型的。引入的启动子可以是与宿主异源或同源的。
[0147] 在一个实施方案中，将萜烯合酶（AN1594)变为单萜合酶。合酶可以是但不限 于，（+)_ 柠檬烯合酶（AF514287,区：47-1867,来自柠檬（Citrus limon))、（AY055214，区： 48-1889;藿香（Agastache rugosa)) 梓檬稀合酶（DQ195275;区：1_1905,北美云 杉）、（AF006193,区：73-1986 ;北美冷杉（Abies grandis))、（MHC4SLSP，区：29-1828 ;留兰 香（Mentha spicata))、γ-萜品烯合酶（AF514286,区：30-1832,来自柠檬）、（BAD27258， 区166-1803,来自温州蜜柑）、（BAD27259,区166-1803,来自温州蜜柑）；萜品油烯合酶 (ΑΥ906866,区：10-1887 ;花旗松（Pseudotsuga menziesii)) ;β-水芹烯合酶（AF139205， 区：34-1926 ;北美冷杉）；桉油醇合酶（希腊鼠尾草（S. fruticosa)SfCinSl，DQ785793)。 在一个实施方案中，将萜烯合酶（AN1594)变为单萜合酶。合酶可以是但不限于，（+)-柠 檬烯合酶（AF514287,区：47-1867,柠檬）、（AY055214,区：48-1889 ;藿香）、（AAG01140， 荆芥（Schizonepeta tenuifolia)) 梓檬稀合酶（DQ195275;区：1_1905,北美云杉 (Picea sitchensis) )、（AF006193,区：73-1986 ;北美冷杉）、（MHC4SLSP，区：29-1828 ; 留兰香）、（AAG01140,荆芥）、（ABI21837,大麻（Cannabis sativa))、（AAG31438,白苏 (Perilla frutescens))、（AAS47694,挪威云杉）；γ-?品稀合酶（AF514286,区：30_1832， 柠檬）、（BAD27258,区 166-1803,温州蜜柑）、（BAD27259,区 166-1803,温州蜜柑）；β-水 芹烯合酶（AF139205,区：34-1926 ;北美冷杉）；1，8_桉油醇合酶（AAU01970,拟南芥 (Arabidopsis thaliaha))、（BAD91045,温州蜜柑）、（ABP88782, Nicotiana suaveolens)、 (AAC26016,鼠尾草（Salvia officinalis))、（希腊鼠尾草（Salvia fruticosa)SfCinSl， DQ785793) ;β-蒎烯合酶（AAB71085,北美冷杉）、（AAK58723,黄花蒿）、（AAM53945,柠 檬）、（BAD27260,温州蜜柑）、（AAS47692,挪威云杉）；α -蒎烯合酶（ΑΒΙ21838,大麻）、 (CAD57092,欧洲草莓（Fragaria vesca))、（ΑΑΡ72020,北美云杉）、（ΑΑ061225,火炬松 (Pinus taeda))、（AA061228,火炬松）；α -爾品醇合酶（ACC66282,洋玉兰（Magnolia grandiflora))、（AA061227,火炬松）、（ACF24767,檀香（Santalum album))、（AAS79351，葡 萄（Vitis vinifera))、（AAS79352,葡萄）、（AAL59230,玉米（Zea mays))、（ABR09292,玉 米）、（AAX07267,花旗松）；萜品油烯合酶（AY906866,区：10-1887;花旗松）、（AAV63792， 罗勒（Ocimum baslilcum))、（AAF61454,北美冷杉）；E)-b-罗勒烯合酶（AA042614,金鱼草 (Antirrhinum majus))、（NP_189209,拟南芥）、（AAN65379,拟南芥）、（BAD91046,温州蜜 柑）、（AAT86042,百脉根（Lotus japonicus))、（ABY65110,棉豆（Phaseolus Iunatus));月 桂烯合酶（AAB71084,北美冷杉）、（AA041727,金鱼草）、（AA041726,金鱼草）、（AAG09310， 拟南芥）、（AAX69064，普通番前（Lycopersicon esculentum))、（AAV63791，罗勒）、 (AAF76186,白苏）、（AAS47696,挪威云杉）、（CAC41012, Quercus ilex) ; (+)-(3S)_ 芳樟醇 合酶（ABR24418,金鱼草）、（AA085533,拟南芥）、（AAC49395,仙女扇（Clarkia brewerii))、 (CAD57081，草霉（Fragaria ananassa))、（CAD57106,草霉）、（EU596453,亚洲栽培稻（Oryza sativa)) ;(-)-(3R)-芳樟醇合酶（AAF13357,黄花蒿）、（AAF13356,黄花蒿）、（ABB73045， 薰衣草（Lavandula angustivolia))、（AAX69063，普通番前）、（AAL99381，朽1 