好的pTrc-ybaS片段可利用EcoRV酶切验证，结果见图1。
[0052] 实施例2、pTrc-ybaS转入k赖氨酸生产菌株（MG1655/pDCkan/pDCtet)测试
[0053] (l)MG1655/pDCkan/pDCtet 如下构建：将 pDCteUUS20120107882Al)和 pDCkan化S20120107882A1)转入到 MG1655(购自 Coli Genetic Stock Center)中。之间， 将 pTrc-ybaS 质粒转入到 MG1655/pDCkan/pDCtet 感受态细胞中，得到 MG1655/pDCkan/ pDCtet/pTrc-ybaS ;
[0054] (2)分别从 MG1655/pDCkan/pDCtet (对照）、MG1655/pDCkan/pDCtet/pTrc-ybaS 平 板上挑取单菌落，接种于4ml含四环霉素（15μg/ml)和/或卡纳霉素（50μg/ml)和或氨 予霉素（lOOy g/ml)LB试管中，37°C，200巧m培养约lOh ;
[00巧](3) W 10%接种量将菌液转接于50ml发酵培养基中，同时添加终浓度为0.1 mM的 IPTG进行诱导；摇瓶发酵4她后，对菌浓（ODe。。）进行测定，同时发酵液1200化pm条件下离 也lOmin，对上清中的赖氨酸含量进行HPLC测定，结果见表2。
[0056] 发酵培养基配方如表1。
[0057] 表 1
[0058]
【主权项】
1. 一种生产L-氨基酸产量的方法，其特征在于，所述方法包括：在L-氨基酸生产菌中 提高谷氨酰胺酶YbaS的表达或活性；培养该菌株，从而生产L-氨基酸。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的L-氨基酸包括：L-赖氨酸，L-色氨 酸，L-苏氨酸。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括： (a) 提供一种重组质粒，所述重组质粒中包含一重组表达盒，该重组表达盒含有：谷氨 酰胺酶YbaS编码基因；和 (b) 将（a)的重组质粒转化L-氨基酸生产菌，从而提高谷氨酰胺酶YbaS的表达或活 性； (c) 培养（b)菌株，从而生产L-氨基酸。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的L-氨基酸是L-赖氨酸，L-赖氨酸生 产菌是大肠杆菌；较佳地，其是包含pDCtet质粒和pDCkan质粒的大肠杆菌；或 所述的L-氨基酸是L-色氨酸，L-色氨酸生产菌是CIBTS2 ;或 所述的L-氨基酸是L-苏氨酸，L-苏氨酸生产菌是包含ppc、aspA、pntAB、Pthr、thrA* 基因的大肠杆菌。
5. 如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述的L-氨基酸生产菌是MG1655。
6. 谷氨酰胺酶YbaS的用途，其特征在于，用于生产L-氨基酸。
7. 如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的L-氨基酸包括：L-赖氨酸，L-色氨 酸，L-苏氨酸。
8. -种重组的L-氨基酸生产菌，其特征在于，所述的L-氨基酸生产菌中谷氨酰胺酶 YbaS高表达或高活性。
9. 一种用于生产L-氨基酸的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括权利要求8所 述的重组的L-氨基酸生产菌。
10. 如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括： L-氨基酸生产菌的培养基；或 表达诱导剂。
【专利摘要】本发明涉及一种L-氨基酸生产方法。本发明首次揭示一种通过在L-氨基酸生产菌中增加谷氨酰胺酶YbaS的表达或活性，提高L-氨基酸(如L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸)产量的方法。
【IPC分类】C12P13-08, C12N1-21, C12N15-70, C12P13-22
【公开号】CN104630300
【申请号】CN201310566206
【发明人】杨晟, 孙兵兵, 杨俊杰, 蒋宇
【申请人】中国科学院上海生命科学研究院, 上海工业生物技术研发中心
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2013年11月13日