檬薄荷 (Mentha citrata))、（AAV63789,罗勒）、（AAS47693,挪威云杉）；香叶醇合酶（CAD29734， 细毛棒（Cinnamomum tenuipilum))、（AAR11765,罗勒）、（AAY88965,朽1 檬紫苏（Perilla citriodora))、(ABB30218,白苏）；莰烯合酶（AAB70707,北美冷杉）；蔚醇合酶（AAV63790， 罗勒）；（+) -3-蒈烯合酶（AA073863,挪威云杉）、（AAM89254,狭长叶鼠尾草（Salvia stenophylla)) ;(+)-桧稀合酶（AAC26018，鼠尾草）、（ABH07678，Salvia pornifera); (+)_冰片基合酶（AAC26017,鼠尾草）或以上任何的同源物。优选单萜合酶是γ-萜品烯 合酶。
[0148] 萜烯合酶的载体可包含编码用于萜烯合酶的纯化或检测的标签的核酸。所述标签 可以是但不限于，His-6标签、c-myc表位、血凝素（HA)标签、FLAG表位、Str印-TAGII、谷胱 甘肽-S-转移酶（GST)、生物素标签、绿色荧光蛋白（GFP)或黄色荧光蛋白（YFP)。
[0149] 在另一个实施方案中，其中萜烯合酶（AN1594)被单萜合酶取代的构建体/菌株 伴随有其中GGPP-合酶（AN1592)被GPP合酶或具有合适的GPP副活性的合酶取代的构建 体。GPP合酶可以是但不限于：(AF513111 ;北美冷杉）、(AF513112,北美冷杉）、(AY534686， 金鱼草）、（AY534687;金鱼草）、（Y17376;拟南芥）、（AE016877, Locus AP11092;蜡样 芽胞杆菌（Bacillus cereus) ;ATCC 14579)、（AJ243739;甜授（Citrus sinensis))、 (AY534745 ;仙女扇）、（AY953508 ;Ips pini)、（DQ286930 ;普通番茄）、（AF182828 ;胡椒薄 荷（Mentha X piperita)、（AF182827;胡椒薄荷）、（MP1249453;胡椒薄荷）、（PZE431697， Locus CAD24425 ;Paracoccus zeaxanthinifaciens)、（AY866498 ;库洛胡黄连（Picrorhiza kurrooa))、（AY351862 ;葡萄）和（AF203881，Locus AAF12843 ;运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis))〇
[0150] 在一个实施方案中，将萜烯合酶（AN1594)变为另一二萜合酶例如紫杉二烯合酶 (GI : 1354138,短叶红豆杉（Taxus brevifolia))、（GI : 156106768,曼地亚红豆杉（Taxus X media))、（GI :71796850,南方红豆杉（Taxus wallichiana var.mairei))、（GI :83596264， 东北红豆杉（Taxus cuspidate));赤霉素合酶（GI :6009475,藤仓镰刀菌（Fusarium fujikuroi (藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi))) ;fusicoccadiene 合酶；贝壳杉稀合 酶（GI :239750080,丹参（Salvia miltiorrhiza))、（GI :226531621，玉米）；Gasbene 合酶 (GI :606417,蓖麻（Ricinus communis));松香二稀合酶或任何上述的同源物。
[0151] 在一个实施方案中，将萜烯合酶（AN1594)变为倍半萜合酶例如红没药烯合酶 (AAC24192,北美冷杉）、（NP_193064,拟南芥）、（NP_193066,拟南芥）、（AAX07266,花旗 松）；紫穗槐-4,11-二烯合酶（CAB94691，黄花蒿）、（AAF61439,黄花蒿）、（AAF98444,黄 花蒿）；杜松稀合酶（AAA93064,树棉（Gossypium arboreum));杜松稀合酶（AAA93065， 树棉）、（CAA65289,树棉）、（AAC12784,陆地棉（Gossypium hirsutum))、（AAF74977,陆地 棉）、（AAV63787,罗勒）；法呢烯合酶（ABX83201，甜瓜（Cucumis melo))、（AAB95209,胡 椒薄荷）、（AAS47697,挪威云杉）、（AAX07265,花旗松）；（E)-b-石竹烯合酶（AA085539， 拟南芥）；(E)-b-石竹烯合酶（AAL79181，黄花蒿）、（AAV36464,蒺藜苜蓿（Medicago truncatula))、（EU596454,亚洲栽培稻）、（ABJ16553,亚洲栽培稻）、（ABY79206,玉米）、 (ABY79209，二倍体玉米（Zea diploperennis))、（ABY79210,委委特南戈类玉米（Zea m.huehuetenangensis))、 （ABY79211，大合草（Zea luxurians))、 （ABY79212，玉米）、 (ABY79213,玉米）、（ABY79214,多年生玉米（Zea perennis))或任何以上的同源物。
[0152] 在另一个实施方案中，其中萜烯合酶（AN1594)被倍半萜合酶取代的构建体/菌株 伴随有其中GGPP-合酶（AN1592)被FPP合酶或具有合适的FPP副活性的合酶取代的构建 体。
[0153] 如本文中所使用的，术语"同一性"是指两个氨基酸序列之间从相应基因编码的第 一个氨基酸至最后一个氨基酸彼此相互比较的总体同一性。用于本发明目的，同一性优选 借助已知的计算机程序使用标准算法确定。这样的程序的实例是NCBI BLAST、BLASTp (已 知蛋白序列、氨基酸的比较）、BLASTn (核酸序列比较）、BLASTx (翻译的核酸序列与已知蛋 白序列的比较）。
[0154] 在这方面，术语"萜烯生物合成基因"意指编码萜烯环化酶/合酶的基因和编码在 萜烯生产和/或修饰中必需的/必不可少的蛋白的基因。
[0155] HMG-CoA还原酶是类异戊二烯前体生物合成中的限速酶，因此对萜烯的合成是必 不可少的。因此，编码该还原酶的基因，即编码SEQ ID N0:46或与SEQ ID N0:46(AN1593) 具有至少90 %、优选至少95 %、97 %或甚至98 %程度的同一性的序列的基因，也是必不可 少的。所有或任何簇基因都可以被取代或截短。此外，任何簇基因都可以移除。进行这些 修饰主要是为了增加所需萜烯化合物的生产。
[0156] 充足的前体分子合成关键性地影响所需代谢物的得率。增加生物合成基因的量而 不激活上游的前体合成将不影响产物的得率。当前体途径也被激活时，可能获得靶代谢物 的最佳生产水平。
[0157] 当启动子的功能导致转录时，两个DNA序列是操作性连接的。操作性连接是这样 的连接：其中将一个序列以使得该序列在调节序列的影响或控制下表达的方式连接到一个 或多个调节序列。
[0158] 在这方面簇基因的调节区在宿主生物中天然存在。转录控制区与编码区天然关 联。这些调节区在转录因子的影响或控制下。例如，转录因子AN1599的DNA结合结构域识 别生物合成簇区域（SEQ ID NO :43)中的靶基因的启动子区内的各种取向的CGG三联体或 其它序列段，因此激活所述基因的转录。对于各个基因尚未鉴定影响转录因子结合的CGG 三联体或其它序列段。然而，所鉴定的簇内的启动子区对于转录因子AN1599造成的转录激 活是特异性的。SEQ ID NO :43内包含的天然存在的调节区可与表达的转录因子一起使用 以促进簇内ORF的转录。调节区可包含各种元件，例如启动子、增强子、阻遏子或调节转录 或翻译的其它序列。调节区相对于宿主生物可为异源的（外源）或同源的（内源）。本文 所述簇基因 （SEQ ID NO :43)的调节区相对于所述基因的编码区为内源的以及天然存在的。
[0159] 用于本文所述转录因子AN1599的过表达的启动子是同源的但非天然存在的。启 动子与编码序列操作性连接。用于转录因子的过表达的启动子也可为异源的。如本文所使 用的，术语"异源启动子"和"异源控制区"指天然与特定核酸通常不关联的启动子和其它 控制区，或是来自并非宿主的生物体的启动子和其它控制区。本文所述过表达AN1599的真 菌菌株还包含天然与AN1599的编码区关联的天然调节区。AN1599转录因子通过其天然调 节区而上调的机制是未知的。AN1599通过其天然存在的调节区的激活引起的本文所述基因 簇的激活在本发明实施方案内。
[0160] 在生物合成基因簇中，酶/蛋白编码区之间的调节区包括启动子、终止子和各种 调节因子能够连接的区域。本文中可互换使用的术语"DNA调节序列"、"控制元件"和"调节 元件"指在宿主细胞中提供和/或调节编码序列的表达和/或编码多肽的生产的转录和翻 译控制序列，例如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、终止子、蛋白降解信号等。在一个实施 方案中调节区为以SEQ ID NO :43或与所述SEQ ID NO :43具有至少40%、优选至少50%、 60 %、70 %、80 %或甚至90 %程度的同一性而无编码合成蛋白的部分的序列为特征的那些。
[0161] 使用转录因子用于生产单萜类化合物、优选γ-萜品烯、柠檬烯、伞花烃或桉油 醇，亦是本发明的实施方案。
[0162] -个实施方案是构巢曲霉FGSC A4、A1155或A772用于使用本文描述和在实验部 分针对FGSC A4所说明的方法生产萜烯的用途。
[0163] 本发明通过下列非限制性实施例说明。然而，应理解的是，以上的说明书和实施例 中给出的实施方案仅用于说明目的，并且在本发明的范围内的各种变化和改进是可能的。 实施例
[0164] 实施例1.鉴定构巢曲霉中的二萜簇。
[0165] 按照Bromann等人（2012)所述鉴定选择的簇。从构巢曲霉FGSC A4基因组搜 索具有InterPro结构域IPR008949 "萜类化合物合酶"和IPR008930 "萜类化合物环化 酶"的基因。为了寻找具有用于次级代谢的正调节